A geração de fraturas fechadas de fêmur em ratos: um modelo para estudar a consolidação óssea

Resumo

O modelo murino fratura fechada do fêmur é uma plataforma poderosa para estudar a consolidação da fratura e novas estratégias terapêuticas para acelerar a regeneração óssea. O objetivo do presente protocolo cirúrgico é gerar fraturas femorais fechadas unilaterais em camundongos, usando uma haste intramedular aço para estabilizar o fêmur.

Resumo

Fraturas ósseas imponham um enorme fardo socio-económica em pacientes, além de afetar significativamente a sua qualidade de vida. Estratégias terapêuticas que promovem a consolidação óssea eficiente são inexistentes e em alta demanda. Eficazes e reprodutíveis de modelos animais de cura de fraturas são necessários para compreender os complexos processos biológicos associados a regeneração óssea. Muitos modelos animais de consolidação da fratura foram gerados ao longo dos anos; no entanto, modelos de fratura murino surgiram recentemente como poderosas ferramentas para estudar a consolidação óssea. Desenvolveram-se uma variedade de modelos abertos e fechados, mas o modelo de fratura fechada do fêmur se destaca como um método simples para a geração de resultados rápidos e podem ser reproduzidos de forma fisiologicamente relevante. O objetivo do presente protocolo cirúrgico é gerar fraturas femorais fechadas unilaterais em camundongos e facilitar uma estabilização pós-fratura do fêmur através da inserção de uma haste intramedular aço. Apesar de dispositivos como um prego ou um parafuso para oferecer maior estabilidade axial e rotacional, o uso de uma haste intramedular fornece uma estabilização suficiente para resultados consistentes de curativas sem produzir novos defeitos no tecido ósseo ou danificar-se nas proximidades de macio tecido. Imagem radiográfica é usada para monitorar a progressão da formação de calo, união óssea e posterior remodelação do calo ósseo. Resultados de cicatrização óssea são normalmente associados com a força do osso curado e medidos com testes de torção. Ainda assim, compreendendo os início eventos celulares e moleculares associados a reparação da fratura é fundamental no estudo da regeneração do tecido ósseo. O modelo de fratura fechada de fêmur em ratos com fixação intramedular serve como uma plataforma atrativa para estudar a consolidação de fratura óssea e avaliar estratégias terapêuticas para acelerar a cicatrização.

Introdução

Fraturas estão entre as lesões mais comuns que ocorrem para o sistema músculo-esquelético e estão associadas com um enorme fardo socioeconômico, incluindo custos de tratamento que são projetados para superar a US $ 25 bilhões anualmente no Estados Unidos^{1, 2}. Embora a maioria das fraturas cura sem incidentes, a cura é associado com substancial tempo de inatividade e perda de produtividade. Aproximadamente 5-10% de todas as fraturas resultar em um atraso de cura ou não-sindicalizados, devido à idade ou outras condições de saúde crônica subjacente, tais como osteoporose e diabetes mellitus^3,4,5. Não há tratamentos farmacológicos aprovados pela FDA estão atualmente disponíveis para promover a cicatrização óssea eficiente e encurtar o tempo de recuperação.

Consolidação da fratura é um processo complexo e altamente dinâmico envolvendo a coordenação de vários tipos de células. Portanto, uma compreensão abrangente dos eventos celulares e moleculares associados a regeneração óssea é crucial para a identificação de alvos terapêuticos que acelerar este processo. Como com outras doenças humanas, o estabelecimento de um modelo animal altamente favorável e reprodutível é crucial no estudo da consolidação óssea. Animais maiores, como ovelhas e suínos, têm propriedades de remodelação óssea e biomecânica semelhantes aos seres humanos, mas são caros, exigem tempo cura substancial e não são facilmente passíveis de manipulação genética⁶. Por outro lado, os modelos animais pequenos, tais como ratos e camundongos, oferecem muitas vantagens, incluindo uma facilidade de manuseio, baixo custo de manutenção, ciclos de reprodução curto e um mais curto de tempo cura⁷. Além disso, o genoma do rato é totalmente sequenciado, permitindo a manipulação rápida e a geração de variantes genéticas. Assim, o mouse é um sistema poderoso modelo para estudar doenças humanas, lesão e reparar a⁸. Em humanos, comorbidades como osteoporose e diabetes mellitus aumentam a probabilidade de uma cicatrização. Um número de modelos existentes do mouse está disponíveis para estudar os efeitos de comorbidades, tais como osteoporose e diabetes mellitus na lesão do osso e cura. Pacientes que sofrem de osteoporose tem uma formação óssea diminuiu acentuadamente durante as fases posteriores de uma fratura cura⁹. Ovariectomizadas ratos (OVX) exibem perda óssea rápida e óssea retardada de cura semelhantes às observadas em osteoporose pós-menopausa^10,11. Além disso, muitos modelos de mouse do tipo I e tipo diabetes II imitar a fenótipos massa óssea baixa e prejudicada consolidação visto em humanos¹¹. Além disso, modelos de fratura murino servem como uma plataforma versátil para estudar os processos biológicos complexos ocorrem em calo ósseo e explorar novas estratégias terapêuticas que aceleram a regeneração do tecido ósseo.

