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Artigo de método

Estereotáxica transferência adotiva de citotóxicas células imunes em modelos murino de humanos ortotópico Glioblastoma Multiforme Xenografts

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DOI:

10.3791/57870

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1 de setembro de 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1INSERM, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes, CRCINA, 2Immunotherapy, Graft, Oncology, LabEx IGO, 3Hopital de Nantes, Hotel Dieu

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação e a administração estereotáxica de linfócitos humanos alogênico em camundongos imunodeficientes carregando humana ortotópico de tumores primários. Este estudo fornece um prova de conceito para a viabilidade e a eficácia antitumoral de imunoterapias celulares intrabrain-entregue.

Resumo

Glioblastoma multiforme (GBM), o câncer de cérebro primário mais frequente e agressivo em adultos, é geralmente associada com um prognóstico pobre e escassas eficientes terapias têm sido propostas ao longo da última década. Entre os candidatos promissores para a concepção de novas estratégias terapêuticas, imunoterapias celulares têm sido alvo para eliminar altamente invasivo e células tumorais de quimio-radioresistant, provavelmente envolveram em uma recaída rápida e fatal de câncer. Assim, organismos de alogênico GBM-reativa efetores célula imune, como linfócitos T Vϒ9Vδ2 humanos, nas proximidades do tumor que representa uma oportunidade única para entregar eficiente e altamente concentrado agentes terapêuticos diretamente para o site de malignidades do cérebro. Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação e a administração estereotáxica de linfócitos humanos alogênico em camundongos imunodeficientes carregando humana ortotópico de tumores primários. Este estudo fornece um prova de conceito pré-clínicos para a viabilidade e a eficácia antitumoral destes imunoterapias celulares que dependem de injeções estereotáxica de linfócitos humanos alogênico dentro camas de tumor intrabrain.

Introdução

GBM (quem grau astrocitoma IV), é o câncer de cérebro primário mais frequente e agressivo em adultos. Apesar de tratamentos agressivos que combinam radio-quimioterapia e cirurgia, GBM continua associada com um prognóstico extremamente pobre (sobrevida média de 14,6 meses e um ano-2-mortalidade > 73%)1. Isto evidencia que alguns avanços terapêuticos eficientes foram validados ao longo da última década2. Entre os candidatos para a concepção de estratégias terapêuticas mais eficazes3,4,5, imunoterapias6 são atualmente exploradas para controlar e eliminar altamente invasivo e rádio/quimioterapia-resistente do tumor células, suspeitadas por sua contribuição fundamental para a rápida e fatal tumor recaída7. Vários alvos imunológicos foram identificadas e propostas para imunoterapias, envolvendo natural ou αβ modificado ou linfócitos T de ϒδ como antígenos do tumor GBM específicos ou estresse induzido por moléculas8,9, 10. A possibilidade de administrar efetores de células imunes GBM-reativos selecionados representa uma oportunidade única para entregar quantidades elevadas de linfócitos efetores diretamente no site da malignidade residual. Para oferecer suporte a esta estratégia, nós recentemente demonstraram que modelos baseados em camundongos imunodeficientes carregando ortotópico primários xenografts humanos de GBM fielmente recapitular o desenvolvimento de tumores cerebrais em GBM pacientes9,11. Além disso, estes modelos foram usados para demonstrar a eficiência forte antitumoral de enviaram transferidos linfócitos humanos alogênico de Vϒ9Vδ2T.

Este protocolo descreve as etapas experimentais críticas para alcançar imunoterapias estereotáxica de tumores cerebrais, tais como GBM, com base na transferência adotiva de alogênico linfócitos T. O artigo mostra: (i) a amplificação de linfócitos terapêuticos alogénicos imunes efetoras T, tais como linfócitos humanos Vϒ9Vδ2T; (ii) a preparação destes linfócitos efetores T para injeção; (iii) o processo de administração estereotáxica dentro do cérebro, perto do tumor. Este artigo também fornece insights sobre o comportamento desses efetores celulares após a injeção estereotáxica.

A abordagem terapêutica aqui apresentada baseia-se a injeção de 20 x 106 efetoras células por dose para cada mouse imunodeficientes rolamento-tumor de cérebro. Uma etapa de expansão inicial em vitro é necessária para produzir grandes quantidades de células do sistema imunológico. Portanto, expansões de célula não-específicas são executadas usando a Fitohemaglutinina (PHA-L) e irradiados células alogénicas alimentador: células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de doadores saudáveis e célula B-lymphoblastoid Epstein Barr vírus EBV-transformado linhas (BLCLs), derivado de PBMC por infecção em vitro com cultura EBV-contendo sobrenadante da linha celular sagui B95-8, na presença de 1 µ g/mL ciclosporina-A.

