PCR digital para quantificar circulando MicroRNAs no infarto agudo do miocárdio e doença Cardiovascular

Resumo

MicroRNAs circulantes têm mostrado promessa como biomarcadores para doenças cardiovasculares e aguda do miocárdio. Neste estudo, descrevemos um protocolo para extração de miRNA, a transcrição reversa e PCR digital para a quantificação absoluta dos miRNAs no soro de pacientes com doença cardiovascular.

Resumo

Circulação soro microRNAs (miRNAs) mostraram a promessa como biomarcadores para a doença cardiovascular e infarto agudo do miocárdio (iam), sendo liberada a partir das células cardiovasculares para a circulação. Os miRNAs circulantes são altamente estáveis e pode ser quantificados. A expressão quantitativa dos miRNAs específicos pode ser vinculada a patologia e alguns miRNAs mostrar tecido alta e especificidade da doença. Encontrar novos biomarcadores para doenças cardiovasculares é de importância para a pesquisa médica. Muito recentemente, reação em cadeia da polimerase digital (dPCR) foi inventada. dPCR, combinado com sondas fluorescentes de hidrólise, permite uma quantificação absoluta direta específica. dPCR exibe qualidades técnicas superiores, incluindo uma baixa variabilidade, alta linearidade e alta sensibilidade em comparação com a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR). Assim, dPCR é um método mais preciso e reprodutível para quantificar diretamente os miRNAs, particularmente para o uso em grandes multi centro de ensaios clínicos cardiovasculares. Nesta publicação, descrevemos como efetivamente realizar PCR digital a fim de avaliar o número de cópia absoluta em amostras de soro.

Introdução

MiRNAs circulantes foram identificados como marcadores promissoras para uma série de doenças, incluindo doenças cardiovasculares¹. Os miRNAs são pequenos, não-codificantes single-stranded RNA moléculas (aproximadamente 22 nucleotides longas) são envolvidas no Regulamento pós-transcricional através da alteração da tradução do RNA mensageiro e influenciando da expressão do gene², e são liberados na circulação em Estados fisiológicos e patológicos. A expressão quantitativa dos miRNAs específicos pode ser vinculada a patologia, e alguns miRNAs mostram tecido alto e especificidade de doença¹. Em doenças cardiovasculares, os miRNAs tornaram-se candidatos atraentes como biomarcadores novela porque são notavelmente estáveis no soro e pode facilmente ser quantificada com a ajuda da metodologia PCR³. O valor potencial dos miRNAs como biomarcadores para infarto do miocárdio foi avaliado em estudos pequenos, mas uma validação em grandes coortes está faltando². Por exemplo, miR-499 encontra-se altamente expressa no músculo do miocárdio, e isso foi mostrado para aumentar significativamente em um AMI^4,5,6. Além disso, regula programada morte celular (apoptose) e a diferenciação dos cardiomyocytes e, portanto, está envolvida em vários mecanismos seguindo um AMI⁷. Além de alguns pequenos estudos relatando uma superioridade e valor incremental de miRNAs para o diagnóstico da AMI, a superioridade ou igualdade de alta sensibilidade cardíacas troponinas não ainda foi comprovada em estudos em grande escala^{2,5 ,6,8}. Mais estudos prospectivos de coortes grandes são, portanto, necessários para avaliar o valor potencial de diagnóstico dos miRNAs. Além disso, métodos de quantificação de miRNA precisam ser otimizadas e padronizado usando comparáveis protocolos⁹. Ensaios padronizados podem reduzir resultados inconsistentes e podem ajudar os miRNAs tornar-se potenciais biomarcadores para a aplicação clínica de rotina, como biomarcadores precisam ser quantificado de forma reprodutível para garantir sua aplicabilidade clínica.

Recentemente, dPCR foi introduzido como uma análise de ponto de extremidade. Ele particiona a amostra em aproximadamente 20.000 reações individuais¹⁰. O sistema dPCR então utiliza uma matemático Poisson análise estatística de sinais fluorescentes (reações positivas e negativas), permitindo uma quantificação absoluta sem uma curva padrão de¹⁰. Ao combinar dPCR com sondas fluorescentes de hidrólise, a quantificação absoluta direta altamente específica de miRNAs é tornada possível. Reação em cadeia da polimerase digital tem demonstrado que exibem qualidades técnicas superiores (incluindo uma diminuição da variabilidade, uma maior reprodutibilidade do dia a dia, um alto grau de linearidade e uma sensibilidade elevada) para quantificação dos níveis de miRNA na circulação comparada a PCR em tempo real quantitativa^10,11. Estas qualidades técnicas superiores podem ajudar a atenuar as limitações atuais sobre o uso de miRNAs circulantes como biomarcadores e podem levar ao estabelecimento de miRNAs como biomarcadores em grandes multi centro de ensaios clínicos cardiovasculares e como um método de diagnóstico em geral. Em um estudo anterior, recentemente aplicada dPCR para a quantificação absoluta de miRNAs em pacientes com um AMI em circulação e foram capazes de demonstrar o potencial de diagnóstico superior em comparação com a quantificação dos miRNAs por qPCR¹².

