Summary
Vi introducerar en murin ortotop breast cancer och radikal mastektomi modellen med Mareld-teknik för att kvantifiera den tumör bördan för att efterlikna bröstmjölk cancer progression.
Abstract
In vivo musmodeller att bedöma breast cancer progression är väsentliga för cancerforskning, inbegripet prekliniska drog utvecklingen. Majoriteten av de praktiska och tekniska detaljerna utelämnas dock ofta i publicerade manuskript som, därför gör det utmanande för att reproducera modeller, särskilt när det gäller kirurgiska tekniker. Mareld tekniken möjliggör utvärdering av små mängder cancerceller även när en tumör inte är påtaglig. Utnyttja luciferas-uttryckande cancerceller, upprättar vi en breast cancer ortotop inympning teknik med en hög tumourigenesis. Lungmetastaser bedöms utnyttja en ex vivo -teknik. Sedan upprättar vi, en mastektomi modell med en låg lokala Återfallsfrekvensen att bedöma metastaserande tumör bördan. Häri, beskriva vi, i detalj, de kirurgiska teknikerna för ortotop implantation och mastektomi för bröstcancer med höga tumourigenesis och låga lokala återfall priser, respektive, för att förbättra bröst cancer modell.
Introduction
Djurmodeller har en central roll inom cancerforskningen. När en hypotes är bevisat in vitro-, ska det testas i vivo att utvärdera dess kliniska betydelse. Cancer progression och metastasering fångas ofta bättre av djurmodeller jämfört med in vitro-modeller, och det är viktigt att testa ett nytt läkemedel i en djurmodell som en preklinisk studie för drogen utveckling1,2. De tekniska detaljerna av djurförsök är dock ofta inte väl beskrivna i publicerade artiklar, vilket gör det utmanande att återge modellen framgångsrikt. Faktiskt, författarna som etablerad dessa ortotop inympningen och mastektomi modeller gick igenom långa och noggranna processer av trial and error. Andelen framgångsrika uppkomst efter cancer cell inympning är en av de viktigaste faktorerna att avgöra framgång och effektivitet av ett djur studie3. Cellinje och antalet celler att ympa, inokuleringsstället och stammen av mössen är alla viktiga faktorer. Det är väl känt att det finns stora variationer i resultaten av djurförsök på grund av individuella skillnader, jämfört med in vitro-metoder. Därför är det viktigt att få stabila resultat, att förbättra effektiviteten i djurförsök och för att undvika vilseledande resultat med en väletablerad modell med standardiserad teknik.
Detta dokument ger väl etablerade tekniker4 för att generera breast cancer ortotop och mastektomi musmodeller. Syftet med dessa metoder är 1) att efterlikna mänskliga bröstcancer cancer progression och behandlingsomgångar, och 2) att utföra invivo experiment med större effektivitet och högre framgång priser jämfört med andra breast cancer inympningen eller mastektomi tekniker. I ortotop cancer cell Inympning, för att efterlikna bröstmjölk cancer progression, väljer vi den #2 mjölkkörtlar fett pad som en inympning webbplats, som ligger i bröstet. I de flesta studier, inokuleras bröstcancerceller subkutant5. Denna teknik kräver inte kirurgi och således är det enkelt och okomplicerat. Den subkutana närmiljön är dock helt annorlunda från den bröstkörteln mikromiljö, vilket resulterar i olika cancer progression och även molekylära profiler6,7. Vissa studier använda #4 bröstkörteln, som ligger i buken, som en inympning plats6. Då bröstkörtlar #4 finns i buken, är dock den vanligaste metastaserande mönstret peritoneal karcinomatos7, som uppstår med mindre än 10% av metastaserande bröstcancer cancer8. Bröstcancer som genereras av den teknik som presenteras här, i #2 bröstkörteln, metastasizes till lungorna, som är en av de vanligaste breast cancer metastaserande platser9.
Med denna teknik är målet också att uppnå en högre tumourigenesis med minimal tumör storlek variabilitet jämfört med andra breast cancer inympning tekniker. Till gör så, inokuleras cancerceller upphängd i en geléartad protein blandning under direkt uppsikt genom en median främre bröstet vägg snitt. Denna teknik ger en hög tumourigenesis takt med mindre variabilitet i tumörens storlek och form jämfört med subkutan eller icke-kirurgisk injektion, som tidigare rapporterats3,7.
