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Gerar um modelo de câncer de mama metastático murino ortotópico e realizando a mastectomia Radical murino

Published: November 29, 2018 doi: 10.3791/57849
Automatic Translation
1, 1, 2,3,4,5, 1,6,7,8,9,10
1Breast Surgery, Department of Surgical Oncology, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, 2Holy Cross Hospital Michael and Dianne Bienes Comprehensive Cancer Center, 3Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 4Department of Surgery, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Surgery, Nova Southeastern University School of Medicine, 6Department of Surgery, University at Buffalo Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, 7Department of Breast Surgery and Oncology, Tokyo Medical University, 8Department of Surgery, Yokohama City University, 9Department of Surgery, Niigata University Graduate School of Medical and Dental Sciences, 10Department of Surgery, Fukushima Medical University

Summary

Apresentamos um modelo de câncer de mama murino ortotópico e modelo de mastectomia radical com tecnologia de bioluminescência para quantificar a carga do tumor para imitar a progressão do câncer de mama humano.

Abstract

Modelos de rato in vivo para avaliar a progressão do câncer de mama são essenciais para pesquisa do câncer, incluindo o desenvolvimentos de drogas pré-clínicos. No entanto, a maioria dos detalhes práticos e técnicos é comumente omitida em artigos publicados e que, portanto, torna difícil reproduzir os modelos, particularmente quando envolve técnicas cirúrgicas. Tecnologia de bioluminescência permite para a avaliação de pequenas quantidades de células de câncer, mesmo quando um tumor não é palpável. Utilizando as células cancerosas do luciferase-expressando, estabelecemos uma técnica de inoculação ortotópico de cancro da mama com uma taxa elevada de tumorigênese. Metástase pulmonar é avaliada utilizando uma técnica ex vivo . Nós, então, estabelecer um modelo de mastectomia com uma taxa baixa de recorrência local para avaliar a carga de tumor metastático. Aqui, descrevemos, em pormenor, as técnicas cirúrgicas de implantação ortotópico e mastectomia por câncer de mama, com uma taxa elevada de tumorigênese e taxas de recidiva local baixo, respectivamente, para melhorar a eficiência de modelo de câncer de mama.

Introduction

Modelos animais desempenham um papel chave na investigação do cancro. Quando uma hipótese é comprovada in vitro, devem ser testado in vivo para avaliar a sua relevância clínica. Metástase e progressão de câncer muitas vezes melhor capturados por modelos animais em comparação com modelos in vitro, e é essencial para testar uma nova droga em um modelo animal, como um estudo pré-clínicos para desenvolvimento de drogas1,2. No entanto, os detalhes técnicos das experiências com animais muitas vezes não são bem descritos em artigos publicados, tornando-se desafiador para reproduzir o modelo com sucesso. Com efeito, os autores que criaram estes modelos de inoculação e mastectomia ortotópico passaram longos e rigorosos processos de tentativa e erro. A taxa de sucesso de tumorigênese após inoculação de células de câncer é um dos fatores-chave para determinar o sucesso e a eficiência de um animal estudo3. A linha de celular e o número de células para inocular, local de inoculação e a tensão dos ratos são fatores importantes. É sabido que existem enormes variações nos resultados das experiências com animais devido às diferenças individuais, em comparação com técnicas in vitro. Portanto, usar um modelo bem estabelecido com uma norma técnica é importante para obter resultados estáveis, para melhorar a eficiência das experiências com animais e para evitar resultados enganosos.

Este documento fornece técnicas bem estabelecidas4 para gerar modelos de rato mama câncer ortotópico e mastectomia. Os objectivos destes métodos são 1) para imitar a progressão do câncer de mama humano e cursos de tratamento e 2) para conduzir experimentos in vivo com maior eficiência e maiores taxas de sucesso em comparação com outra inoculação de câncer de mama ou técnicas de mastectomia. Em ortotópico inoculação de células de câncer, para imitar a progressão do câncer de mama humano, nós escolhemos a almofada de gordura mamária #2 como um site de inoculação, que está localizado no peito. Na maioria dos estudos, células de câncer de mama são inoculadas subcutaneamente5. Esta técnica não requer cirurgia e, assim, é simples e direta. No entanto, o microambiente subcutâneo é bastante diferente do microambiente da glândula mamária, o que resulta na progressão do câncer diferentes e perfis molecular até6,7. Alguns estudos utilizam a glândula mamária #4, que está localizada no abdômen, como um local de inoculação6. No entanto, uma vez que as glândulas mamárias #4 estão localizadas no abdômen, o padrão mais comum de metástase é Carcinomatose peritoneal7, que ocorre com menos de 10% do câncer de mama metastático8. Câncer de mama, gerado pela técnica apresentada aqui, na glândula mamária #2, metastatiza para o pulmão, que é um do mais comum da mama câncer metastático sites9.