Nesta publicação, queremos demonstrar que o uso dPCR é um método exacto e reprodutível para quantificar diretamente a circulação cardiovasculares miRNAs. A quantificação absoluta de miRNA níveis no soro, utilizando PCR digital, mostra o potencial para o uso em grandes multi centro ensaios clínicos cardiovasculares. Nesta publicação, descrevemos em detalhe como efetivamente realizar PCR digital e como detectar o número de cópia de miRNA absoluto, no soro.

Protocolo

1. extração de miRNA de Plasma/soro

Nota: A fim de quantificar os miRNAs apropriadamente, o microRNA correto isolamento do plasma/soro é um passo crucial. Uma chave para manter em mente, especialmente porque existem diferentes protocolos, é aderir ao mesmo fluxo de trabalho durante o processamento das amostras. Neste protocolo, miRNA é extraído de 50 µ l de soro. Não utilize mais de 200 µ l como este limite, o processo de extração correta.

1. Preparar o soro ou descongelar as amostras congeladas.
2. Adicione 50 µ l de soro reagente de Lise comercial 250 µ l (5 volumes). Suporte a Lise vortexing. Coloca o tubo com o lisado no banco na temperatura ambiente por 5 min.
3. Spike o lisado com 3,5 µ l de pico-no controle (1.6 x 10⁷ cópias / µ l) e misturá-los vortexing.
4. Adicione 50 µ l de clorofórmio (ou seja, uma quantidade igual quanto a amostra de soro inicial) para a separação de fases. Agite o tubo vigorosamente por 15 s. lugar o tubo no banco na temperatura ambiente por 2-3 min.
5. Para a separação de fases, centrifugar o tubo a 12.000 x g a 4 ° C por 15 min.
   Nota: As amostras são separadas agora em uma fase aquosa superior contendo o RNA, uma interfase branco e uma fase orgânica inferior, rosa.
6. Transferi a fase aquosa superior (100 µ l), contendo o RNA em um tubo de novo. Não transfira qualquer material branco interfase como este falsifica a contagem correta do RNA.
7. Adicione 150 µ l (isto é, 1,5 x o volume da amostra transferido) de 100% de etanol. Misture os materiais pipetando-los acima e para baixo. Não centrifugue-los e passar rapidamente para a próxima etapa.
8. Pipete 250 µ l da amostra para uma coluna de rotação comercial em um tubo de coleta de 2 mL. Feche a tampa. Centrifugue a coluna no > 8.000 x g em temperatura ambiente por 15 s. descarte o escoamento.
9. Adicione 700 µ l de número de tampão de lavagem comercial 1 para a coluna de rotação. Feche a tampa e centrifugar a coluna no > 8.000 x g em temperatura ambiente por 15 s. descartar o buffer de lavar roupa de ensaio.
10. Adicione 500 µ l do número de tampão de lavagem comercial 2 à coluna de rotação. Feche a tampa e centrifugar a coluna no > 8, 000 x g em temperatura ambiente por 15 s. descartar o buffer de lavar roupa de ensaio.
11. Pipete 500 µ l de etanol 80% para a coluna de rotação. Feche a tampa, centrifugar a coluna no > 8, 000 x g em temperatura ambiente por 2 min. deite fora o tubo de coleta com o escoamento.
12. Transferi a coluna de rotação para um novo tubo de coleta de 2 mL. Centrifugue a coluna em velocidade máxima com uma tampa aberta para secar a membrana. Descarte o tubo de coleta com o escoamento.
13. Transferi a coluna de rotação para um novo tubo de coleta de 1,5 mL. Eluir o RNA aplicando 30 µ l de água livre de RNase diretamente para o centro da membrana. Feche a tampa. Centrifugue a coluna a toda a velocidade para 1 min.
14. Armazenar o RNA a-70 ° C.
    Nota: O armazenamento de RNA purificado em água livre de RNase entre-70 ° C a-20 ° C não garante nenhuma degradação do RNA por 1 ano. Seguindo o protocolo do fabricante, a quantidade mínima de água livre de RNase para diluir o RNA é 10 µ l. usando menos do que 10 µ l insuficientemente pode hidratar a membrana e reduzir o rendimento total do RNA.