Vi introducerar också en mus radikal mastektomi teknik där ortotop bröst tumören är resected med omgivande vävnad och lymfkörtlar. I den kliniska inställningen är standardbehandling för patienter med bröstcancer utan fjärrmetastaser sjukdom mastektomi10,11. Innan en mastektomi kartläggs armhålan lymfkörtel metastaser av imaging och sentinel lymfkörtelbiopsi. Om det finns inga bevis för armhålan lymfkörtel metastaser, behandlas patienten sedan med en total eller partiell mastektomi, där den armhålan lymfkörtel resektion utelämnas. Total mastektomi är en teknik att resect bröstcancer med hela bröstvävnaden klump, partiell mastektomi är att resect bröstcancer med marginal av omgivande normal bröstvävnad endast, vilket sparar den återstående normal bröstvävnaden hos den patienten. Patienter som bevarar återstår normal bröstvävnad efter en partiell mastektomi kräver dock postoperativ strålbehandling att undvika lokala recidiv10. Patienter som har armhålan lymfkörtel metastaser genomför radikala mastektomi som tar bort bröstcancer med alla normala bröst vävnad och armhålan lymfkörtlarna och invaderade vävnader sv bloc10,11. Musmodell är övervakning av armhålan lymfkörtel metastaser eller postoperativ strålning inte rimligt eller möjligt. Således använder vi radikala mastektomi tekniken för att undvika lokala eller armhålan lymfkörtel metastaser.
Cancer cell inympning via svans venen är den vanligaste lung metastaser mus modell12, den så kallade ”experimental metastas”. Denna modell är lätt att skapa och kräver inte kirurgi; det dock inte härma mänskliga bröstcancer cancer progression vilket kan resultera i olika metastaserande sjukdom beteende. För att härma mänskliga bröstcancer cancer behandling kursen där metastaser uppstår ofta efter mastektomi, avlägsnas den primära tumören efter ortotop cancer cell inympning. Denna teknik producerar mindre lokala återfall jämfört med enkel tumörresektion, som tidigare rapporterats13, och är användbart för nya behandlingar, prekliniska studier, och metastaserande bröstcancer cancer forskningsstudier. De tekniker som beskrivs här gäller för de flesta bröst cancer ortotop modell experiment. Det är dock viktigt att beakta att geléartad protein blandningen kan påverka närmiljön och kirurgi kan påverka stress/immun svar14. Utredarna studera närmiljön eller stress/immunsvaret bör därför medveten om potentiella störande faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Godkännande från Roswell Park omfattande Cancer Center institutionella Animal Care och användning kommittén erhölls för alla experiment.
Obs: Nio till tolv veckor gammal BALB/c honmöss erhålls. 4T1-luc2 celler, en mus mjölkkörtlar adenocarcinom cellinje härrör från BALB/c-möss som har utvecklats till express luciferas, används. Dessa celler odlas i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium med 10% fetalt bovint serum (FBS).
1. beredning av instrument
- Tina en fryst geléartad protein blandning (t.ex. Matrigel) på is i vävnadsodling huva.
- Rengör och autoklav två uppsättningar av kirurgiska instrument (lokalt sax, Adson pincett och en nålförare) före operation. Förbereda steriliserade 5-0 silk suturer och torka steriliserande (när seriell operationer planeras).
- Klipp den mellersta brösthår av möss med en clipper och markera möss för identifiering genom stansning örat före tidpunkten för kirurgi.
-
Förbereda tabellen förfarande, som omedelbart kan användas för operationen.
- Sprida en absorberande pad och fixa i hörnen med tejp, fixa anestesi nose kottar med tejp, sätta steriliserande och desinfektionsmedel (klorhexidin, jod och 75% etanol) bredvid förarutrymme och placera möss i drift ordning.
2. förberedelse av celler (för 10 möss)
Obs: Cellerna bör ympas inom 1 h efter att vara fristående från skålen till undvika minskad cellernas viabilitet. Specifikt, ska cellsuspensionen blandas i geléform protein blandningen inom 15 min efter lossa cellerna från skålen att bibehålla sin livskraft.
- Kultur 4T1-luc2 celler, en mus mjölkkörtlar adenocarcinom cellinje uttrycker luciferas, i RPMI 1640 media med 10% FBS i en fuktad inkubator vid 37 ° C i 5% CO2.