Com esta técnica, o objetivo é também alcançar uma maior taxa de tumorigênese com variabilidade de tamanho de tumor mínima em comparação com outras técnicas de inoculação de câncer de mama. Para isso, células cancerosas, suspendidas em uma mistura gelatinosa da proteína são inoculadas sob visão direta através de uma incisão da parede torácica anterior mediana. Esta técnica produz uma taxa alta de tumorigênese com menor variabilidade no tamanho do tumor e a forma em comparação com injeção subcutânea ou não-cirúrgicos, como relatado anteriormente3,7.

Também apresentamos uma técnica de mastectomia radical de rato em que o tumor de mama ortotópico é ressecado com os tecidos circundantes e linfonodos axilares. Na prática clínica, o padrão de atendimento para pacientes de câncer de mama sem doença metástase é mastectomia10,11. Antes de uma mastectomia, metástase linfonodal axilar é pesquisado por biópsia de linfonodo sentinela e imagens. Se não há nenhuma evidência de metástase linfonodal axilar, o paciente é tratado então com uma mastectomia total ou parcial, em que a ressecção linfonodal axilar é omitida. Mastectomia total é uma técnica de ressecção em bloco, o câncer de mama com o tecido do peito inteiro enquanto mastectomia parcial é a ressecção de câncer de mama, com uma margem de tecido mamário normal apenas, assim conservando o restante tecido mamário normal na paciente. No entanto, pacientes que preservar o restante tecido mamário normal após uma mastectomia parcial requerem radioterapia pós-operatória, para evitar a recorrência local10. Os pacientes que têm metástase linfonodal axilar realizar mastectomia radical, que remove o câncer de mama com normal todos os seios linfáticos tecido e axilar e invadiram os tecidos pt bloco10,11. No modelo de rato, vigilância por radiação de metástase e/ou pós operatório linfonodal axilar não é praticável ou razoável. Assim, utilizamos a técnica de mastectomia radical para evitar metástase linfonodal axilar ou local.

Inoculação de células de câncer através da veia da cauda é o mais comum pulmão metástase do mouse modelo12, o so-called "metástase experimental". Este modelo é fácil de gerar e não requer cirurgia; no entanto, não imitar a progressão de câncer de mama humano que pode resultar em um comportamento diferente de doença metastática. Para imitar o curso de tratamento de câncer de mama humano onde metástase ocorre frequentemente após a mastectomia, o tumor primário é removido após a inoculação de células de câncer ortotópico. Esta técnica produz menos recorrência local em comparação com ressecção simples de tumor, como relatado anteriormente,13e é útil para novela terapêutica, estudos pré-clínicos e para estudos de pesquisa do câncer de mama metastático. As técnicas descritas aqui são aplicáveis para a maioria dos experimentos de modelo mama câncer ortotópico. No entanto, é importante considerar que a mistura de proteína gelatinoso pode afetar o microambiente e cirurgia pode afetar a resposta de stress/imunológico14. Portanto, pesquisadores estudando o microambiente e/ou a resposta imune/stress devem estar cientes do potencial de fatores de confusão.

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Protocol

Aprovação do Comité de uso e Roswell Park abrangente Cancer Center institucional Animal Care obteve-se para todos os experimentos.

Nota: Nove a doze semanas de idade fêmea BALB/c os ratos são obtidos. 4T1-luc2 células, uma rato adenocarcinoma mamário linhagem celular derivada de camundongos BALB/c que foi projetada para expresso do luciferase, são usadas. Estas células são cultivadas em meio de 1640 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) com 10% de soro fetal bovino (FBS).