Células imunes efetoras GBM-reativa são comparadas e selecionadas a partir de vitro ensaios9. Estas células efetoras são ativadas e amplificado usando protocolos padrão, de acordo com sua natureza (por exemplo, de linfócitos humanos Vγ9Vδ2 T9 ou humano anti-herpes vírus αβ T linfócitos12) com uma pureza mínima de > 80%, como rotineiramente verificada pela análise cytometric. O procedimento de expansão celular detalhado abaixo aplica-se a vários subconjuntos de linfócitos humanos.

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Protocolo

As procedimento envolvendo animais disciplinas foi realizada segundo as orientações institucionais (acordo #00186.02; Comitê de ética regional de Pays de la Loire [França]). Humano PBMC foram isolada a partir do sangue coletado de doadores saudáveis informados (Etablissement Français du Sang Nantes, França). Todas as etapas são executadas sob condições estéreis.

1. não-específica expansão de linfócitos citotóxicos Effector T

  1. Preparar e irradiar as células alimentador em 35 Gy. Para a estimulação de 2 x 105 - células efetoras de 4 x 105 , prepare-se 10 x 106 PBMCs e 1 x 106 BLCLs de três doadores distintos, saudáveis.
  2. Resuspenda tanto células alimentador e células efetoras em 15 mL de RPMI suplementado com 10% inactivadas pelo calor FCS, 2 mM L-glutamina, penicilina (100 UI/mL), estreptomicina (0,1 µ g/mL) e recombinantes IL-2 300 UI/mL.
  3. Adicionar PHA-L em uma concentração final de 1 µ g/mL, misture cuidadosamente e distribuir 150 µ l de suspensão de célula por bem em placas de 96 poços de fundo U.
  4. Incube a 37 ° C e com 5% CO2 em um ambiente umidificado.
  5. Verificar diariamente a placa até grandes células agrupa formulário dos poços de cultura (~ dia 7).
  6. Transferi as células em um frasco de cultura a 1 x 106 células/mL em meio de cultura fresco.
  7. Determinar o número total de células por contagem (2x por semana) e mantê-las em 1 x 106 células/mL em meio de cultura fresco.
    Nota: As células imunes efetoras devem estar prontas para a administração de terapêutica em um estado de repouso (geralmente 3 semanas após o estímulo inicial de amplificação). A pureza e a reatividade destas células efetoras devem ser verificados antes na vivo injeções (por exemplo, com ensaios em vitro ).

2. preparação de células efetoras pré-operatório

  1. Depois de verificar a contagem de células efetoras, colete as células efetoras em um tubo de 50 mL por centrifugação (300 x g por 5 min).
    Nota: Para compensar qualquer perda, prepare um excesso de células (por exemplo, 50 x 106).
  2. Cuidadosamente, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 15 mL de PBS estéril e centrifugar durante 5 min à 300 x g para executar a lavagem.
  3. Cuidadosa e completamente remover o sobrenadante e em seguida Ressuspender as células em 1 mL de PBS estéril.
  4. Transferi as células ressuspensa em um microtubo de 1,5 mL por centrifugação a 300 x g durante 5 min.
  5. Cuidadosa e completamente remova o sobrenadante pipetando lentamente.
  6. Ressuspender as células em 8 µ l de PBS estéril por rato.
    Nota: Este é um passo crítico.
  7. Medir o volume da suspensão celular usando uma micropipeta. Se necessário, adicionar PBS estéril (20 x 106 células em 15 µ l de PBS por dose) e misturar cuidadosamente.
  8. Verificar, por meio de uma micropipeta, que o volume final por rato é entre 15 e 20 μL (imperativamente < 20 µ l).
  9. Manter as células no gelo até injeção estereotáxica.
    Nota: mais de 3-h momentos não foram testados.