- Tvätta vidhäftande 4T1-luc2 cellerna i en 10-cm skålen med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 10 mL serologiska pipett. Tillsätt 1 mL av 0,25% trypsin med P1000 pipett och, sedan, inkubera provet vid 37 ° C i 5 min. Lägg sedan till 4 mL av tillväxtmassmedia (RPMI-1640 med 10% FBS) med 5 mL serologiska pipett och överföra cellsuspensionen till ett 15 mL koniska rör i vävnadsodling huva. Centrifugera cellsuspension vid 180 x g i 5 min.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 2 mL PBS; sedan räkna cellerna med hjälp av hemocytometer.
- Avbryta 2 x 106 4T1-luc2 celler i 40 μl kallt PBS (pH 7,4, 4 ° C) i vävnadsodling huven.
- Blanda 40-μl cellsuspension med 360 μL av gelatinös protein blandningen i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör på is i vävnadsodling huven.
Obs: Den slutliga koncentrationen är 1 x 105/20 μL (1:9 PBS: gelatinös protein blandning). För ortotop modell (ingen mastektomi) användes 1 x 104/20 μL av slutliga koncentration, att undvika att nå dödshjälp kriterier (tumör storlek > 2 cm) inom två veckor.
3. Cancer Cell inympning
- Sätta mössen i anestesi induktion kammaren med 2-4% isofluran och 0,2 L/min syreflödet tills mössen andas lugnt (2 – 3 min).
- Greppa musen och injicera 0,05 mg/kg buprenorfin i dess axel subkutant.
- Bekräfta adekvat anestesi genom avsaknaden av reaktion på en tå nypa. In musens näsa i hålet av mus masken, som tillåter inhalational anestesi med 2-4% isofluran och 2 L/min syre flöde bifogas en träkol kanister enhet.
- Hindra musens lemmar med lab tejp och sterilisera sin hud med klorhexidin, jod och 75% etanol, med hjälp av bomullspinnar.
- Gör en 5 mm huden snitt mitt i främre bröstväggen utnyttja sterila lokalt sax, lyft högra huden bredvid snittet lossa huden från bröstkorgsväggen med sax och sedan Invertera huden för att exponera rätt #2 mjölkkörtlar fett pad.
- Noggrant injicera 20 μL av cancer cellsuspension med en 1 mL spruta av insulin med en 28,5 G kanyl in i fettet pad under direkt uppsikt genom såret.
Obs: Nålen går genom såret, inte huden. Håll hålla nålen i fettet pad för 5 s före att dra ut den, vilket ger tid för geléartad protein blandningen stelna. - Stäng den hud snitt genom sömnad, med steril 5-0 icke-resorberbara suturer.
- Efter operation, tillbaka djuren till en ren bur och övervaka dem tills de har återhämtat sig och flyttar fritt (efter ~ 1 – 2 min). Om ett djur inte verkar vara vid god hälsa inom 24 timmar efter kirurgi, administrera buprenorfin (0,2 mg/kg).
- Ta bort suturer under anestesi (se steg 3.1) 7 d efter operationen.
4. mastektomi
Obs: Tidpunkten för mastektomi är mycket viktigt. Om det sker för tidigt, uppstår inte lungmetastaser. Om det sker för sent, har den primära tumören invaderat stora blodkärl, vilket gör en komplett onkologiska resektion utmanande. Därför testades flera tidpunkter för mastektomi att avgöra vilken tidpunkt producerade en balans i väntan på metastas innan resektion blev alltför utmanande. Efter detta i över 50 musen experiment, det visades att mastektomi på 8 dagar efter cancer cell inympning (eller när storleken på tumören når 5 mm) var ideal tid punkt att uppnå som balanserar13.
- Söva en mus med 2-4% inhaleras isofluran och injicera buprenorfin (se steg 3.1 och 3.2).
- Hindra musen och sterilisera sin hud (se steg 3,4).
- Gör en 5 mm huden snitt 2 mm till vänster från kirurgiska ärr som gjordes i den första cancer cell Inympning, med lokalt sax. Förlänga snittet mot roten av forelimb att avlägsna tumören, huden inklusive kirurgiska ärr och lesionen kontakt med tumören, liksom armhålan lymfkörtel bassängen där för mesta inga synliga lymfkörtel finns vid tidpunkten för mastect omy13. Se till att inte skada axillär venen.
- Nära defekter huden genom sömnad, med steril 5-0 icke-resorberbara suturer i form av ett ”Y”.
- Samma som steg 3.8, tillbaka musen till en ren bur och övervaka tills de har tillfrisknat.
- Ta bort suturer under anestesi (se steg 3.1) 7 dagar efter operation.