1. preparação dos instrumentos

  1. Descongele uma mistura congelada proteína gelatinosa (por exemplo, Matrigel) no gelo em uma capa de cultura de tecidos.
  2. Limpar e autoclave dois conjuntos de instrumentos cirúrgicos (microdissection tesoura pinça Adson e um porta-agulha) antes da cirurgia. Prepare 5-0 esterilizado suturas de seda e secar esterilizante (quando seriais cirurgias são planejadas).
  3. Cortar o cabelo no peito médio dos ratos usando um clipper e marcar os ratos para identificação, perfurando o ouvido antes do momento da cirurgia.
  4. Prepare a mesa de procedimento, que pode ser usada imediatamente para a operação.
    1. Espalhar um absorvente e corrigir os cantos com fita, consertar cones de nariz anestesia com fita, coloque esterilizante e desinfetante (Clorexidina, iodo e 75% de etanol), ao lado do espaço de manobra e coloque os ratos em ordem de funcionamento.

2. preparação das pilhas (para 10 ratos)

Nota: As células devem ser inoculadas dentro de 1h após serem soltos do prato para evitar a viabilidade celular diminuída. Especificamente, a suspensão de células deve ser misturada a mistura de proteína gelatinoso dentro de 15min após desanexação das células do prato para manter a sua viabilidade.

  1. Cultura de células 4T1-luc2, uma linhagem de células de adenocarcinoma mamário rato expressando luciferase, na mídia RPMI 1640 com 10% FBS numa incubadora umidificado a 37 ° C em 5% CO2.
  2. Lave as células aderentes 4T1-luc2 em um prato de 10 cm com fosfato salino (PBS) utilizando uma pipeta sorológica 10ml. Adicione 1 mL de tripsina 0,25%, com uma pipeta P1000 e, em seguida, incubar a amostra a 37 ° C por 5 min. Em seguida, adicione 4 mL de mídia de crescimento (RPMI-1640 com 10% FBS) usando um 5ml serológico Pipetar e transferir a suspensão de células para um tubo cônico de 15 mL em uma capa de cultura de tecidos. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 180 x g por 5 min.
  3. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 2 mL de PBS; em seguida, conte as células usando o hemocytometer.
  4. Suspenda a 2 x 106 células 4T1-luc2 40 μL de frio PBS (pH 7,4, 4 ° C) do bairro de cultura de tecidos.
  5. Misture a suspensão de células de 40 μL com 360 μL da mistura gelatinosa da proteína em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL no gelo do capuz de cultura de tecidos.
    Nota: A concentração final é 1 x 10520 μL (1:9 PBS: mistura gelatinosa da proteína). Para o modelo ortotópico (sem mastectomia), 1 x 10420 μL da concentração final foi utilizado, para evitar chegar a critérios de eutanásia (tumor tamanho > 2 cm) dentro de duas semanas.

3. inoculação de células de câncer

  1. Coloque os ratos na câmara de indução de anestesia com fluxo de oxigênio de isoflurano e 0,2 L/min 2-4%, até os ratos respirar calmamente (2 – 3 min).
  2. Segure o mouse e injetar buprenorfina 0,05 mg/kg em seu ombro, por via subcutânea.
  3. Confirme a anestesia adequada pela falta de reação a uma pitada de dedo do pé. Inserir o nariz do rato no orifício da máscara do mouse, que permite que a anestesia inalatória com isoflurano 2-4% e 2 L/min de fluxo de oxigênio ligado a uma unidade de cilindro do carvão vegetal.
  4. Conter os membros do rato utilizando fita de laboratório e esterilizar sua pele usando clorexidina, iodo e 75% de etanol, usando cotonetes.
  5. Faça uma incisão de pele de 5 mm no meio da parede torácica anterior utilizando microdissection estéril tesoura, elevador, o lado direito junto a incisão de pele e retire a pele da parede torácica, usando a tesoura e então, inverta a pele para expor a direita #2 do tecido mamário.
  6. Cuidadosamente, injete 20 μL da suspensão de células de câncer usando uma seringa de insulina 1 mL com agulha 28,5 G para a almofada de gordura sob visão direta através da ferida.
    Nota: A agulha atravessa a ferida, não a pele. Mantenha segura a agulha no bloco de gordura para 5 antes de s para puxá-lo para fora, que permite que o tempo para a mistura de proteína gelatinoso para solidificar.
  7. Feche as incisões na pele por costura, usando suturas não absorvíveis esterilizados 5-0.
  8. Após a cirurgia, devolver os animais para uma gaiola limpa e monitorá-los até que eles se recuperaram e estão movendo-se livremente (depois de ~ 1-2 min). Se um animal não parece estar em boa saúde até 24 horas após cirurgia, administre a buprenorfina (0,2 mg/kg).
  9. Remover as suturas sob anestesia (ver passo 3.1) 7D após a cirurgia.