3. estereotáxica injeção

  1. Instalação de equipamento
    1. Montar e calibrar um pequeno quadro estereotáxico animal de acordo com as instruções do fabricante para garantir a precisão das injeções intracranianas (por exemplo, tamanho da seringa, volume desejado e taxa de injeção).
      Nota: A taxa de infusão lenta é recomendada (ou seja, 2-3 µ l/min).
    2. Instale o material em um armário de segurança microbiana (MSC) para manter a esterilidade dos instrumentos e para proteger os ratos de infecções.
      Nota: lugar "blocos isotérmicos" em um banho-maria a 37 ° C. Este sistema limita a hipotermia de ratos durante a cirurgia. Radiante, que são necessárias para o cuidado pós-processual, deve ser usado durante a monitorização contínua da temperatura.
  2. Preparação de animais pré-operatório
    1. Anestesia um rato com uma injeção intraperitoneal de cetamina (10 mg/mL) e xilazina (0,1 mg/mL) em 10 µ l/g de peso do corpo do mouse.
    2. Execute um teste do beliscão do dedo do pé para garantir a completa anestesia e analgesia do animal.
      Nota: Qualquer movimento é uma indicação de analgesia não de profundidade e, se isso ocorrer, mais alguns minutos são necessários antes de repetir a operação.
    3. Uma vez que o mouse é devidamente anestesiado, use a tesoura para remover a pele do local cirúrgico (entre as duas orelhas, até o nariz).
  3. Preparação da pilha pré-operatória
    1. Cuidadosamente, Ressuspender as células com uma pipeta (várias vezes) antes de cada injecção para impedir que qualquer célula aglutinação.
    2. Desenhe cuidadosamente o volume de suspensão de células necessárias (15-20 µ l) para o microseringa 22-G para evitar a aspiração de bolhas.
      Nota: Este passo de carregamento de celular para o microseringa é importante para minimizar as variações no volume injetado. Recarrega pilhas para cada injeção individual entre procedimentos para impedir que qualquer célula aglutinação e garantir um número par de administração de células efetoras na coorte.
    3. Em seguida, coloque a seringa para a bomba de seringa adaptada.
  4. Cuidados processuais
    1. Desinfectar o local cirúrgico com cotonetes embebidos em solução de iodo-povidona 5% pelo menos 3 x.
    2. Coloque uma pomada oftálmica lubrificante nos olhos do rato, para evitar qualquer secagem de córneas.
    3. Posição do mouse anestesiado na armação estereotáxica, num bloco isotérmico quente coberto com um filme plástico estéril para manter a temperatura do rato durante a cirurgia e limitar a taxa de mortalidade.
      Nota: Do mouse nariz e dentes devem ser adequadamente posicionados acima da barra de dente, para assegurar o fluxo respiratório adequado durante o procedimento.
    4. Uma vez que o mouse está posicionado acima da barra de dente, aperte as barras de orelha firmemente sob as orelhas do rato para imobilizar a cabeça.
      Nota: Tenha cuidado para não danificar os tímpanos ou comprometer a respiração.
    5. Fazer uma incisão de 1-2 cm da pele sagital com tesoura estéril, ao longo da parte superior do crânio de anterior posterior para expor o crânio.
    6. Identifica a interseção das suturas coronais e sagitais (Bregma) para servir como pontos de referência para localização estereotáxica antes da injeção (mostrada na Figura 1).
    7. Lugar da micro-seringa acima deste ponto.
    8. Mova a micro-seringa lateral direita 2 mm e 0,5 mm anterior do Bregma.
    9. Usando um microdrill, faça um pequeno furo no crânio com uma broca estéril coordenadas pré-determinadas. Tenha cuidado para permanecer superficial para evitar qualquer lesão traumática do cérebro.
      Nota: No presente protocolo, as células imunes foram injetadas dentro um tumor estabelecido (uma semana após a injeção de células de tumor). A pele deve ser reaberto (scar) e a injeção é executada com as mesmas coordenadas usadas para a implantação de células de tumor (o furo geralmente ainda está presente acima de 2 semanas após a injeção). As coordenadas foram selecionadas para injetar células de tumor e efetoras no parênquima cerebral13,14.
  5. Injeção de células imunes efetoras
    1. Cuidadosamente Introduza a micro-seringa o orifício perfurado e, movendo-se lentamente, encaminhar a agulha 3 mm para baixo na dura-máter e então para trás 0.5 mm até uma profundidade final de 2,5 mm antes de injetar as células efetoras.
    2. Executar a injeção de células efetoras em 2-3 µ l/min e monitorar os ratos ao longo do tempo de injeção.
    3. Uma vez concluída a injeção, retirar a agulha para apenas 1 mm e manter a micro-seringa no lugar por um minuto adicional antes lentamente retirando completamente o microseringa, para evitar qualquer vazamento do local da infusão.
      Nota: Após a remoção do animal do dispositivo estereotáxico, limpe imediatamente o equipamento de injeção para experiências futuras.
  6. Cuidados pós-operatórios e follow-up de rato
    1. Retire o animal do quadro estereotáxico e imediatamente aplicar solução de 5% de iodo-povidona no local da incisão e fechar a pele com uma sutura cirúrgica adequada.
    2. Aplicar o gel de lidocaína 2% diretamente sobre a ferida e administrar 0,15 µ g/g de buprenorfina por injeção subcutânea para analgesia pós-processual.
    3. Lugar de volta o mouse anestesiado para sua jaula sobre uma almofada de aquecimento definida a 37 ° C para manter uma temperatura de corpo do mouse apropriado e evitar qualquer hipotermia.
      Nota: Alojamento separado não é necessário.
    4. Monitorar o mouse até que ele está totalmente recuperado da anestesia e transferi-lo para um quarto de habitação.
      Nota: Até à data, este protocolo é bem suportado como poucas complicações imprevistas ocorreram (< 5% dos ratos injetados).
    5. Diariamente, monitorar os ratos e sacrificá-los quando qualquer declínio saúde são observados sinais (por exemplo, postura encurvada, mobilidade reduzida, prostração ou perda de peso significativa corpo [≥ 15%]).