5. självlysande kvantifiering av primärtumör (ortotop inympning utan mastektomi) eller lungmetastaser (mastektomi modell)
Obs: För primärtumör börda kvantifiering är Mareld uppmätta 2 x en vecka från dagen efter ortotop inympningen. För lungcancer metastaser kvantifiering är Mareld uppmätta 2 x en vecka från dagen efter mastektomi.
- Lös upp D-luciferin i Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) till en slutlig koncentration på 15 mg/mL i en vävnadskultur huva. Alikvotens den i ljus-skärmad 1,5 mL mikrocentrifug rör. Lagra den utspädda lösningen vid-80 ° C.
Obs: För en 20 g mus krävs 200 µL utspädda D-luciferin. - Öppna avbildningsprogrammet och klicka på initiera.
Obs: Det tar ca 15 min att kyla kostnad – tillsammans enhet (CCD). När CCD når den inställda temperaturen, ändras färgen på baren temperatur från rött till grönt. - Söva möss med 2-4% isofluran i en dedikerad induktion kammare före imaging (se steg 3.1).
- Väga möss.
- Injicera 150 mg/kg D-luciferin intraperitonealt vid mitten av buken, använder en 28,5 G nål.
- Passa varje mus med en näsa kon inuti bildgivande systemet i ryggläge (plats högst fem möss på samma gång). Underhålla anestesi på 1-3% isofluran (i 100% syre) genom näsan kottarna under imaging.
-
Ta en bild var 5 min för att upptäcka peak Mareld för 50 min (eller upp till den bekräfta peak Marelden).
- Välj luminiscens som Auto, Binning som Mediumoch synfält som D.
- Klicka på Hämta för att fånga bilden.
- Återgå möss till deras cage(s) och övervaka dem tills de har återhämtat sig (se steg 3.8).
6. lung metastaser tumör börda kvantifiering av Ex Vivo Imaging
Obs: Lungan metastaser kvantifiering är tillämplig för ortotop inympningen både med och utan mastektomi modeller. I modellen mastektomi väljs ex vivo imaging eller överlevnad observation, beroende på syftet. I ortotop inympning (utan mastektomi) modellen producera de flesta fall primärtumör storlek dödshjälp kriterier (> 2 cm) ca 21 dagar efter ympning.
- Kvantifiera lung metastatiska lesioner 21 dagar efter cancer cell inympning av ex vivo imaging.
- Söva möss med 2-4% isofluran i en dedikerad induktion kammare (se steg 3.1).
- Väga möss.
- Injicera 150 mg/kg D-luciferin intraperitonealt (se steg 5,6).
- Euthanize möss av cervikal dislokation, 15 min efter injektionerna.
- Öppna buken genom att skära huden och bukhinnan på mitten av buken, med böjda Mayo sax. Förlänga snittet till både höger och vänster. Dra ut levern med pincett tills membranet är visualiseras; sedan skär membranet.
- Med böjda Mayo sax, klippa bilaterala revbenen från caudad (12: e revben) till kraniellt (1st revbensspjäll) att exponera lungorna genom att vrida främre thorax väggen.
- Identifiera bröst matstrupen, som ser ut som en sladd ansluter lungorna till ryggraden, genom att lyfta lungorna med hjälp av pincetten och sedan minska matstrupen med lokalt sax.
- Lyft bilaterala lungor och hjärta använder tången (gäller dragkraft dra ner, i riktning mot cephalad till caudad) och, sedan skär luftstrupen och stora kärl att lungan spetsen på den kraniellt, med lokalt sax.
Obs: Detta tillåter för isolering av lungan och hjärtat från kroppen. - Ta bort hjärtat från lungan med lokalt sax.
- Sätta i lungorna i en 10 cm petriskål.
