Artigo de método

Baseados na placa de cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans: preparação da amostra para o estudo de alterações metabólicas em Diabetes

DOI:

10.3791/58117

⸱

24 de agosto de 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
15th Medical Department, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2Department of Internal Medicine, Heidelberg University, 3German Center for Diabetes Research (DZD), 4European Center for Angioscience, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve um método para o cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans em meios sólidos. Como alternativa à cultura líquida, este protocolo permite a obtenção de parâmetros de diferentes escalas sob cultivo baseado na placa. Isto aumenta a comparabilidade dos resultados, omitindo as diferenças morfológicas e metabólicas entre cultura de meios líquidos e sólidos.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cultivo Caenorhabditis elegans (c. elegans) de uma forma em grande escala em placas de ágar-ágar pode ser demorado e difícil. Este protocolo descreve um método simples e de baixo custo para obter um grande número de animais para o isolamento de proteínas para prosseguir com um western blot, espectrometria de massa ou novas análises proteômica. Além disso, um aumento de números de nematoides para immunostainings e a integração de múltiplas análises sob as mesmas condições de cultivo podem facilmente ser alcançados. Além disso, uma transferência entre placas com diferentes condições experimentais é facilitada. Técnicas comuns na cultura de placa envolvem a transferência de um único c. elegans , usando um fio de platina e a transferência de ágar povoada pedaços usando um bisturi. No entanto, com o aumento do número de nematoides, essas técnicas se tornar excessivamente demoradas. Este protocolo descreve a cultura em grande escala de c. elegans incluindo numerosas medidas para minimizar o impacto da preparação amostra sobre a fisiologia do worm. Fluido e tensão de cisalhamento podem alterar o tempo de vida de e processos metabólicos em c. elegans, exigindo assim uma descrição detalhada das etapas críticas para recuperar resultados confiáveis e reprodutíveis. C. elegans é um organismo modelo, constituído por células neuronais para até um terço, mas falta os vasos sanguíneos, proporcionando assim a possibilidade de investigar unicamente neuronais alterações independentes de controle vascular. Recentemente, descobriu-se cedo neurodegeneração retinopatia diabética antes alterações vasculares. Assim, o c. elegans é de especial interesse para o estudo de mecanismos gerais de complicações do diabético. Por exemplo, uma maior formação de avançados de glicação produtos finais (idades) e espécies reativas de oxigênio (ROS) é observada, que se encontram reproducibly em c. elegans. Protocolos para lidar com amostras de tamanho adequado para um amplo espectro de investigações são aqui apresentados, exemplificado pelo estudo da diabetes induzido por alterações bioquímicas. Em geral, este protocolo pode ser útil para estudos que exigem grande c. elegans números e em qual cultura líquida não é adequada.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Análise de proteína, como um borrão ocidental ou espectrometria de massa, exige mg de proteína. Este rendimento requer um cultivo em grande escala de centenas de c. elegans, que pode ser feito por cultura líquida ou em meios sólidos, transferir os nematódeos por lavagem. Fluido e tensão de cisalhamento induz a expressão dos canais de sódio epitelial (ENaC), que poderia aumentar o estresse osmótico através de um aumento da absorção de sódio, potencialmente alterando o tempo de vida de c. elegans e afetando análises metabólicas1 . Portanto, algumas etapas críticas neste protocolo para a abordagem baseada em placa leva a redução de estresse que afetam a variabilidade experimental em conta. Cultura líquida, por outro lado, influencia o fenótipo dos nematódeos e complica a cultura e a coleção de um número exato de nematoides2. Além disso, substâncias reativas podem ser alteradas pelos componentes de mídia e podem distribuir irregularmente antes de atingir os nematoides. Sobre as limitações da cultura líquida, este protocolo fornece uma abordagem alternativa para cultivo em grande escala amostras de c. elegans.