4. mastectomia

Nota: O momento da mastectomia é muito importante. Se for feito muito cedo, metástase pulmonar não ocorre. Se for feito muito tarde, o tumor primário invadiu vasos sanguíneos, que fazem uma completa ressecção oncológica desafiador. Assim, vários pontos de tempo foram testados para mastectomia determinar a qual ponto de tempo produzido o equilíbrio adequado na espera de metástase antes ressecção tornou-se muito desafiador. Depois de fazê-lo em mais de 50 experimentos de rato, demonstrou-se que a mastectomia em 8 dias após a inoculação de células de câncer (ou quando o tamanho do tumor atinge 5 mm) era o ideal tempo pontos para alcançar o equilíbrio13.

  1. Anestesiar um mouse com 2-4% inalado isoflurano e injetar buprenorfina (consulte as etapas 3.1 e 3.2).
  2. Conter o mouse e esterilizar sua pele (ver passo 3.4).
  3. Faça uma incisão de pele de 5 mm 2 mm à esquerda da cicatriz cirúrgica que foi feita para a inoculação de células de câncer inicial, usando a tesoura microdissection. Estender a incisão em direção a raiz do membro anterior para remover o tumor, a pele incluindo a cicatriz cirúrgica e a lesão em contato com o tumor, bem como a bacia linfonodal axilar em que na maioria das vezes não visível do linfonodo existe no momento do mastect e13. Tenha atenção para não danificar a veia axilar.
  4. Feche os defeitos da pele por costura, usando suturas não absorvíveis esterilizados 5-0 em forma de "Y".
  5. O mesmo que no passo 3.8, retornar o mouse para uma gaiola limpa e monitor até que eles recuperaram.
  6. Remover as suturas sob anestesia (ver passo 3.1) 7 dias após a cirurgia.

5. bioluminescente quantificação do Tumor primário (ortotópico inoculação sem mastectomia) ou metástase pulmonar (modelo de mastectomia)

Nota: Para a quantificação de carga do tumor primário, a bioluminescência é medido 2 x por semana a partir do dia após a inoculação ortotópico. Para a quantificação de metástase pulmonar, a bioluminescência é medido 2 x por semana a partir do dia após a mastectomia.

  1. D-luciferina, dissolva em fosfato salino de Dulbecco (DPBS) a uma concentração final de 15 mg/mL em uma capa de cultura de tecidos. Alíquota-a em luz blindado 1,5 mL microcentrifuge tubos. Armazenar a solução diluída a-80 ° C.
    Nota: Para um mouse de 20 g, 200 µ l de D-luciferina diluído é necessária.
  2. Abra o software de imagem e clique em inicializar.
    Nota: Demora cerca de 15 min para esfriar o dispositivo de carga acoplada (CCD). Quando o CCD atinge a temperatura programada, a cor da barra de temperatura muda de vermelho para verde.
  3. Anestesiar os ratos com 2-4% de isoflurano em uma câmara de indução dedicado antes da imagem latente (ver passo 3.1).
  4. Pese os ratos.
  5. Injete 150 mg/kg D-luciferina intraperitonealmente no ponto do meio do abdômen, usando uma agulha de 28,5 G.
  6. Cabe a cada rato com um cone de nariz dentro do sistema da imagem latente na posição supina (lugar um máximo de cinco ratos ao mesmo tempo). Manter a anestesia no 1-3% de isoflurano (em 100% de oxigênio) através dos cones de nariz durante a imagem latente.
  7. Capture uma imagem a cada 5 min para detectar a bioluminescência de pico por 50 min (ou até a bioluminescência pico confirmado).
    1. Selecione a luminescência como Auto, Binning como meioe o campo de visão como D.
    2. Clique em Acquire para capturar a imagem.
  8. Retornar os ratos para seus cage(s) e monitorá-los até que eles recuperaram (ver passo 3.8).

6. pulmão metástase Tumor fardo quantificação por Ex Vivo Imaging

Nota: Quantificação de metástase pulmonar é aplicável para inoculação ortotópico com e sem modelos de mastectomia. No modelo de mastectomia, ex vivo de imagem ou sobrevivência observação é escolhida, dependendo da finalidade. No modelo de inoculação (sem mastectomia) ortotópico, a maioria dos casos produzir critérios de eutanásia de tamanho de tumor primário (> 2 cm) aproximadamente 21 dias após a inoculação.