- Mareld avbildningen (se steg 5.7.1 och 5.7.2) 5 min efter dödshjälp (20 min efter luciferin injektionen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Syftet med ortotop modellen är att efterlikna mänskliga cancer progression (dvs, tillväxten av den primära tumören följt av lymfkörtel metastaser och sedan avlägsna lungmetastaser)15. Efter cancer cell Inympning, Mareld kvantifieras regelbundet (två till tre gånger / vecka) (figur 1A). Mareld i lungorna är djupare och mindre än den primära lesionen. Mareld speglar främst den primära tumör bördan i levande möss3 (figur 1B och 1 C). Tumörstorlek mättes också av bromsok mätning. Tumör volymen uppskattades med hjälp av följande ekvation: volym = (längd) x (bredd)2/2 (figur 1 d). Kvantifiering av tumör bördan av Mareld och bromsok mätning visade liknande trender i de representativa resultat (figur 1B och 1 D); Vi stötte dock ibland avvikelser. Vi antar att kvantifiera den primära tumör bördan utnyttja Mareld är mer exakt jämfört med mätning av tumörens storlek av bromsok när tumör storleken är mindre än 1,5 cm. Eftersom det återspeglar livskraftig kan cancerceller, även ett litet antal celler kan upptäckas av Mareld, och endast cancerceller detekteras inuti tumören, inte inklusive infiltrera immunceller eller omgivande stromaceller3. Denna modell är användbart för att värdera effekten av tumörregression medieras av läkemedel mot cancer och immunsvar3,7,16. Tumör bördan av lungmetastaser kan också kvantifieras av ex vivo imaging i denna modell (figur 1E); begränsning är dock att mössen måste bli euthanized för att kvantifiera metastaserande tumör bördan.
Syftet med mastektomi modellen är att 1) reproducera standarden av behandling av mänskliga bröstcancer, som är kirurgiskt avlägsnande av primärtumör17, och 2) tillåta seriell kvantifiering av metastaserande tumör bördan invivo. Denna modell är särskilt användbart i prekliniska studier av utvecklingen av nya behandlingar13. Som tidigare publicerats, en Src-hämmare, AZD0530, som visade effekt i prekliniska möss modellen men misslyckades i en klinisk prövning för bröstcancerbehandling, visade effekt i den primära lesionen utnyttja ortotop inympning utan mastektomi men inte i lungmetastaser utnyttja mastektomi modellen presenteras här. Även om läkemedel mot cancer (t ex antracykliner) används ibland i människor som neoadjuvant terapi för behandling av primär bröstcancer tumörer, används de allra flesta läkemedel som adjuvant terapi där läkemedel ges efter operationen för att minska risken för återfall av behandling av kliniskt omätbara cancer eller som palliativ behandling av metastaserande cancer1,7,18. Således fastställdes denna mastektomi modell som efterliknar mänsklig behandling process11.
Åtta dagar efter cancer cell Inympning, är den primära tumören opereras bort (figur 2). För att testa någon av de drog efficacies för metastatiska lesioner, ska det ges efter en mastektomi. Denna modell tillåter lung metastaserande lesion kvantifiering, liksom hela kroppen metastaserande lesion kvantifiering, så länge metastaserande tumör bördan har en påvisbar Mareld utnyttja i vivo imaging. Främre bröstet vägg lokala Återfallsfrekvensen är ganska låg. I vår erfarenhet var lokala Återfallsfrekvensen mindre än 5% i över 50 möss experiment. Dock om postoperativ dag 1 Mareld överstiger 1.00E + 06 fotoner (10 x större än andra individer), finns det en stor möjlighet att en lokal kvarvarande tumör13. Om det finns kvarleva cancerceller närvarande, visas en palpabel tumör inom två veckor. När det finns en lokal kvarvarande tumör, speglar Mareld främst det lokala återfall snarare än någon metastatiska lesioner. Lokala kvarvarande tumörer är kända för att bete sig mycket annorlunda än fjärrmetastaser19; således dessa djur med lokala recidiv (< 5% enligt vår erfarenhet) bör undantas från vidare analys. Denna mastektomi modell tillåter också seriell metastaserande tumör börda övervakning utan att behöva avliva djuren. Dessutom kan sådana självlysande övervakning bekräftas genom ex vivo lung metastaser kvantifiering. Istället för att kvantifiera lungmetastaser av ex vivo imaging, således behöva avliva djuren, möss överlevnad efter kirurgisk behandling kan också övervakas som översättningsbara kliniska effektmått (figur 2D). Eftersom det finns ingen primär lesion, möss inte kan uppfylla dödshjälp tumör kriterier som definieras i allmänhet som en tumörstorlek > 2 cm eller sårbildning i den primära tumören. I denna 4T1 mastektomi modell dog alla möss inom 60 dagar efter cancer cell inympning på grund av metastaser.