2. inverter a transcrição

Nota: O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado utilizando o seguinte protocolo de transcrição reversa (RT) de 15 µ l (volume de reação total).

1. Descongele o kit RT no gelo. Manter as enzimas no freezer tanto quanto possível para impedir a degradação e girá-los para baixo antes de usar. Descongelar as primeiras demão RT no gelo e girá-los para baixo antes de usar.
2. Prepare a mistura de mestre, conforme descrito na tabela 1.
3. Combine 10 µ l de mistura de mestre e 5 µ l de RNA extraído por alvéolo em uma placa-96.
4. Centrifugue a placa bem a 2.000 x g a 4 ° C por 2 min.
5. Use o protocolo de ciclo térmico descrito na tabela 2 para a transcrição reversa.
   Nota: Conforme descrito abaixo, cDNA pode diretamente ser processado na máquina de PCR digital (ver Tabela de materiais); Alternativamente, ele pode ser armazenado a-20 ° C.

3. gota geração e PCR Digital

Nota: Digital PCR foi realizado utilizando o seguinte protocolo de 40 µ l.

1. Descongele o mix comercial dPCR, o cDNA preparado e os primers PCR no gelo. Centrifugá-los logo antes do uso.
2. Preparar a mistura de mestre, conforme descrito no tabela 3.
3. Adicionar 1,33 μL/poço do produto RT e centrifugá-lo brevemente.
4. Pipete 20 μL da amostra para cada poço da fita 8 poços (linha média).
   Nota: Se a fita de 8 poços não estiver completamente cheio, encher os poços restantes com controles não-modelo (NTCs) que omitem cDNA (isto é, o produto RT produzido com água em vez de RNA extraído) ou dPCR comercial buffer. A NTC serve como um controle de contaminação. Água não deve ser usada em poços restantes, porque isso vai prejudicar a qualidade da formação da gota.
5. Pipete 70 μL do óleo gota geração para as sondas para os poços de petróleo (linha inferior) da fita 8 poços.
6. Colocar uma junta em cima da gaveta de 8 poços e coloque a fita no gerador da gota. Feche o gerador da gota. Espere até que as luzes de 3 indicador verde sólido.
   Nota: As gotas agora estão sendo geradas.
7. Lentamente e com cuidado transferi 40 μL da amostra da gota-formado (linha superior) em separado poços de uma placa de 96 poços, pipetando.
8. Depois de completar a formação de gotículas nas amostras, selar a placa PCR com uma folha de dPCR perfurável a 180 ° C por 4 s.
9. Coloque a folha-selado do PCR-placa no cycler e ciclo-lo conforme descrito na tabela 4, a uma taxa de rampa de 2.5 ° C/s.

4. gota leitura e análise

1. Transferi a placa do termociclador à base do titular da chapa. Aperte a placa do PCR, colocando a parte superior do porta-placa na chapa de PCR.
2. Inicie o software comercial dPCR.
3. Digite o nome da amostra, o nome do experimento e o alvo no setup. Selecione a quantificação absoluta.
4. Começa a gota lendo clicando em executar. Selecione FAM/HEX ou FAM/VIC como química de deteção ao trabalhar com sondas de hidrólise.
   Nota: O software comercial dPCR autoanalisará os dados.
5. Verifique os números de gotículas na tabela de resultados para garantir uma geração de gotículas correto.
6. Selecione todos os poços com a mesma miRNA quantificado e clique em analisar. Use o blot 2D para marcar gotículas positivas e corrigir manualmente os dados de autoanálise (Figura 1).

5. corrigir os cálculos sobre a amostra

1. Normalize a amostra multiplicando o fator de normalização (NF) da amostra.
   NF = mediana [c. elegans medições de miR-39]_{todas as amostras}/ [c. elegans miR-39]_{determinada amostra}
2. Calcule a concentração de soro de miRNA final, ajuste para fatores de diluição (DF).
   [miRNA] _final = [miRNA]_{valor bruto} x DF_RT x DF_dPCR x DF_Ex
   Onde:
   [miRNA] _{valor bruto} = o miRNA quantificada pelo software dPCR comercial;
   DF_RT = factor de diluição do modelo na transcrição reversa;
   DF_dPCR = factor de diluição do modelo em dPCR;
   DF,_Ex = factor de diluição na extração.