C. elegans é um organismo modelo com uma rede distinta de 302 células neuronais, inventando um terço de todas as suas células3. Desde a sua introdução em ciência, muitos homólogas e genes ortólogos têm sido descritos, ampliando seu valor como um modelo para pesquisa médica. Recentemente, evidências de comprometimento neurológico em retinopatia diabética, precedendo a lesão vascular, foi apresentada4. C. elegans é desprovido de vasos sanguíneos, mas contém uma rede neuronal distinta, tornando-se um modelo adequado para investigar alterações neuronais além aqueles vasculares. Assim, o c. elegans é de especial interesse para o estudo de mecanismos gerais de complicações do diabético. As alterações bioquímicas em complicações do diabético envolvem a formação de idades, que mais influenciam a formação de ROS em resposta à hiperglicemia5. As idades encontram-se em c. elegans e contribuam para o dano neuronal6. Doenças crônicas são frequentemente causadas por processos complexos, poligênicos, exigindo uma abordagem Multiparamétrico para a avaliação de seus mecanismos subjacentes, como exemplificado aqui com a avaliação de complicações do diabético. Este protocolo pode ser útil para a obtenção de vários parâmetros simultaneamente, bem como posteriormente. Maior comparabilidade e reprodutibilidade de uma abordagem Multiparamétrico podem ser alcançados, omitindo as diferenças morfológicas e metabólicas entre cultura de meios líquidos e sólidos.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nota: Este protocolo é dividido em cinco seções. Nas seções 1-3, é apresentado o protocolo principal à cultura de c. elegans em larga escala. Nas secções 4 e 5 fornecem protocolos adicionais para a avaliação dos metabolitos exemplificadas ocorrendo em metabólitos diabéticos. No detalhe, seção 1 descreve uma cultura geral em larga escala em placas. Secção 2 centra-se sobre a transferência de grandes quantidades de c. elegans, Considerando que a seção 3 explica que a colheita de uma amostra de grande escala. Seção 4 explica o isolamento de proteína da amostra e a seção 5 descreve a preparação de amostras para análises subsequentes líquida cromatografia-tandem espectrometria de massas (LC-MS/MS).

1. em grande escala cultura em placas

  1. Em geral, trabalhe sob uma capa estéril ou perto de chamas para evitar contaminações.
  2. A cultura vermes até atingirem a fase adulta jovem, siga este protocolo previamente publicado7 com as seguintes adaptações.
    1. Use vivos OP50 Escherichia coli bactérias para alimentar os nematódeos e preparar ágar de fluorodeoxyuridine 400 µM (não ampicilina/FUdR) para experimentos.
    2. Para a preparação de uma população síncrona, use OP50 não concentrado e para suceder experimentos com os adultos, use 3.3 x OP50 concentrada através da remoção de 70% do líquido sobrenadante.
    3. Recomendam-se intervalos de alimentação diários. Ao avaliar o estresse oxidativo, intervalos diferentes e volumes para a alimentação podem interferir com os resultados.
    4. Para inoculação, levar um prato com diversos nematódeos e corte em pedaços de aproximadamente 0,5 x 1 cm2 com um bisturi. Transferência de duas a três peças nas chapas de mídia (NGM) nematoides crescimento de 60 mm de diâmetro, contendo OP50 não concentrado.
    5. Incubar as placas à temperatura adequada para a tensão (N2 do selvagem-tipo devem ser cultivadas em 20 ° C) até que os ovos são visíveis na placa.
    6. Lave a maioria dos ovos e animais adultos com 2 mL de tampão de M9 e cobrá-los em um tubo de 15 mL. Centrifugar a suspensão de 800 x g por 2 min. Enquanto isso, comece a preparar a solução de branqueamento.
    7. Retire o tubo centrifugado e remover o tampão M9 com uma pipeta de 10 mL. Adicione 10 mL de solução de branqueamento e misture no vórtice até os nematódeos adultos lysed. Isso leva normalmente cerca de 5 – 7 min, mas não deve demorar mais do que 15 min ou os ovos não desenvolverá totalmente adiante no experimento.
    8. Centrifugar a suspensão de 800 x g por 2 min. lavar 3 vezes com 10 mL M9 para limpar os ovos da solução de branqueamento.
    9. Agora adicione 150 µ l de suspensão de ovo em placas OP50. Uma densidade de 200 – 300 ovos deve ser alcançada em cada prato. Espere até nemátodes alcançado o estágio adulto.
      Nota: O buffer de M9 (pH 7.0) usado para as experiências retratadas consiste das seguintes substâncias: 22mm KH2PO4, 42 mM Na2HPO4e 86 mM de NaCl. Após autoclavagem a mistura, adicione 1 mM MgSO4. A branqueamento solução contém 0,5 M NaOH, 2,3 mM NaOCl resolvido em água destilada.
    10. Prepare-se estéril M9 reserva, pontas de pipeta estéril com um corte de ponta para lavar o worms e tubos de 15 mL para coletá-los em.
    11. Aplicar aproximadamente 1 mL de tampão de M9 nas placas, delicadamente distribuir o buffer por balançando e, gentilmente, pipetar os nematódeos no prato.
    12. Agora, recolha os nematódeos no tubo. Aplicar 150 µ l de suspensão diretamente nas placas (semeado com OP50) com as pontas de pipeta corte e avaliar microscopicamente a densidade dos nematódeos (recomendado: 50 – 100 nematoides por placa de 60 mm).
    13. Se são muito densos, diluir a suspensão com buffer M9 e avaliá-lo sob o microscópio até a densidade desejada é atingida. Se o rendimento é muito pequeno, deixa os vermes assentar ou centrifugar a suspensão 10 s a x 800 g para remover o fluido.
      Nota: Um exemplo de uma densidade suficiente é dado em (macroscópicas) a figura 1A e 1B (microscópicos) no aumento de 20 X. Prosseguir empiricamente como descrito.
    14. Tenha em mente que os vermes assentar-se rapidamente. Para garantir uma repartição equitativa entre as placas, inverta o tubo após cada pilha de placas (placas de 4 – 5).
      Nota: O corte pipeta de ponta, bem como o balanço suave e lavagem das placas, reduz a tensão de cisalhamento.