  1. Quantificar a lesão metastática pulmonar 21 dias após a inoculação de células de câncer por ex vivo de imagem.
  2. Anestesiar os ratos com 2-4% de isoflurano em uma câmara de indução dedicado (ver passo 3.1).
  3. Pese os ratos.
  4. Injetar 150 mg/kg D-luciferina intraperitonealmente (consulte a etapa 5.6).
  5. Eutanásia em ratos por deslocamento cervical, 15 min após as injeções.
  6. Abrir o abdômen, cortando a pele e peritônio, no meio do abdômen, usando curvas tesoura de Mayo. Estenda a incisão para tanto à direita como à esquerda. Retire o fígado com pinça até o diafragma é visualizado; em seguida, corte o diafragma.
  7. Usando a tesoura Mayo curva, corte as costelas bilaterais de caudal (12ª costela) para cefálica (1º costelas) para expor os pulmões lançando a parede anterior do tórax.
  8. Identificar o esôfago torácico, que se parece com um cabo conectando os pulmões à espinha, levantando os pulmões usando fórceps e, em seguida, corte o esôfago usando a tesoura microdissection.
  9. Levantar as bilaterais pulmões e coração usando fórceps (aplicação de tração, puxando para baixo, na direção de cefálica à caudal) e, em seguida, cortar a traqueia e grandes vasos para o ápice do pulmão na cefálica, usando tesouras microdissection.
    Nota: Isto permite o isolamento do pulmão e do coração do corpo.
  10. Remova o coração o pulmão usando uma tesoura microdissection.
  11. Colocar os pulmões em uma placa de Petri de 10 cm.
  12. Capturar a imagem de bioluminescência (consulte as etapas 5.7.1 e 5.7.2) 5 min após eutanásia (20 min após a injeção de luciferina).

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Representative Results

A finalidade do modelo de ortotópico é imitar a progressão do câncer humano (ou seja, o crescimento do tumor primário seguido por metástase linfonodal e metástases de pulmão então distante)15. Após a inoculação de células de câncer, a bioluminescência é quantificada regularmente (duas a três vezes / semana) (figura 1A). A bioluminescência nos pulmões é menor do que a lesão primária e mais profundo. A bioluminescência reflete principalmente o fardo do tumor primário em ratos ao vivo3 (figura 1B e 1C). O tamanho do tumor também foi medido pela medição da maxila. O volume do tumor foi estimado utilizando a seguinte equação: volume = (comprimento) x (largura)22 (Figura 1). Quantificação da carga por bioluminescência e medição de maxila tumor apresentou tendências similares nos resultados representativos (figura 1B e 1D); no entanto, às vezes encontramos discrepâncias. Supomos que quantificar a carga do tumor primário utilizando bioluminescência é mais exato comparado a medir o tamanho do tumor por maxila quando o tamanho do tumor é inferior a 1,5 cm. Porque reflete viável as células cancerosas, mesmo que um pequeno número de células pode ser detectado por bioluminescência, e apenas as células cancerosas podem ser detectadas dentro do tumor, não incluindo a infiltração de células do sistema imunológico ou em torno de células do estroma3. Este modelo é útil para avaliar a eficácia da regressão do tumor mediada por drogas anti-câncer e respostas imunes3,7,16. O fardo de tumor das metástases de pulmão também pode ser quantificado por ex vivo de imagem neste modelo (Figura 1E); no entanto, a limitação é que os ratos devem ser sacrificados para quantificar a carga de tumor metastático.

A finalidade do modelo de mastectomia é 1) reproduzir o padrão de tratamento de câncer de mama humano, que é a remoção cirúrgica do tumor primário17e 2) permitem a quantificação serial do fardo tumor metastático em vivo. Este modelo é particularmente útil no estudo do desenvolvimento da terapêutica novela13pré-clínicos. Como publicado anteriormente, um inibidor de Src, AZD0530, que mostrou eficácia no modelo de ratos pré-clínicos, mas falhou em um ensaio clínico para tratamento de câncer de mama, mostrou eficácia na lesão primária utilizando ortotópico inoculação sem mastectomia mas não em metástase pulmonar, utilizando o modelo de mastectomia aqui apresentados. Drogas anti-câncer (por exemplo, antraciclinas) são por vezes usado em seres humanos como terapia neoadjuvante para tratar tumores de mama primário, a grande maioria das drogas é usada como terapia adjuvante onde drogas são dadas após a cirurgia para reduzir o risco de recorrência de tratamento de câncer clinicamente indetectável ou como tratamento paliativo para o câncer metastático de7,1,18. Assim, este modelo de mastectomia foi criado, que imita o processo de tratamento humano11.