Figur 1: översikt över ortotop modell utan mastektomi. (A) denna panel visar en tidsförloppet för ortotop modell utnyttja 4T1 syngena modellen. (B) denna panel visar hela kroppen mareld i en ortotop modell som speglar främst den primära tumören. Felstapel anger standardavvikelsen för medelvärdet (n = 10). (C), denna panel visar seriell bilder av hela kroppen Mareld (i samma mus). Skalstapeln anger 1 cm. (D) i denna panel visas den faktiska tumörstorlek panel B, mäts med skjutmått. Felstapel anger standardavvikelsen för medelvärdet (n = 10). (E), denna panel visar lungan ex vivo Mareld bilder av 10 ortotop möss (n = 10). Skalstapeln anger 1 cm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: översikt av mastektomi modellen. (A) denna panel visar en tidsförloppet för mastektomi modell efter 4T1 ortotop syngena implantation. Skalstapeln anger 1 cm. (B) denna panel visar hela kroppen mareld i mastektomi modellen, vilket främst speglar metastaserande lesion. Felstapel anger standardavvikelsen för medelvärdet (n = 10). (C), denna panel visar seriell bilder av hela kroppen Mareld (i samma mus). Utnyttja ex vivo imaging, bekräftades det att signalerna kom från lungmetastaser, och inga lokala återfall bekräftades av hela kroppen imaging efter lung borttagning. Skalstapeln = 1 cm. (D), denna panel visar den Kaplan-Meier överlevnad kurva av mastektomi modell utan någon läkemedelsbehandling. Möss var euthanized när de nått dödshjälp kriterier med något sjukligt tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under det senaste årtiondet, har vi skapa flera murina cancer modeller, inklusive breast cancer modeller3,7,13,16,20,21. Tidigare har visat vi att breast cancer cell ortotop inympningen i bröstkörteln vävnaden under direkt uppsikt producerade en större tumör med mindre storlek variabilitet jämfört injicera celler runt bröstvårtan utan ett kirurgiskt snitt7 . Denna modell har förbättrats genom att utnyttja en cellsuspension i en geléartad protein blandning. Former av tumören genereras av gelatinös protein blandning-suspenderade celler var runda med mindre variabilitet, medan de som genereras av PBS-suspenderade celler var spridda i bröstkörteln3.
Vi ytterligare verifierade att de tumörer som genereras av metoden kirurgiska ortotop implantation presenteras här mycket uttryckte de gener vars interaktion nätverk är viktiga i cancer progression jämfört med dem som skapas av icke-kirurgisk eller subkutan injektionen7. Dessa fynd antyder att denna modell härmar mänskliga bröstcancer bättre jämfört med icke-kirurgiska ortotop eller subkutan implantation7. Vi har också visat att denna modell är lämplig att utvärdera immunmedierade regression av bröstcancer med prövningar avvisande3. Dock kan huden snitt också orsaka inflammation runt tumören14. Därför beroende på hypotesen testas av prövaren, är det viktigt att tänka på inflammation som möjligt confounding faktor.
Än den neoadjuvanta inställning, administreras den stora majoriteten av systemiska behandlingar efter primär bröstcancer tumören är kirurgiskt borttagna11. Hittills har utvärdera majoriteten av prekliniska studier för nya läkemedelsutveckling narkotika svar i den primära tumören, men inte i den metastatiska lesioner1,18. Denna diskrepans mellan djurmodeller och human behandling är viktigt eftersom genen profilen för de metastatiska lesionerna är avsevärt skiljer sig från den primära lesionen22, som har viktiga konsekvenser för cancerbiologi och behandling , särskilt i en tid präglad av riktad terapi22. Effekten av läkemedlet för adjuvant behandling bör därför utvärderas i de metastatiska lesionerna, inte bara i den primära tumören. Vi verifierat tidpunkten för metastaser lymfkörtel och lung bildandet efter ortotop Inympning, utnyttja 4T1 breast cancer ortotop model16. Vi har också visat att en resektion av den primära tumören förbättrad överlevnad metastaserande bröstcancer utnyttja den mastektomi modell23. Således, vi försökte etablera en mastektomi modell efter ortotop cancer cell implantation. Dock användes länge för att upprätta denna låga lokala återfall modell. Eftersom cancerceller injiceras genom kirurgiska snitt, migrera cancerceller enkelt in i såret. Dessutom invadera cancerceller vävnader i direkt kontakt med tumören, såsom omgivande bröstet vägg muskel och hud. Cancercellerna också metastasera till lymfkörtlar utan bildar en synlig axillär massa vid tidpunkten för mastektomi. Även att ta bort tumören kan vara en enklare teknik, det är inte översättas till mastektomi i bröstcancerbehandling eftersom det orsakar lokala återfall13. Således fastställdes denna ”radikal mastektomi modell” för att ta bort alla cancerceller från främre bröstväggen och armhålan lymfkörtel basin, som beskrivs i figur 2. Vi bekräftade lungmetastaser av histologi och lungsjukdomar ex vivo imaging, och det fanns ingen lysande lesion som är närvarande genom hela kroppen imaging efter lung borttagning. I denna 4T1 ortotop modell metastaser cancerceller så småningom på lungorna, i alla fall inom 21 dagar. Tidpunkten för metastaser beror emellertid på primärtumör storlek; således mindre primärtumör storlek är variabilitet viktig för övervakning av inte bara den primära tumören men också metastaserande tumör bördan. Genom att använda geléartad protein blandningen, kan tumör storlek variabilitet minimeras. Geléartad protein blandningen kan dock även påverka den tumör mikromiljö. Därför bör potential confounding faktorer associerade med gelatinös protein blandning användning övervägas, beroende på hypotesen om prövaren.
