Medição de Mitophagy sensível pelo repórter fluorescentes Flow Cytometry usando o pH-dependente mt-Keima

Summary

Mitophagy, a degradação seletiva da mitocôndria, tem sido implicada na homeostase mitocondrial e é desregulamentado em várias doenças humanas. No entanto, convenientes métodos experimentais para medir a atividade de mitophagy são muito limitados. Aqui, nós fornecemos um ensaio sensível para medir a atividade de mitophagy usando citometria de fluxo.

Abstract

Mitophagy é um processo de remoção seletiva de mitocôndrias danificadas ou desnecessárias usando máquinas de autofagia. Foram encontradas relações estreitas entre mitophagy defeituoso e várias doenças humanas, incluindo doenças neurodegenerativas, câncer e doenças metabólicas. Além disso, estudos recentes têm mostrado que mitophagy está envolvido em processos celulares normais, tais como a diferenciação e desenvolvimento. No entanto, o papel preciso da e mecanismos moleculares subjacentes mitophagy exigem um estudo mais aprofundado. Portanto, é fundamental para desenvolver um método robusto e conveniente para medir as mudanças na atividade de mitophagy. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para avaliar quantitativamente a atividade mitophagy através de citometria de fluxo usando a proteína fluorescente mitocôndrias-alvo Keima (mt-Keima). Este ensaio de citometria de fluxo pode analisar a atividade do mitophagy mais rapidamente e com sensibilidade que os métodos convencionais microscopia ou immunoblotting-based. Este protocolo pode ser aplicado para analisar a atividade mitophagy em vários tipos de células.

Introduction

As mitocôndrias são organelas que são essenciais para a fisiologia e a proliferação celular. As mitocôndrias são responsáveis pela geração de mais de 80% da fonte de ATP via fosforilação oxidativa, e eles também fornecem vários intermediários metabólicos para biossíntese e metabolismo de^1,2. Além de seus papéis no abastecimento de energia e metabolismo, as mitocôndrias desempenham um papel central na muitos outros processos importantes, incluindo a geração de (ROS) de espécies reactivas de oxigénio, a regulação da morte celular e Ca^{2 +} dinâmica intracelular³ . Alterações na função mitocondrial têm sido associadas com doenças humanas, incluindo o câncer, diabetes mellitus e neurodegenerativas várias doenças^4,5. Aumento de disfunção mitocondrial e mutações de DNA mitocondriais também são pensadas para contribuir para processos de envelhecimento normal a^6,7,8. Portanto, o controle de qualidade é uma questão crucial nas mitocôndrias. As mitocôndrias são organelas altamente dinâmicas que continuamente podem mudar a sua forma entre redes alongadas e formulário curto, fragmentado. Dinâmica de mitocôndrias desempenha um papel importante em manter a função das mitocôndrias, bem como a sua degradação a mitophagy⁹.

Mitophagy é um mecanismo que envolve a degradação seletiva de mitocôndrias inteira usando a maquinaria de autofagia. Mitophagy é o princípio mecanismo subjacente mitocondrial volume de negócios e a remoção de mitocôndrias danificadas ou disfuncionais. Neste processo, as mitocôndrias são primeiro rodeadas por uma membrana, resultando na formação de autophagosomes, que depois se fundem com lisossomos para degradação hidrolítica⁹. Estudos genéticos anteriores em Drosophila sugeriram que dois genes relacionados com a doença de Parkinson, induzida por PTEN putativa quinase 1 (PINK1) (PARK6) e Parkin (PARK2), funcionam na mesma via^10,11. Subsequence estudos têm demonstrado que a via PINK1-Parkin é responsável por eliminar as mitocôndrias danificadas e defeitos deste resultado de percurso em mitophagy disfuncional e pode contribuir para doenças humanas^12,13. Recentemente foram encontrados em várias doenças humanas, incluindo câncer, doenças cardíacas, doenças do fígado e de doenças neurodegenerativas ¹⁴defeitos em processos de mitophagy. Além disso, estudos recentes têm mostrado também que mitophagy é fundamental para muitos processos fisiológicos, tais como a diferenciação, desenvolvimento e a resposta imune^{15,16,17,18 ,19}, sugerindo que mitophagy pode desempenhar um papel mais ativo no controle de funções de células.