2. transferência de grandes quantidades de Caenorhabditis elegans

  1. Lave os nematódeos com aproximadamente 500 µ l de tampão de M9, dependendo da idade e ressecamento das placas. Usando a mesma reserva, repita desanexando os nematódeos, até que a maioria dos animais é recolhida em suspensão.
  2. Lentamente, ocupam os nematódeos com uma ponta de pipeta corte e transferi-los em um prato preparado com OP50. Deixe a placa secar.
    Nota: Tenha cuidado para não aplicar muito mais do que o volume recomendado. Especialmente em experiências a longo prazo, as placas não podem tolerá-lo e o ágar-ágar pode quebrar, permitindo que os nematoides que rastejar nas rachaduras.

3. a colheita de uma grande amostra de Caenorhabditis elegans

  1. Dependendo do método selecionado, inicie experiências com uma quantidade suficiente de c. elegans. Para análises de LC-MS/MS, prepare 20 placas (60 x 15 mm) por grupo com aproximadamente 100 nematoides por placa para assegurar um rendimento de pelo menos 200 µ g de proteína por exemplo.
    Nota: Esta parte do protocolo não exige mais, trabalhando em condições estéreis como os nematoides serão coletados e congelados.
  2. No dia da coleta da amostra, prepare nitrogênio líquido para snap-congelar as amostras coletadas. Mantenha não estéreis M9 buffer no gelo para diminuir o metabolismo do nemátodo.
  3. Lave o c. elegans , as chapas, aplicando 1 mL de tampão de M9 e agitando suavemente as placas. Isso evita coletando falecidos nematoides e a maioria dos ovos, se houver qualquer presente, porque eles aparecem para as bactérias e o ágar-ágar.
  4. Ocupam o volume e transferi-lo para um tubo de 15 mL.
  5. Após a coleta da amostra completa, espere que os nematoides resolver ou centrifugar o tubo momentaneamente a 800 x g e remover a maioria do buffer M9. Lavar a amostra 3 x com cerca de 10 mL de M9 (10x o volume da amostra) para remover todas as bactérias.
    Nota: Para garantir que todos os nematoides falecidos são removidos, flutuação de sacarose é outra opção. No entanto, isso não era adequado para os experimentos exibido15. Sacarose é hidrolisado em glicose e frutose. Nas experiências de retratados, o papel da glicose foi avaliado para promover mudanças bioquímicas encontradas em diabetes crônica. Assim, a flutuação de sacarose potencialmente poderia confundir os resultados.
  6. Prepare um tubo de 1,5 mL com 1 mL de tampão de M9 e um tubo vazio de 1,5 mL para cada amostra. Transferi a pelota com uma pipeta de vidro do tubo de 15ml para o tubo vazio 1,5 mL. Esta etapa é essencial para garantir uma transferência quantitativa.
    Nota: Ao contrário durante as etapas anteriores, aqui os nematódeos são mais concentrados. Por causa de uma possível adesão ao pontas de pipeta plástica, perda de grande parte da amostra é esperada. Portanto, use pipetas de vidro em vez disso.
  7. Após a transferência, use a pipeta de vidro para pegar 1 mL de tampão de M9 do segundo tubo de 1,5 mL para enxaguar os nematódeos da parede da pipeta. Além disso, lave os nematódeos restantes do tubo de 15 mL e transferi-los para o tubo de amostra.
  8. Centrifugar o tubo de amostra no 19.000 x g por 1 min e em seguida, remover o sobrenadante possível.
  9. Feche o tubo com Parafilm e imediatamente snap freeze-lo em nitrogênio líquido. Armazene o tubo a-80 ° C até a preparação de lisado.