Apesar das diferenças na estrutura óssea e metabolismo, o processo geral de fratura óssea cura permanece muito semelhante em camundongos e humanos, envolvendo uma combinação de endocondral e ossificação intramembranosa seguido de remodelação óssea. Ossificação endocondral envolve o recrutamento de células progenitoras para regiões menos mecanicamente estáveis em torno da gap de fratura, onde eles se diferenciar em condrócitos que hipertrofia e mineralize da cartilagem para produzir um calo mole. A segunda onda de células progenitoras infiltrar o calo e se diferenciam em osteoblastos maduros que secretam novo osso matriz^12,13,14,15. Durante a ossificação intramembranosa, progenitores na superfície periosteal e endosteal diretamente diferenciarem em matriz secretoras de osteoblastos e facilitam a ponte da fratura lacuna^{9,11,12 ,13}. Juntos, a endocondral e intramembranosa ossificações resultam no desenvolvimento de um calo duro, que é ainda mais remodelado ao longo do tempo para formar um osso secundário forte capaz de suportar cargas mecânicas^{13,14 ,15}. Em seres humanos saudáveis, o processo de cicatrização leva cerca de 3 meses, em comparação com apenas 35 dias em ratos¹⁶.

Consolidação da fratura foi comumente estudado usando qualquer modelos cirúrgicos abertos ou fechados,¹⁷. Abra as abordagens cirúrgicas, como a geração de um defeito de tamanho crítico ou completar a osteotomia, padronizar a localização da lesão e a geometria para reduzir os desvios causados por fraturas cominutivas. Osteotomias servem como um excelente modelo para estudar o mecanismo subjacente por trás de um não-União porque a cura é frequentemente atrasada em comparação com fraturas fechadas. Além disso, uma fixação rígida externa é necessária para estabilizar o osso osteotomized, significando que a regeneração dependerá principalmente da ossificação intramembranosa. Abordagens cirúrgicas abertas usam dispositivos tais como bloqueio de unhas, pin-clipes e placas de travamento para fornecer estabilidade axial e rotacional ao membro fraturado; no entanto, tais dispositivos são caros e requerem significativamente mais tempo na cirurgia^18,19,20,21. Por outro lado, modelos fechados são estabilizados com um dispositivo de fixação intramedular simples, permitindo a suficiente instabilidade estimular a cura endocondral. Como resultado, modelos de fratura fechada não facilmente imitar as condições de um não-sindicalizados. Técnicas de fixação interna, tais como pinos intramedular, pregos e parafusos de compressão, são vantajosas, como eles são mais barato, fácil de usar e minimizar o tempo de cirurgia^21,22,23. Em alguns casos, os pinos intramedulares são inseridos antes da fratura, mas da flexão do pino intramedular pode levar a angulação ou deslocamento do fêmur fraturado, contribuindo para um tamanho variável calo e cura. O local da fratura e geometria são mais difíceis de padronizar em modelos fechados, como eles são gerados usando um dispositivo de flexão de três pontos, onde um peso é cair na diáfise. No entanto, com a técnica adequada, esta abordagem cirúrgica oferece resultados rápidos e consistentes. Além disso, o modelo de fratura fechada serve como uma ferramenta clinicamente relevante para o estudo de fraturas causadas por força de alto impacto ou estresse mecânico²².