Apesar da recente confirmação que mitophagy desempenha um papel importante no controle de qualidade tanto em mitocôndrias e doenças humanas, os mecanismos moleculares subjacentes mitophagy permanecem mal compreendido. Embora mecanismos relacionados com mitophagy têm sido sistematicamente estudados em levedura, estudos vistos explorar mecanismos relacionados com mitophagy em células de mamíferos têm focado principalmente via PINK1-Parkin. Estudos anteriores estabeleceram que o pathway PINK1-Parkin é principalmente responsável para a remoção seletiva de mitocôndrias danificadas através de mitophagy^12,20,21. No entanto, estudos recentes têm relatado que, em alguns modelos, mitophagy pode ser ativado mesmo na ausência de funcional PINK1^22,23,24. Estes resultados sugerem que além da via PINK1-Parkin, lá uma adicional via não identificada que pode ativar o mitophagy.

A ausência de um método conveniente para avaliar a atividade de mitophagy é um grande obstáculo para explorar os caminhos que regulam a mitophagy e o seu papel em eventos fisiopatológicos. Microscopia eletrônica é uma poderosa ferramenta para visualizar diretamente as mitocôndrias autophagosome-tragado. No entanto, a microscopia eletrônica tem limitações para quantificar a atividade de mitophagy. Embora as estratégias que usam microtubule-associada da proteína-1 luz corrente 3 (LC3)-conjugadas sondas fluorescentes, tais como a GFP-LC3, são atualmente as abordagens mais amplamente utilizado,²⁵, a natureza transitória do sinal LC3-baseado e sua alta taxa de sinais de falso-positivos limitam sua sensibilidade para a detecção de mitophagy em células²⁶. A combinação da mancha ocidental para medir o nível de proteína mitocondrial, a quantificação do DNA mitocondrial e análise de microscopia de fluorescência para colocalize mitocôndrias com autophagosomes ou lisossomos pode ser uma boa abordagem para a avaliação mitophagy. No entanto, limitações de quantificação e falta de conveniência das metodologias existentes exigem novas abordagens. A introdução de uma nova proteína fluorescente dependente do pH, o alvo mitocondrial Keima (mt-Keima), melhorou muito a capacidade de detectar mitophagy²⁷. Fundindo a sequência mitocondrial-direcionamento de subunidade de citocromo c oxidase VIII (VIII COX) em Keima, mt-Keima é direcionado para a matriz mitocondrial. A grande mudança no pico da excitação de Keima de 440 nm a 586 nm (correspondente a pH 7 e pH 4, respectivamente) pode ser utilizada para avaliar a mitophagy com boa sensibilidade em ambos in vitro e in vivo experimentos^28,29 . Mais importante, a resistência de mt-Keima a degradação lisossomal faz com que a integração do sinal do mt-Keima em lisossomos, permitindo a fácil medição quantitativa da atividade mitophagy. A mudança de fluorescência que ocorre no mt-Keima pode ser analisada usando qualquer microscopia confocal ou fluxo cytometry^28,29. No entanto, um método baseado em citometria de fluxo para medir a atividade de mitophagy usando mt-Keima não foi apresentado em detalhe a data.

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para uma técnica baseada em citometria de fluxo para medir a atividade de mitophagy nas células usando mt-Keima. Embora nós mostramos aqui que análise de citometria de fluxo detectado com sucesso mitophagy CCCP-induzida em células HeLa, expressando Parkin, esta técnica pode ser aplicada a uma ampla variedade de tipos de células.

Protocol

1. geração de células HeLa expressando mito-Keima (mt-Keima)