6. série de diluição do Oligonucleotide sintético

1. Descongele o liofilizado do oligonucleotide sintético no gelo. Brevemente, centrifugar.
2. Diluir o oligonucleotide sintético liofilizado em água nuclease livre para uma concentração final de 10 pmol / µ l. resumidamente, centrifugar.
3. Diluí-la em água livre de nuclease, conforme descrito na tabela 5. Centrifugue a diluição brevemente entre cada etapa de diluição a 8.000 x g por 10 s.
4. Continuar com a transcrição reversa, conforme descrito na etapa 2 e análise das amostras com PCR digital conforme descrito nas etapas 3 e 4.

Resultados

PCR digital combinado com sondas fluorescentes hidrólise permite que os pesquisadores quantificar diretamente a quantidade absoluta de miRNAs específicos em cópias / µ l. Como a amostra em dPCR é particionada em aproximadamente 20.000 individuais reações de PCR, dPCR não requer técnica Replica¹⁰. O sistema dPCR utiliza uma análise estatística matemática de Poisson de sinais fluorescentes (diferindo entre reações positivas e negativas) permitindo uma quantificação a...

Discussão

Digital PCR é um método relativamente novo de ponto de extremidade do PCR que permite a quantificação absoluta direta de ácidos nucleicos dentro de uma amostra. O método possui vantagens específicas, incluindo uma diminuição da variabilidade, uma maior reprodutibilidade diária e uma sensibilidade superior^11,12. Além disso, devido o particionamento da amostra em aproximadamente 20.000 reações simples e análises de ponto de extremidade, dPCR é mais robusta para sub...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
RNA-Extraction
miRNeasy Serum/Plasma Kit (50)	Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland	217184	Kit para extração de microRNA. O kit contém buffer comercial RWT (chamado de número um no manuscrito)  e RPE (chamado de número dois no manuscrito).
miRNeasy Sérum/Plasma Spike-in-Control; miRNA Syn-cel-miR-39; 10pmol	Qiagen-Amostra & Assay Technologies, Hilden, Deutschland	219610	Spike-in para normalização, Sequência: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3'
Transcrição ReversaKit de
Transcrição Reversa de MicroRNA TaqMan (1000 Reações)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EUA	4366597	para transcrição reversa de microRNA
Ensaios de MicroRNA TaqMan M	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EUA	4440887	Ensaios usados na transcrição reversa
has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EUA	do	ensaio 4440887
001352 cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EUA	Número do ensaio 4440887	000200
Placa PCR, 96 poços, segmentado, semi-contornado	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA	AB0900	Placa de 96 poços para transcrição reversa
Microseal ' B’ selos	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA	MSB1001	Folha para garantir o armazenamento adequado
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1851196	Cycler usado para transcrição reversa
Droplet Digital PCR
100 nmole RNA oligo has-miR-499-5p	Integrated DNA	Technologies Custom	Sequência: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3'ddPCR
Supermix para Sondas (Sem dUTP)	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA		1863024 Supermix usado na geração de gotículas
TaqMan MicroRNA Assays	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EUA	4440887	Ensaios usados em PCR digital (sonda de hidrólise fluorescente)
has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EUA	Número 4440887	do ensaio 001352, primers comerciais
cel-miR-39 (750 RT / 750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EUA	4440887	Número do ensaio 000200, primers comerciais
Cartuchos e juntas DG8 Bio-Rad	Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA	1864007	O cartucho coleta até 8 amostras para geração de gotículas
Cartucho DG8 Holder	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863051	Contém cartuchos na geração de gotículas
Óleo de geração de gotículas para sondas	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA	1863005	Óleo usado na geração de gotículas
Placas de 96 poços ddPCR	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA	12001925 Placa de	96 poços para ddPCR
PCR Placa de vedação térmica, folha, perfurável	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA	1814040	Folha perfurável, compatível com leitor de gotículas
ddPCR Óleo de leitor de gotículas	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA	1863004	Óleo usado na leitura de gotículas
Gerador de gotículas QX100 ou QX200	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA	1863002	Gerador de gotículas, gera as gotículas da emulsão de amostra/óleo
PX1 PCR Seladora de placas	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA	1814000	Sela a placa antes do PCR
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1851196	Cycler usado para ddPCR
QX100 ou QX200 Leitor de gotículas	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA	1863003	Lê gotículas positivas e negativas para PCR com um detector óptico
Controle de tampão ddPCR para sondas	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA	1863052	Controle em branco  e para encher os poços restantes de de 8 poços
Software
QuantaSof Software	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA		1864011 Programa para leitura de gotículas
Prism Windows 5	GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA		Programa para análise estatística