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Resultados

Este estudo descreve a estratégia de transferência adotiva de células efetoras imune celular dentro do cérebro de camundongos portadores de tumor, baseado em injeções estereotáxica realizadas diretamente dentro da cama do tumor.

Para minimizar qualquer risco de lesão cerebral associada com um volume grande de injeção, a suspensão de células efetoras precisa ser concentrado (20 x 106 células em 15-20 µ l de PBS). Para ...

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Discussão

Uma transferência adotiva de selecionado nativo ou células efetoras imune engenharia representa uma abordagem promissora para tratar eficientemente a tumores, como câncer de cérebro infiltrativa, tendo o cuidado de limitar reatividades contra células não-transformadas15, 16,17,18. No entanto, o sistema nervoso central, que compreende o cérebro, tem um determinado status imune, nomeadamente dev...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecer o pessoal do Hospital Universitário animal instalação (UTE) de Nantes para pecuária e cuidados, o celular e tecidual de imagem facilidade do núcleo da Universidade de Nantes (MicroPICell) para a imagem latente e a facilidade de citometria (Cytocell) de Nantes para sua assistência técnica especializada. Este trabalho foi financiado pelo INSERM, CNRS, Université de Nantes, Institut National du Cancer (INCa #PLBio2014-155), Ligue Nationale contre le Cancer (AO inter-regional 2017) e o consórcio europeu ERA-Net Transcan2 (Immunoglio). A equipe é financiada pelo Fondation pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118). Este trabalho foi realizado no contexto do LabEX IGO e os programas IHU-Cesti, suportado pelo nacional investigação Agência Investissements d'Avenir através dos programas ANR-11-LABX-0016-01 e ANR-10-IBHU-005, respectivamente. O projeto IHU-Cesti também é suportado pelo Nantes Metropole e a região de Pays de la Loire. Os autores agradecer Chirine Rafia para fornecer ajuda em corrigir o manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
PBMCsde 3 doadores saudáveis diferentes
BLCLsde 3 doadores diferentes
Roswell Park Memorial Institute médio (RPMI)Gibco31870-025
FCSDutscherS1810-500
L-glutaminaGibco25030-024
penicilina/estreptomicinaGibco15140-122
IL-2Novartisproleucina
PHA-LSigmaL4144
Quadro estereotáxicoStoelting Co.51600
para quadro estereotáxico   Fornecedor:Stoelting Co.51624
Injetor de Bomba de Microsseringa WPIUMP3-4
NanoFilWPINF34BV-2
Camundongos NSGCharles RiverNSGSSFE07S
CetaminaMerialImalgè ne 1000
XylazineBayerRompur 2%
TesouraWPI201758
FórcepsWPI501215
OmniDrill 115 / 230VWPI503598
Vicryl 4-0EthiconVCP397H
XylocaineAstrazeneca3634461
Adaptador de mouse Seringa

Referências

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