Utnyttja dessa tekniker och luciferas-uttryckande cancerceller möjliggör tumör börda kvantifiering med mindre mätfel, även i icke-palpabla tumörer. Det finns två reporter system, självlysande och fluorescerande, att visualisera signalerna i levande djur. Medan det har rapporterats att signalera av både Mareld och fluorescens kan vara tillräckligt ljust för kvantifiering, när målet signalen är mycket låg, är bakgrunden signalen av fluorescens högre, vilket minskar noggrannheten i analysen. Med större noggrannhet vid en lägre signal med mindre bakgrund störningar24upptäcktes däremot Mareld. Således de flesta utredarna föredrar att använda Mareld reporter system i levande djur experiment24,25. Tumör börda kvantifiering av Mareld har dock sina begränsningar. Luciferas-uttryckande celler glans när luciferin når cancerceller av hjärt perfusion26. Om lesionen har en yta på hypoxi eller hypoperfusion, luciferin levereras inte till cellerna och Mareld värdet kunde, sedan mätas för att vara lägre än den faktiska tumör bördan. Vi har faktiskt upplevt olämpligt Mareld kvantifiering när storleken på tumören nått mer än 1,5 cm. Vi antar att det är på grund av den beskrivna hypoxisk eller hypoperfused tillstånd. När tumören når en påtaglig storlek, kvantifieras således tumör bördan av både Mareld och bromsok mätning. En viktig begränsning av Mareld kvantifiering att överväga är svart päls av möss. Även efter pälsen tas bort, finns det pigmentering på huden27. Medan Mareld kan identifieras och kvantifieras i möss med svart päls, det är minskad och därför är det viktigt att jämföra möss av samma päls färg till varandra för att minska de störande effekterna av päls färg på självlysande kvantifiering. Användningen av luciferas-uttryckande celler ger vissa unika metoder för studien. Secretable luciferas kan exempelvis användas för tumör börda kvantifiering av mäta blod eller urin Mareld28. I den modell som presenteras här, direkt tumör börda kvantifiering av livskraftiga cancerceller i levande djur med icke-secretable luciferas är enkel och okomplicerad, som inte kräver insamling av blod eller urin prov.
Liknar de modeller som introducerade här, produktionen av en mer effektiv djurförsök genom att producera en högre framgång på tumourigenesis med mindre variation är nyckeln till bevisa resultaten. I den nuvarande modellen, när en undersökare har lärt sig tekniken, är det lätt att uppnå en 100% tumourigenesis. Vi har också uppnått tumourigenesis högre än de modeller som vi har infört; Dessutom har vi etablerat en kolon cancer ortotop modell utnyttja cellsuspension i en geléartad protein blandning, tillsammans med Mareld-teknik för att kvantifiera den tumör börda21. Avslutningsvis ger i djurmodell som presenteras här en lämplig murina modell för att genomföra cancer studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NIH grant R01CA160688 och Susan G. Komen Foundation utredare initierat forskning bidrag (IIR12222224) till K.T. möss Mareld bilder förvärvades av delad resurs translationell Imaging delad resurs på Roswell Park Omfattande Cancer Center, som stöddes av Cancer Center Support Grant (P30CA01656) och delade Instrumentation grant (S10OD016450).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissection Scissors | Roboz | RS-5983 | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Adson Forceps | Roboz | RS-5233 | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Needle Holder | Roboz | RS-7830 | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Mayo | Roboz | RS-6873 | For ex vivo |
| 5-0 silk sutures | Look | 774B | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Dry sterilant (Germinator 500) | Braintree Scientific | GER 5287-120V | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Clipper | Wahl | 9908-717 | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Matrigel | Corning | 354234 | For cancer cell inoculation |
| D-Luciferin, potassium salt | GOLD-Bio | LUCK-1K | For bioluminescence quantification |
| Roswell Park Memorial Insitute 1640 | Gibco | 11875093 | For cell culture |
| Fetal Bovine Serub | Gibco | 10437028 | For cell culture |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | For cell culture |
References
- Rashid, O. M., Takabe, K. Animal models for exploring the pharmacokinetics of breast cancer therapies. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 11 (2), 221-230 (2015).