1. Preparação de lentivirus mt-Keima
   1. Revestir uma placa de cultura de 100-mm, adicionando 2 mL de 0,001% poli-L-lisina/fosfato-salino (PBS) e deixe repousar durante 5 min à temperatura ambiente.
   2. Remover a solução de poli-L-lisina, usando uma pipeta de vidro ligada a um vácuo e lavar o prato de cultura, adicionando 2 mL de 1X PBS.
   3. Placa de 1,5 x 10⁶ HEK293T células na cultura revestida prato com 10 mL de DMEM contendo 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina e cultura as células a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos CO₂ por um dia.
   4. Transfect 2 µ g de mt-Keima particulas de Lentivirus shRNA²⁹ DNA juntamente com embalagem DNAs (psPAX 2 µ g e pVSVG 0,25 µ g) usando um reagente de Transfeccao para 8 h de acordo com as instruções do fabricante.
   5. Remova a mídia do transfection e adicionar 8 mL de mídia fresca.
   6. Recolha a mídia que contém partículas virais 48 h mais tarde. Remover restos celulares da mídia coletada por centrifugação a 500 x g durante 5 min e filtrá-los com um filtro de seringa de 0,45 µm.
      Nota: Para uso a longo prazo, fazer alíquotas de particulas de Lentivirus e armazenar as amostras a-80 ° C. Não submeter as amostras virais para congelamento-descongelamento ciclos eficientes de infecção viral.
2. Infectando as células HeLa-Parkin com mt-Keima lentivirus
   1. Placa de 5 x 10⁴ as células HeLa expressando Parkin (HeLa-Parkin) em um prato de cultura de 60-mm com 4 mL de DMEM contendo 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina a 37 ° C, um dia antes da colheita do lentivirus mt-Keima.
      Nota: Por causa da ausência de expressão de Parkin endógena em HeLa células³⁰, as células HeLa-Parkin usadas aqui para mais claramente mostrar CCCP-induzida mitophagy. Este procedimento também pode ser aplicado a outras linhas de célula primária ou imortalizado.
   2. Remover o meio de crescimento, no dia seguinte e adicione 1 mL de Lentivirus mídia mt-Keima. Adicione um adicional 2 mL de meio de cultura contendo 3 µ l de solução-mãe de polybrene (8 mg/mL em água destilada). Incube durante um dia em uma incubadora de cultura de tecidos CO₂ .
   3. Retire a mistura de Lentivirus de mt-Keima no dia seguinte e lavar as células duas vezes com PBS 1x. Adicionar 4 mL de meio de crescimento e tratar as células com 2 puromicina µ g/mL para dois dias.
   4. Após dois dias de puromicina, retire o meio de crescimento e lave as células duas vezes com 1X PBS. Adicionar meio de crescimento e cultura das células numa incubadora de CO₂ até o uso.
      Nota: Esse método pode ser aplicado para gerar células que expressam estàvel mt-Keima, incluindo outras linhas de células e as células primárias.

2. indução de mitophagy usando CCCP tratamento e preparação de amostras de FACS

1. Placa de 5 x 10⁴ HeLa-Parkin células expressando mt-Keima em uma cultura de 60mm prato com 4 mL de DMEM contendo 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina e cultura-los por um dia a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos CO₂ .
2. Retire o meio de crescimento no dia seguinte e adicione 4 mL de DMEM fresco contendo 10 µM carbonila cianeto m-clorofenilhidrazone (CCCP). Incube as células HeLa-Parkin-mt-Keima numa incubadora de tecido CO₂ para 6 h.
3. Retire o meio de crescimento 6 h depois e lave as células com 2 mL de 1X PBS. Separar as células, tratando-as com solução de tripsina/EDTA e inativar a tripsina pela adição de meio de cultura contendo 10% FBS. Transferi as células para um tubo cônico de 15 mL.
4. Centrifugar as células a 500 x g por 5 min.
5. Cuidadosamente Retire o meio de crescimento por aspiração e ressuspender as células com 1 mL de PBS 1x frio.
6. Células de transferência para o tubo de FACS apropriado e coloque-o no gelo.
   Nota: Prepare as células de HeLa não infectadas como controlo negativo.
   Nota: As células são viáveis no gelo durante várias horas, e sinais de fluorescência de mt-Keima também permanecem estáveis.

3. análise FACS de mitophagy

Nota: Neste estudo, as células foram analisadas com um citômetro de fluxo, equipado com um laser 405 nm e 561-nm. Células estavam animadas com um laser violeta (405 nm) com emissão detectada em 610 nm ± 10 com um detector de BV605 e com um laser verde-amarelo (561 nm) com emissão detectada em 610 nm ± 10 por um detector de PE-CF594 simultaneamente (Figura 1).