Este protocolo cirúrgico foi adaptado de métodos anteriormente descritos usando um pino intramedular para estabilizar a fraturadas fêmures de ratos e camundongos^22,24,25. Primeiro, uma agulha de haste intramedular de pequeno diâmetro é inserida através do entalhe de intracondylar para estabelecer um ponto de entrada, e um fio-guia é introduzido antes de gerar uma fractura transversal a femoral midshaft usando um três-ponto de gravidade-dependente dispositivo de dobra. Após a bem sucedida geração de uma fratura do fêmur fechada, uma haste intramedular de maior diâmetro é incorporada sobre o fio-guia para estabilizar o fêmur fraturado. Este método evita o risco de cicatrização causada pela angulação do pino intramedular durante a fratura, como a colocação da pós-fratura haste permite a estabilização de reposicionamento e otimizada do fêmur ferido.

Protocolo

O procedimento a seguir foi realizado com a aprovação do Comitê de uso (IACUC) e Indiana universidade escola de medicina institucional Cuidado Animal. Todas as cirurgias de sobrevivência foram realizadas sob condições estéreis, conforme descrito pelas diretrizes do NIH. Dor e risco de infecções eram geridas com adequada analgésicos e antibióticos para garantir um resultado positivo.

1. anestesia e preparação

1. Pesar o mouse e anestesiá-lo com uma mistura de cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10mg/kg) administrada através de via intraperitoneal (I.P.). Coloque o mouse em uma gaiola vazia e monitorá-lo até que está totalmente sedado.
2. Certifique-se de que o mouse está sedado usando um reflexo de pitada de dedo do pé. Aplica a pomada oftálmica para seus olhos para protegê-los da secagem.
3. Retire a pele da extremidade direita. Limpe o local cirúrgico com um etanol de esfoliação e 70% à base de iodo. Esfregue o local cirúrgico, começando no centro do joelho e fazer uma varredura circular para fora. Repita este 3x com scrubs frescos, terminando com etanol a 70%.
4. Administre uma dose pré-operatória de analgesia de cloridrato de buprenorfina (0,03 mg/kg) por via subcutânea para a gestão da dor no pós-operatório imediato.
5. Coloque o mouse sobre uma almofada de aquecimento, coberta por um bloco cirúrgico estéril.

2. abordagem cirúrgica

Nota: Antes da fratura, o peso e a altura de queda devem ser empiricamente determinadas para a cepa específica, idade e sexo dos ratos antes da cirurgia. Este procedimento cirúrgico é otimizado para camundongos machos C57BJ6 com 10 semanas de idade.

1. Coloque o mouse sobre as costas e flexionar o joelho da perna operativa. Usando uma lâmina de bisturi, faça uma incisão de 1,5 cm, centralizada sobre a articulação do joelho.
2. Deslocar lateralmente à patela usando fórceps para expor a extremidade distal do fêmur. Inserir a agulha hipodérmica 1.5 - em aço inoxidável de longa 25 gauge no centro do sulco troclear, ao longo do canal medular de forma retrógrada e através da extremidade proximal do fêmur. Tire um raio-x para garantir a colocação apropriada do pino.
   Nota: A agulha deve sair do lado dorsal do mouse para criar um caminho para o fio-guia.
3. Passe um fio-guia do tungstênio calibre 36 tempo 4 - na através do eixo da agulha, entrando através do hub no fêmur distal e saindo o chanfro do lado dorsal do mouse.
4. Após a colocação bem sucedida do fio-guia, remova cuidadosamente a agulha de calibre 25 puxando suavemente no hub, mantendo o membro e o fio-guia no lugar. Confirme a colocação do fio-guia por raios-x.
5. Segure um peso de 391 g de uma altura de 34,6 cm acima do disco de impacto (figura 1A). Posição do fêmur horizontalmente através de dois suportar pontos, tal que as regiões intertrocantérica e supracondilianas do fêmur descansar sobre os batentes de apoio (figura 1B) e o lado lateral do membro é virado para o ponto de carregamento (Figura 1 ). Largar o peso e Retire cuidadosamente o mouse do dispositivo imediatamente após a fratura.
6. Confirme o local da fratura por raios-x.
7. Insira o tubo de aço inoxidável de calibre 24 hipodérmico sobre o guia para estabilizar o fêmur fraturado.
   Nota: Este aplicativo pode exigir alguma força como o ponto de entrada foi gerado usando uma agulha de diâmetro menor. Esta diferença de diâmetro efetivamente impede uma migração potencial da haste calibre 24 através da extremidade proximal do fêmur. A profundidade de inserção pode ser sentida manualmente como a tubagem romba encontra o osso cortical do grande trocanter.
8. Confirme a posição da haste de aço e a estabilização do fêmur fraturado por raio-x antes de remover o fio-guia.
9. Corte o tubo em excesso na extremidade distal do fêmur usando cortadores de fio. Enterre os tubos expostos sob a superfície dos côndilos usando fórceps para aplicar uma força descendente suave, tomando cuidado para não deslocar a articulação do joelho.
10. Reposicione a patela usando fórceps. Feche o local da incisão com uma sutura absorvível de 5-0.