Oito dias após a inoculação de células de câncer, o tumor primário é cirurgicamente removido (Figura 2). Para testar qualquer um das eficácias de drogas para lesões metastáticas, deve ser administrada após a mastectomia. Este modelo permite para quantificação de lesão metastática pulmonar, bem como a quantificação da lesão metastática de todo o corpo, enquanto a carga de tumor metastático tem uma bioluminescência detectável utilizando imagens in vivo. A taxa de recidiva local de parede torácica anterior é bastante baixa. Em nossa experiência, a taxa de recidiva local foi menos de 5% nas experiências de mais de 50 ratos. No entanto, se a bioluminescência dia pós-operatório 1 excede 1.00E + 06 fótons (10x maior do que outros indivíduos), há uma grande possibilidade de um tumor residual local13. Se houver células de câncer remanescente presentes, um tumor palpável aparece dentro de duas semanas. Quando há um tumor residual local, a bioluminescência reflete principalmente a recorrência local, ao invés de qualquer lesão metastática. Tumores residuais locais são conhecidos por comportamento muito diferente do que metástases distantes19; assim, esses animais com recidiva local (< 5% na nossa experiência) devem ser excluídas de qualquer análise mais aprofundada. Este modelo de mastectomia também permite o tumor metastático serial fardo monitoramento sem ter de abater os animais. Além disso, essa vigilância bioluminescentes pode ser confirmada por ex vivo quantificação de metástase pulmonar. Em vez de quantificar metástases pulmonares por ex vivo de imagem, tendo assim a eutanásia dos animais, a sobrevivência de ratos após tratamento cirúrgico também pode ser monitorada como um ponto de extremidade clínico traduzível (Figura 2D). Desde que não há nenhuma lesão primária, ratos não podem satisfazer critérios de tumor de eutanásia que geralmente são definidos como um tamanho de tumor de > 2 cm ou ulceração do tumor primário. Neste modelo de mastectomia 4T1, todos os ratos morreram dentro de 60 dias após a inoculação de células de câncer devido a metástase.

Figure 1
Figura 1: visão geral do modelo sem mastectomia ortotópico. (A), este painel mostra um curso a tempo do ortotópico modelo utilizando o modelo de syngeneic 4T1. (B), este painel mostra a bioluminescência de corpo inteiro de um modelo de ortotópico que reflete principalmente o tumor primário. A barra de erro indica o erro padrão da média (n = 10). (C), este painel mostra seriais imagens de bioluminescência de corpo inteiro (do mouse mesmo). Barra de escala indica 1 cm. (D) este painel mostra o tamanho real do tumor do painel B, medido por pinças. A barra de erro indica o erro padrão da média (n = 10). (E), este painel mostra pulmão ex vivo imagens de bioluminescência de 10 ratos de modelo ortotópico (n = 10). Barra de escala indica 1 cm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: visão geral sobre o modelo de mastectomia. (A), este painel mostra um curso a tempo da mastectomia modelo após 4T1 ortotópico implantação syngeneic. Barra de escala indica 1 cm. (B), este painel mostra a bioluminescência de todo o corpo do modelo mastectomia, que reflete principalmente a lesão metastática. A barra de erro indica o erro padrão da média (n = 10). (C), este painel mostra seriais imagens de bioluminescência de corpo inteiro (do mouse mesmo). Utilizando ex vivo de imagem, foi confirmado que os sinais eram de metástase pulmonar, e sem recidiva local foi confirmada por imagens de corpo inteiro após a remoção do pulmão. Barra de escala = 1 cm. (D), este painel mostra a Kaplan-Meier curva de sobrevivência do modelo mastectomia sem qualquer tratamento medicamentoso. Os ratos foram sacrificados quando eles chegaram a critérios de eutanásia com qualquer condição mórbida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Na última década, temos vindo a estabelecer vários modelos de murino de câncer, incluindo mama câncer modelos3,7,13,16,20,21. Anteriormente, temos demonstrado que a inoculação de ortotópico de células de câncer de mama no tecido da glândula mamária, sob visão direta produziu um tumor maior com menor variabilidade de tamanho em relação ao injetar células ao redor do mamilo sem uma incisão cirúrgica7 . Este modelo foi melhorado em cima, utilizando uma suspensão de células em uma mistura da proteína gelatinoso. As formas do tumor gerado pelas células gelatinoso proteína mistura-suspenso foram redondas com menor variabilidade, Considerando que aqueles gerados pelas células PBS-suspenso foram espalhadas na glândula mamária3.

