Aqui, descrevemos um procedimento otimizado, Langendorff-baseado para o isolamento de célula única cardiomyocytes atrial de um modelo do rato de metabólica relacionadas com síndrome de insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada. Uma regulação manual da pressão intraluminal de cavidades cardíacas é implementada para render funcionalmente intactos miócitos apropriados para estudos de acoplamento excitação-contração.
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Artigo de método
Isolamento dos Cardiomyocytes Atrial de um modelo do rato de metabólicas relacionadas com síndrome de insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada
Neste artigo
Resumo
Resumo
Neste artigo, descrevemos um procedimento otimizado, Langendorff-baseado para o isolamento de célula única cardiomyocytes atrial (ACMs) a partir de um modelo do rato da síndrome metabólica (MetS)-relacionadas com a insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (HFpEF). A prevalência de HFpEF relacionados com MetS está aumentando, e atrial cardiomiopatias associadas a remodelação atrial e fibrilação atrial são clinicamente altamente relevantes como a remodelação atrial é um preditor independente de mortalidade. Estudos com cardiomyocytes isolado de célula única são frequentemente usados para confirmar e complementar os achados na vivo . Rarefication de vasos circulatórios e fibrose do tecido intersticial representam um fator potencialmente limitante para o isolamento de célula única bem-sucedida do ACMs de modelos animais da doença.
Abordámos esta questão empregando um dispositivo capaz de regular manualmente a pressão intraluminal de cavidades cardíacas durante o procedimento de isolamento, aumentando substancialmente o rendimento do ACMs morfologicamente e funcionalmente intactos. As células adquiridas podem ser usadas em uma variedade de experiências diferentes, tais como cultura de células e imagiologia funcional de cálcio (ou seja, acoplamento excitação-contração).
Nós fornecemos o pesquisador com um protocolo passo a passo, uma lista de soluções otimizadas, completa instruções para preparar o equipamento necessário e um abrangente Guia de solução de problemas. A implementação inicial do processo pode ser bastante difícil, uma adaptação bem sucedida permitirá ao leitor realizar os isolamentos de ACM do estado-da-arte em um modelo do rato de HFpEF relacionados com MetS para um amplo espectro de experiências.
Introdução
MetS descreve um conjunto de fatores de risco para doenças cardiovasculares e diabetes mellitus tipo 2 e inclui uma aumento da pressão arterial, dislipidemia (gerado triglicerídeos e abaixou o colesterol da lipoproteína de alta densidade), aumentou o jejum glicose e obesidade central1. A prevalência mundial de MetS é estimada em 25 – 30% e constantemente crescente2. HFpEF é uma síndrome clínica heterogênea, frequentemente associada com MetS. A remodelação cardíaca durante HFpEF e suas fases anteriores (ou seja, doença cardíaca hipertensiva) também é acompanhada por uma remodelação dos átrios3
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Protocolo
Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de ética local (TVA T0060/15 e T0003-15) e executados de acordo com as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório (Instituto Nacional de saúde, U.S.A.).
Nota: Um fluxograma simplificado do processo é mostrado na Figura 1.
1. predisposições
- Prepare os buffers de acordo com a tabela 1.
| Solução | PB | CB<.... |
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Resultados
Com 21 semanas de idade, 60 – 90% dos ACMs viáveis (estima-se, como descrito no passo 6.1), após a readequação de cálcio (passo 5.4 – 5.7), pode ser isolado de ratos obesos ZSF-1 por esse método (Figura 4A). Em ratos, ACMs são caracterizados por uma diferente e mais fenótipo heterogêneo em relação ao VCMs24,25. Figura 4B mostra um ACM individual com membranas preservadas .......
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Discussão
Aqui, primeiro descrevemos um protocolo para o isolamento de célula única ACMs de um modelo do rato de MetS-relacionados HFpEF que mostra marcada remodelação atrial22. O procedimento é excepcionalmente desafiador como tecido adiposo excessivo pode fazer a preparação cirúrgica, bem como a canulação da aorta, cada vez mais difícil. O guia de solução de problemas fornecidas na tabela 2 endereços os problemas mais comuns do processo de isolamento.
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada pelo DZHK (centro alemão de pesquisa Cardiovascular, D.B.), o EKFS (Else-Kröner-Fresenius Stiftung, F.H.) e pelo BMBF (Ministério alemão de educação e pesquisa), bem como a BIH-Charité financiados pelo programa cientista clínico por Charité - Universitätsmedizin Berlim e Berlim Institute of Health (F.H.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| ZSF-1 Rato obeso | Charles River Laboratories, Inc. | 21 semanas de idade | |
| Tesoura de íris fina | Ferramentas de ciência fina GmbH | 14094-11 | |
| Tesoura cirúrgica | Ferramentas de ciência fina GmbH | 14001-18 | |
| Micro pinça de curativo (curva, serrilhada) | Aesculap, Inc. | Pinça de Tecido BD312R | |
| (reta, 1 x 2 dentes) | Aesculap, Inc. | Pinça de amarração BD537R | |
| (angular) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Guilhotina de Roedores e Pequenos Animais | Kent Scientific Corp. | ||
| 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Conjunto de Infusão com Asas de Borboleta 21 G | Hospira, Inc. | ||
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Agulha hipodérmica Microlance | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modifique a agulha para fazer cânula |
| Seringa Perfusor Original Braun 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Seringa Braun Inject Solo 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Placa de Petri Duroplan (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR Barcos de pesagem quadrados descartáveis 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| de superfície | |||
| Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | ||
| Cloreto | de potássio Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Fosfato de potássio monobásico | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Fosfato de sódio dibásico | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Sulfato de magensium heptahidratado | Sigma-Aldrich, Inc. | ||
| Cloreto de magensium | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurina | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glicose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanodiona monóxido | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Solução de cloreto de cálcio (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Albumina de soro bovino | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparina | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurano) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminina da membrana basal do sarcoma murino Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo prato com fundo de vidro 500µ l 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µ M por 20min na RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µ M por 45 min a 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM por 30 min a 37° C |
| Recipiente de reação encamisado 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Recipiente de reação encamisado 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Armadilha de bolhas encamisada | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED termostato de imersão de aquecimento | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 bomba peristáltica | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Termômetro 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscópio | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Software de imagem ZEN 2.3 | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Controlador de aquecedor de canal único TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| Sistema de perfusão de 8 canais | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| Aquecedores de solução em linha multilinha de 8 canais | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
Referências
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Reimpressões e permissões