- Schuh, J. C. Trials, tribulations, and trends in tumor modeling in mice. Toxicologic Pathology. 32, 53-66 (2004).
- Katsuta, E., et al. Modified breast cancer model for preclinical immunotherapy studies. Journal of Surgical Research. 204 (2), 467-474 (2016).
- Sidell, D. R., et al. Composite mandibulectomy: a novel animal model. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 146 (6), 932-937 (2012).
- Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Research. 25, 3905-3915 (2005).
- Kocaturk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments. (96), e51967 (2015).
- Rashid, O. M., et al. An improved syngeneic orthotopic murine model of human breast cancer progression. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (3), 501-512 (2014).
- Bertozzi, S., et al. Prevalence, risk factors, and prognosis of peritoneal metastasis from breast cancer. SpringerPlus. 4, 688 (2015).
- Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).
- Valero, M. G., Golshan, M. Management of the Axilla in Early Breast Cancer. Cancer Treatment and Research. 173, 39-52 (2018).
- National Comprehensive Cancer Network. Breast Cancer, NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology. , Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/breast.pdf (2018).
- Versteeg, H. H., et al. Inhibition of tissue factor signaling suppresses tumor growth. Blood. 111 (1), 190-199 (2008).
- Katsuta, E., Rashid, O. M., Takabe, K. Murine breast cancer mastectomy model that predicts patient outcomes for drug development. Journal of Surgical Research. 219, 310-318 (2017).
- Veenhof, A. A., et al. Surgical stress response and postoperative immune function after laparoscopy or open surgery with fast track or standard perioperative care: a randomized trial. Annals of Surgery. 255 (2), 216-221 (2012).
- Wei, S., Siegal, G. P. Surviving at a distant site: The organotropism of metastatic breast cancer. Seminars in Diagnostic Pathology. 35 (2), 108-111 (2018).
- Nagahashi, M., et al. Sphingosine-1-phosphate produced by sphingosine kinase 1 promotes breast cancer progression by stimulating angiogenesis and lymphangiogenesis. Cancer Research. 72 (3), 726-735 (2012).
- Jones, C., Lancaster, R. Evolution of Operative Technique for Mastectomy. Surgical Clinics of North America. 98 (4), 835-844 (2018).
- Rashid, O. M., Maurente, D., Takabe, K. A Systematic Approach to Preclinical Trials in Metastatic Breast Cancer. Chemotherapy (Los Angeles). 5 (3), (2016).
- Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nature Genetics. 33 (1), 49-54 (2003).
- Aoki, H., et al. Murine model of long-term obstructive jaundice. Journal of Surgical Research. 206 (1), 118-125 (2016).
- Terracina, K. P., et al. Development of a metastatic murine colon cancer model. Journal of Surgical Research. 199 (1), 106-114 (2015).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model? Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Rashid, O. M., et al. Resection of the primary tumor improves survival in metastatic breast cancer by reducing overall tumor burden. Surgery. 153 (6), 771-778 (2013).
- Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models. Molecular Imaging. 3 (1), 9-23 (2004).
- Adams, S. T. Jr, Miller, S. C. Beyond D-luciferin: expanding the scope of bioluminescence imaging in vivo. Current Opinion in Chemical Biology. 21, 112-120 (2014).
- Close, D. M., Xu, T., Sayler, G. S., Ripp, S. In vivo bioluminescent imaging (BLI): noninvasive visualization and interrogation of biological processes in living animals. Sensors (Basel). 11 (1), 180-206 (2011).
- Chen, H., Thorne, S. H. Practical Methods for Molecular In Vivo Optical Imaging. Current Protocols in Cytometry. 59 (1224), (2012).
- Wurdinger, T., et al. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes. Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).
- Aoki, H., et al. Host sphingosine kinase 1 worsens pancreatic cancer peritoneal carcinomatosis. Journal of Surgical Research. 205 (2), 510-517 (2016).