Além disso verificamos que os tumores gerados pelo método de implantação cirúrgica ortotópico aqui apresentado altamente expressaram os genes cujas redes de interação são importantes na progressão de câncer em comparação com aqueles gerados pelo não-cirúrgico ou subcutânea injeção de7. Estes resultados implicam que este modelo imita o câncer de mama humano melhor em comparação com não-cirúrgico ortotópico ou implantação subcutânea7. Também demonstramos que este modelo é apropriado para avaliar a regressão imune-mediada de câncer de mama usando alogênico rejeição3. No entanto, a incisão na pele também pode causar inflamação ao redor do tumor14. Portanto, dependendo a hipótese testada pelo investigador, é importante considerar a inflamação como um possível fator de confusão.

Que não seja o neoadjuvante configuração, a grande maioria das terapias sistêmicas é administrada após o tumor primário da mama é removido cirurgicamente,11. Até à data, a maioria dos estudos pré-clínicos para desenvolvimento de novas drogas avalia resposta droga no tumor primário, mas não em lesões metastáticas1,18. Esta discrepância entre modelos animais e no tratamento humano é importante porque o perfil do gene das Lesões metastáticas é significativamente diferente da lesão primária,22, que tem implicações importantes para a biologia do câncer e tratamento , especialmente na era da terapia-alvo22. Portanto, a eficácia da droga para terapia adjuvante deve ser avaliada nas lesões metastáticas, não apenas no tumor primário. Verificamos que o timing da formação de metástase linfonodal e pulmão após inoculação ortotópico, utilizando o 4T1 mama câncer ortotópico modelo16. Também demonstramos que uma ressecção do tumor primário melhorou a sobrevivência de câncer de mama metastático, utilizando o modelo de mastectomia23. Assim, nós tentamos estabelecer um modelo de mastectomia após o implante de células de câncer ortotópico. No entanto, há muito tempo foi gasto para estabelecer esse modelo de baixa recorrência local. Porque as células cancerosas são injetadas através de incisão cirúrgica, as células cancerosas migram facilmente na ferida. Além disso, as células cancerosas invadem tecidos em contacto directo com o tumor, tais como o músculo de parede circundante no peito e a pele. As células cancerosas também metastatizam para linfonodos axilares, sem formar uma massa axilar visível no momento da mastectomia. Enquanto a remoção do tumor pode ser uma técnica mais fácil, fazendo assim não é traduzível para mastectomia no tratamento do câncer de mama como causa de recidiva local13. Assim, este "modelo de mastectomia radical" foi estabelecido a fim de remover todas as células do cancro da parede torácica anterior e bacia linfonodal axilar, conforme descrito na Figura 2. Confirmamos a metástase pulmonar pela histologia e pulmão ex vivo de imagem, e não havia nenhuma lesão brilhante presente por todo o corpo imagem após a remoção do pulmão. Neste modelo de ortotópico 4T1, células cancerosas eventualmente metastatizam para os pulmões, em todos os casos, no prazo de 21 dias. No entanto, o timing de metástases depende do tamanho do tumor primário; assim, menos o tamanho do tumor primário variabilidade é importante para o monitoramento não somente o tumor primário, mas também o fardo de tumor metastático. Usando a mistura de proteína gelatinoso, variabilidade de tamanho do tumor pode ser minimizada. No entanto, a mistura de proteína gelatinoso também pode afetar o microambiente do tumor. Portanto, o potencial de confusão fatores associados com o uso de mistura gelatinosa de proteína deve ser considerado, dependendo da hipótese do investigador.