1. Retenção de células vivas
   1. Ligue o citômetro de fluxo e o computador e logar o software de análise.
   2. Gerar uma nova experiência ou duplicar uma experiência existente. Para excitar as células com a violeta (405 nm) e verde-amarelo (561 nm) lasers e detectar emissões no detector de nm ± 10 610, selecione BV605 e PE-CF594 além de dispersão para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC) na janela de parâmetro como fluorophores necessária.
      Nota: Todos os fluorophores deve ser adicionados em um modo linear.
   3. Vórtice cada amostra de célula brevemente para dispersar a célula agrega.
   4. Colocar o tubo contendo uma amostra de célula HeLa-Parkin de controle que não está infectada com mt-Keima lentivirus na porta de injeção de amostra e carregue no botão "executar" o citômetro.
   5. Na trama do ponto do FSC contra SSC, ajuste a voltagem FSC e SSC para colocar pilhas no centro da trama do ponto.
   6. Desenhar uma porta P1 usando o ícone de polígono ao redor de células vivas e eliminar as células mortas e detritos celulares (Figura 2A).
2. Ajustar voltagens para laser violeta e verde
   1. Coloca o tubo contendo as células HeLa-Parkin infectadas com mt-Keima lentivirus sobre a injeção de amostra da porta e carregue no botão "executar" o citômetro.
   2. Na trama do ponto de BV605 (405 nm) contra SSC, ajustar a tensão de BV605 para que as células HeLa-Parkin expressando mt-Keima distinguem-se claramente das células de controle que não expressam mt-Keima (Figura 2B).
   3. Na trama do ponto de PE-CF594 (561 nm) contra SSC, ajustar a tensão de PE-CF594 para que as células HeLa-Parkin expressando mt-Keima distinguem-se claramente das células de controle (Figura 2B).
3. Avaliar a percentagem de células em mitophagy
   1. Adquira a BV605 contra a trama do ponto do PE-CF594 usando uma escala linear. Desenhar uma porta usando o ícone de polígono ao redor de células expressando mt-Keima e eliminar as células não expressando mt-Keima (Figura 3A). A população de fluorescência-positivo celular mt-Keima é referida como o "mt-Keima" portão.
   2. Criar outra trama do ponto de BV605 contra CF594-PE mostrando somente "mt-Keima"-condomínio fechado de células. Nesta trama de ponto, desenhe um portão ao redor não tratadas células de mt-Keima-positivo. A atividade de mitophagy basal de controle HeLa células é baixa, e a relação das emissões em PE-CF594/BV605 é menor que 1. Assim, este portão é referido como o "baixo" portão.
   3. Desenhe outro portal que contém a região acima do portão "baixa". Este portão é referido como o "alto" portão porque ele contém células com mitophagy de alta atividade, isto é, células com uma alta proporção de emissões no PE-CF594/BV605 (Figura 3B).
   4. Para calcular a percentagem de células no portão "alta", selecione o menu "Mostrar hierarquia de população". O valor de "Por cento do pai" (% pai) representa a porcentagem de células em "alta" portão entre a população de mt-Keima-positivo.
   5. Defina pelo menos 10.000 eventos para gravar no portão "mt-Keima" parar e executar cada amostra.

Results

Um exemplo da análise de citometria de fluxo de mitophagy CCCP-induzida em células HeLa-Parkin é mostrado na Figura 4. Usando o método de análise de citometria de fluxo descrito acima, podemos detectar um aumento dramático em células mitophagic na porta do "alta". A percentagem de células no portão "alta" foi aumentada mais de 10-fold em comparação com células controle não tratados (Figura 4A). Este aumento na atividade de mitoph...

Discussion

Aqui, apresentamos um método rápido e sensível para a utilização de citometria de fluxo para medir a atividade celular mitophagy em células expressando mt-Keima. Passando por um elevado nível de mitophagy de células apresentam uma maior proporção de PE-CF594 (561 nm) / BV605 (405 nm) excitação. Assim, a atividade mitophagy pode ser expressa como a porcentagem de células exibindo um elevado rácio de 561/405. Calculámos a percentagem de células na região de portão "alto" em um terreno de ponto de PE-CF594 (561 nm) contra B...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P2636
FBS	GIBCO	16000-044
penicilina/estreptomicina	wellgene	LS202-02
PBS	Hyclone	SH30013,02
HEK293T	ATCC	CRL-3216
DMEM	GIBCO	12800-082
OPTI-MEM	GIBCO	31985-070
Garrafa Térmica Turbofect	Scientific	R0531
0.45 μ m filtro de seringa	sartorius	16555
HeLa	ATCC	CCL-2
polybrene	Sigma-Aldrich	H9268	8 mg/ml
puromicina	Sigma-Aldrich	P8833	2 mg/ml
Cianeto de carbonila m-clorofenil hidrazina (CCCP)	Sigma-Aldrich	C2759	10 mM
tripsina-EDTA	wellgene	LS015-01
EQUIPAMENTOS
BD LSRFortessa	BD Bioscience	LSRFortessa
FACSDIVA	BD Bioscience	FACSDIVA (v8.0.1)