4. proteína isolamento por espectrometria de massa

Nota: O isolamento da proteína aqui descrito também pode ser usado para outros ensaios (por exemplo, borrão ocidental).

  1. Para a amostra congelada, adicione os mesmos volumes de grânulos de óxido de zircônio de 0.5 mm e pelo menos 2x o volume de lisado tampão contendo um coquetel de inibidor de protease.
    Nota: As análises de correlação de nematoides-para-proteína retratados foram realizadas usando 100 µ l de tampão. Amostras de LC-MS/MS foram lysed com 200 µ l de tampão.
  2. Inicie o homogeneizador por 1 min na velocidade 9. Certifique-se de que as amostras completamente lysed. Repita essa etapa se eles não lysed totalmente.
  3. Centrifugar as amostras por 30 min a 4 ° C no 19.000 x g. Transferir o sobrenadante para um tubo novo no gelo e armazená-lo a-80 ° C até mais medidas vão ser tomadas.
    Nota: O buffer não-desnaturação usado para experimentos retratados consiste das seguintes substâncias: 20 mM Tris HCl (pH 8), 137 mM NaCl 1% Triton-X e 2 mM de EDTA.
    Nota: Tendo seguido os passos do presente protocolo e tendo aplicado a escala sugerida, o rendimento de uma pelota de proteína de aproximadamente 1.000 nematoides deve ser de aproximadamente 500 µ g. Para mais comparações, consulte a Figura 2 e os Resultados de representante.

5. amostra preparação para medições de espectrometria de massa em tandem-cromatografia líquida

Nota: Dependendo do parâmetro de interesse, a preparação da amostra será diferente. Este protocolo incide sobre metilglioxal e determinação de idade.