Utilizando essas técnicas e as células cancerosas do luciferase-expressando permitam a quantificação de carga do tumor com menos erro de medição, mesmo em tumores não-palpável. Existem dois sistemas de repórter, bioluminescentes e fluorescentes, Visualizar os sinais de animais vivos. Enquanto tem sido relatado que o sinal de bioluminescência e fluorescência pode ser brilhante o suficiente para a quantificação, quando o sinal de destino é muito baixo, o sinal de fundo da fluorescência é mais elevado, que reduz a precisão do ensaio. Em contraste, a bioluminescência é detectada com maior precisão a um sinal de baixo com menos interferência de fundo24. Nesse sentido, a maioria dos investigadores preferem usar sistemas de repórter de bioluminescência em vivo animal experimentos24,25. No entanto, a quantificação de carga do tumor por bioluminescência tem suas limitações. Células do luciferase-expressando brilham quando luciferina atinge as células cancerosas por perfusão cardiovascular26. Se a lesão tem uma área de hipóxia e/ou hipoperfusão, luciferina não é entregue para as células e o valor de bioluminescência poderia, então, ser medido para ser menor do que o peso real do tumor. Na verdade, nós experimentamos quantificação de bioluminescência inadequado quando o tamanho do tumor atingiu mais de 1,5 cm. Supomos que é devido a descrito hipóxica e/ou condição de hypoperfused. Assim, quando o tumor atinge um tamanho palpável, o fardo de tumor é quantificado pela bioluminescência e medição da maxila. Uma limitação importante da quantificação de bioluminescência a considerar é o pelo negro de ratos. Mesmo depois que a pele é removida, há pigmentação na pele27. Enquanto bioluminescência pode ser detectada e quantificada em camundongos com pelo preto, é diminuída e, portanto, é importante comparar os ratos da mesma cor peles uns aos outros a fim de reduzir os efeitos de confundimento de cor de pele na quantificação bioluminescente. O uso de células do luciferase-expressando fornece algumas modalidades exclusivas para estudo. Por exemplo, luciferase secretable pode ser usado para quantificação de carga do tumor por medição de sangue ou urina bioluminescência28. No modelo apresentado aqui, quantificação de carga direta tumor viável de células de câncer em animais vivos com não-secretable do luciferase é simples e direta, que não requer coletando amostras de sangue ou urina.

Semelhante aos modelos que introduziu aqui, a produção de uma forma mais eficiente experiência animal, produzindo uma maior taxa de sucesso de tumorigênese com menor variabilidade é chave para provar as conclusões. No presente modelo, uma vez que um investigador, que aprendeu a técnica, é fácil de alcançar uma taxa de tumorigênese de 100%. Também obtivemos taxas mais elevadas de tumorigênese diferente dos modelos que apresentamos; Além disso, nós estabelecemos um modelo de ortotópico de câncer de cólon utilizando a suspensão de células em uma mistura de proteína gelatinoso, juntamente com a tecnologia de bioluminescência para quantificar o tumor fardo21. Em conclusão, o modelo animal apresentado aqui fornece um modelo murino adequado para conduzir o estudo do câncer.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela concessão de NIH R01CA160688 e Susan G. Komen Fundação investigador iniciou pesquisas concessão (IIR12222224) aos ratos K.T. bioluminescência imagens foram adquiridas pelo recurso compartilhado Imaging translacional recurso compartilhado em Roswell Park Comprehensive Cancer Center, que foi apoiada pelo câncer centro apoio Grant (P30CA01656) e concessão de instrumentação compartilhada (S10OD016450).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro Dissection Scissors Roboz RS-5983 For cancer cell inoculation and masstectomy
Adson Forceps Roboz RS-5233 For cancer cell inoculation and masstectomy
Needle Holder Roboz RS-7830 For cancer cell inoculation and masstectomy
Mayo Roboz RS-6873 For ex vivo
5-0 silk sutures Look 774B For cancer cell inoculation and masstectomy
Dry sterilant (Germinator 500) Braintree Scientific GER 5287-120V For cancer cell inoculation and masstectomy
Clipper Wahl 9908-717 For cancer cell inoculation and masstectomy
Matrigel Corning 354234 For cancer cell inoculation
D-Luciferin, potassium salt GOLD-Bio LUCK-1K For bioluminescence quantification
Roswell Park Memorial Insitute 1640 Gibco 11875093 For cell culture
Fetal Bovine Serub Gibco 10437028 For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200056 For cell culture

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Medicina edição 141 Mouse mama câncer modelo ortotópico syngeneic mastectomia metástase bioluminescência IVIS
Gerar um modelo de câncer de mama metastático murino ortotópico e realizando a mastectomia Radical murino
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Katsuta, E., Oshi, M., Rashid, O. M., Takabe, K. Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy. J. Vis. Exp. (141), e57849, doi:10.3791/57849 (2018).

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