  1. Medir o metilglioxal intracelular por derivatização com 1,2-diaminobenzene (DB) como descrito anteriormente,9.
    1. Homogeneizar as amostras com 20 µ l de gelado ácido tricloroacético de 20% (wt/vol) em cloreto de sódio 0,9% (wt/vol) e 80 µ l de água em um tubo de 1,5 mL.
    2. Spike as amostras de 5 µ l com padrão interno (13C3-MG; 400 nM), misturá-los pela utilização do Vortex e centrifugá-los a 21.000 x g por 5 min a 4 ° C.
    3. Transferi 35 µ l do sobrenadante para o frasco de amostra HPLC contendo uma pastilha de vidro de 200 µ l.
    4. Adicione 5 µ l de 3% de azida sódica (wt/vol) para cada amostra, seguida de 10 µ l de 0,5 mM DB em 200mm HCl contendo 0,5 mM diethylenetriaminepentaacetic ácido (DETAPAC) em água.
    5. Incube as amostras para 4 h à temperatura ambiente, protegida da luz.
    6. Analise as amostras por LC-MS/MS, como descrito anteriormente,9.
      Nota: Para a medição de idades, isole as proteínas conforme descrito na seção 4 do protocolo.
  2. Medir a concentração de proteína dos lysates (descongeladas) usando um ensaio de Bradford10.
    1. Preparar alíquotas de 30 µ l para uma curva padrão cravada com albumina de soro bovino (BSA) resolvida em tampão fosfato salino (PBS) da seguinte concentração: 0; 0.1; 0,2; 0.3; 0,4; 0,6; 0,8; e 1,0 mg/dL.
      Nota: Se a amostra foi preparada para o tamanho sugerido (consulte a etapa 4.1 para a preparação de lisado com 200 µ l de tampão), a concentração estimada deve ser no intervalo de aproximadamente 2-7 mg/mL. Neste caso, dilua as amostras 01:10 com PBS antes da medição.
      Nota: Para os primeiros experimentos usando este método, recomenda-se medir as amostras em diferentes diluições (1, 01:10 e 1: 100). Como não há nenhuma determinação exata do número de nematoides, o rendimento pode diferir entre investigadores individuais.
    2. Usar uma placa de 96 poços transparente (poliestireno) e pipetar 10 µ l de cada concentração de padrão e das amostras nas diluições escolhidas em duplicatas em poços.
    3. Diluir a proteína ensaio corante reagente concentrado 1:5 com água destilada (aq. dest.) e adicionar 200 µ l da diluição para cada amostra na placa. Incube a placa por 10 min à temperatura ambiente.
    4. Medir a absorvância dentro de 30 min em 595 nm com um leitor de placa. As amostras podem ser interpoladas a partir da curva padrão calculada. Mais detalhes do método foram descritas extensivamente na literatura10.
  3. Medir as idades intracelulares, como descrito anteriormente,11,12.
    1. Lave os extratos de proteínas totais (aproximadamente 200 µ g) 3x com água por ultracentrifugação em 10 unidades de filtro centrífugo kDa.
    2. Adicionar 10 µ l de HCl a 100 mM, 10 µ l de pepsina (2 mg/mL em 20 mM HCl) e 10 µ l de timol (2 mg/mL em 20 mM HCl) à proteína recuperada (cerca de 100 µ l) e incubar as amostras a 37 ° C por 24 h.
    3. Neutralizar e as amostras do buffer em pH 7,4, adicionando 12,5 µ l de tampão de fosfato de potássio 0,5 M (pH 7,4) e 5 µ l de KOH de 260 mM.
    4. Adicionar 10 µ l de Pronase E [2 mg/mL em tampão de fosfato de potássio 10 mM (pH 7,4)] e 10 µ l de uma solução de penicilina-estreptomicina e incubar as amostras a 37 ° C por 24 h.
    5. Adicionar 10 µ l de aminopeptidase [2 mg/mL em tampão de fosfato de potássio 10 mM (pH 7,4)] e 10 µ l de prolidase [2 mg/mL em tampão de fosfato de potássio 10 mM (pH 7,4)] e incubar as amostras a 37 ° C por 48 h.
    6. Analise o hidrolisado resultante por LC-MS/MS, como descrito anteriormente,12.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui exemplos de criação de uma grande escala de c. elegans cultura para aplicações em pesquisa do diabetes são apresentadas. Pode ser de interesse para relacionar os parâmetros de um único animal, ao invés de normalizar isso à concentração de proteínas totais. Em um ensaio que exige um pequeno número de nematoides, isso pode ser facilmente realizado pela contagem dos nemátodes. Para uma grande escala de c. elegans cultura envolvendo centenas de nematoides por grupo expe...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo apresenta uma abordagem confiável para o cultivo em grande escala de c. elegans , obter resultados quantitativos. Achados da literatura poderiam ser replicados como mostrado nos Resultados de representante. Mesmo que este protocolo para a recolha de amostras em grande escala de c. elegans parece ser um método direto, há certas armadilhas para ter em conta. Sobre a sincronização da população de nematoides, este protocolo descreve uma abordagem por branqueamento da populaçã...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo foi suportado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dentro a 1874 IRTG "Complicações microvasculares diabéticas" e CRC 1118 "Metabólitos reativos como causa para complicações tardias diabéticas". Cepas de c. elegans N2 e CL2166 foram fornecidas pelo CGC, que é financiado pelo NIH escritório de programas de infra-estrutura de pesquisa (OD010440 P40).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
E. coli OP50CGCn/a
C. elegans N2CGCn/a
C. elegans CL2166CGCn/a
Placa de Petri, 60 mm x 15 mmGreiner One628161
Pipeta volumétrica, vidros, 10 mLNeolabE-0413
Proteinase comprimidos de coquetel inibidorRoche04693124001
Tampão de lisado não desnaturante: < / u>
Tris-HCl, pH 8SigmaT3253
Cloreto de sódio (NaCl)SigmaS7653
Triton X-100SigmaX-100
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)SigmaE5391
Placas de 96 poços, fundo transparenteMarca781611
Infinite M200, leitor de placasTecan30017581
Zirconium Oxide Beads, 0,5 mmNext advanceZROB05-RNA
Bullet Blender, homogeneizadorNext advanceBBX24
Pepsina da mucosa gástrica suínaSigmaP6887
TimolSigmaT0501
Pronase E / Protease de Streptomyces griseus < / em>SigmaP6911
Solução de penicilina-estreptomicinaSigmaP43339
Prolidase de rim suínoSigmaP6675
Aminopeptidase de Aeromonas proteolytica< / em>SigmaA8200
Unidade de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-0.5MerckmilliporeUFC501096
Basic Os materiais para cultura de placas são descritos na Referência 6.

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fronius, M., Clauss, W. G. Mechano-sensitivity of ENaC: may the (shear) force be with you. Pflügers Archiv. 455 (5), 775-785 (2008).
  2. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html (2006).
  3. Altun, Z. F., Hall, D. H. Nervous system, general description. WormAtlas. , Available from: http://www.wormatlas.org/hermaphrodite/nervous/Neuroframeset.html (2011).
  4. Sohn, E. H., et al. Retinal neurodegeneration may precede microvascular changes characteristic of diabetic retinopathy in diabetes mellitus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (19), E2655-E2664 (2016).
  5. Chilelli, N. C., Burlina, S., Lapolla, A. AGEs, rather than hyperglycemia, are responsible for microvascular complications in diabetes: a "glycoxidation-centric" point of view. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases. 23 (10), 913-919 (2013).
  6. Schlotterer, A., et al. C. elegans as model for the study of high glucose- mediated life span reduction. Diabetes. 58 (11), 2450-2456 (2009).
  7. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152(2009).
  8. Leiers, B., et al. A stress-responsive glutathione S-transferase confers resistance to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 34 (11), 1405-1415 (2003).
  9. Rabbani, N., Thornalley, P. J. Measurement of methylglyoxal by stable isotopic dilution analysis LC-MS/MS with corroborative prediction in physiological samples. Nature Protocols. 9 (8), 1969-1979 (2014).
  10. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 7 (72), 248-254 (1976).
  11. Ahmed, N., Argirov, O. K., Minhas, H. S., Cordeiro, C. A., Thornalley, P. J. Assay of advanced glycation endproducts (AGEs): surveying AGEs by chromatographic assay with derivatization by 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate and application to Nepsilon-carboxymethyl-lysine- and Nepsilon-(1-carboxyethyl)lysine-modified albumin. Biochemical Journal. 364 (Pt 1), 1-14 (2002).
  12. Thornalley, P. J., et al. Quantitative screening of advanced glycation endproducts in cellular and extracellular proteins by tandem mass spectrometry. Biochemical Journal. 375 (Pt 3), 581-592 (2003).
  13. Karachalias, N., Babaei-Jadidi, R., Ahmed, N., Thornalley, P. Accumulation of fructosyllysine and advanced glycation end products in the kidney, retina and peripheral nerve of streptozotocin-induced diabetic rats. Biochemical Society Transactions. 31, 1423-1425 (2003).
  14. Morcos, M., et al. Glyoxalase-1 prevents mitochondrial protein modification and enhances lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 7 (2), 260-269 (2008).
  15. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).
  16. Lagido, C., McLaggan, D., Glover, L. A. A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (105), e53083(2015).
  17. Takamiya, S., Mita, T. Large-scale purification of active liquid-cultured Caenorhabditis elegans using a modified Baermann apparatus. Parasitology International. 65 (5 Pt B), 580-583 (2016).
  18. Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. Microfluidic systems for high-throughput and high-content screening using the nematode Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 17 (22), 3736-3759 (2017).
  19. Zhu, G., Yin, F., Wang, L., Wei, W., Jiang, L., Qin, J. Modeling type 2 diabetes-like hyperglycemia in C. elegans on a microdevice. Integrative Biology. 8 (1), 30-38 (2016).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Cultivo de C elegansCultivo em PlacaIsolamento de Nemat deosAn lise de Rendimento ProteicoWestern BlotEspectrometria de MassaRedu o do Estresse de CisalhamentoCongelamento em Nitrog nio L quidoModelo de Pesquisa de DiabetesEstudo de Altera es Metab licas

Artigos relacionados