3. pós-operatórios

1. Após a cirurgia, os ratos podem ser injetados com até 500 µ l de estéril salina através da rota I.P. para ajuda-los na sua recuperação pós-operatória.
2. Monitore os animais em uma cama de recuperação aquecida até que eles despertam da cirurgia. Uma vez ambulatorial, devolvê-los à sua jaula.
3. Continue a acompanhar de perto os ratos durante vários dias após a cirurgia para garantir que eles são a cura adequadamente e recuperar a mobilidade. Administre analgesia de cloridrato de buprenorfina (0,03 mg/kg) por via subcutânea cada 6 h durante 3 dias após a cirurgia e conforme necessário depois disso. Evite o uso de drogas antiinflamatórias não-esteroides (AINEs), como eles têm sido mostrados para prejudicar a consolidação óssea após a cirurgia.

Resultados

O sucesso da implementação do procedimento cirúrgico foi monitorado com imagens radiográficas. Etapas-chave incluem a inserção de uma agulha de haste intramedular, a colocação de um fio-guia, a indução de uma fratura transversal no midshaft a femoral e a estabilização adequada com uma haste intramedular (Figura 2Aeu - 2Aiv). A progressão de cura do calo da fratura foi monitorada com imagens radiográficas semanais até a 28 dia...

Discussão

O objetivo deste procedimento cirúrgico é gerar fraturas femorais fechadas padronizadas em camundongos. A principal vantagem desse modelo é que a fixação interna ocorre após a geração da fratura, evitando assim uma angulação da haste intramedular. Talvez o aspecto mais importante deste protocolo é a geração de uma fratura transversal padronizada no midshaft fêmur, como a geometria da fratura é dependente da força de flexão aplicada e o posicionamento do membro hind. Posicionamento incorreto do fêmur durante o momento de ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Aparador Oster Minimax	Animal World Network	78049-100
POVIDONA-IODO	Thermo Fisher Scientific	395516
POMADA OFTÁLMICA	Thermo Fisher Scientific	NC0490117
Styker T/Bomba Recirculador de Água Quente	Kent Scientific Corporation	TP-700
1ml Seringa Sub-Q	Thermo Fisher Scientific
ENCORE Sensi-Touch PF	Moore Medical LLC	30347	Luva cirúrgica sem pó, sem pó
Agulhas hipodérmicas PrecisionGlide 25G	Thermo Fisher Scientific	14-826-49
Fio de Tungstênio de Ultra-Alta Temperatura,	McMaster-Carr	3775K37	0.005" de Diâmetro, Carretel de 1/16 lb., 380' de Comprimento
Aço inoxidável 304, tubulação de parede fina 24G	Microgroup Inc	304h24tw-5ft
#15 Lâminas de bisturi	Ferramentas de ciência fina	10015-00
#10 Lâminas de bisturi	Ferramentas de ciência fina	10010-00
Pinça de padrão estreito	Ferramentas de ciência fina	11002-12	Serrilhado / reto / 12cm
Pinça de íris	de ciência fina	11066-07	1x2 dentes / reto / 7cm
Dissector Tesoura	Fine Science Tools	14081-09	Lâminas Finas / Angular para o Lado / Sharp-Sharp / 10cm
Tesoura Fina	Fine Science Tools	14058-11	ToughCut / Reto / Sharp-Sharp / 11.5cm
Olsen-Hegar Agulha Titular com Cortador de Sutura	Fine Science Tools	12002-12	Reto / Serrilhado / 12cm / com Trava
Crile Hemostat	Fine Science Tools	13004-14	Cortador de fio de tungstênio serrilhado / reto / 14 cm
	ACE Surgical Supply Co., Inc.	08-051-90	ACE #150 Cortador de Fio, pontas de carboneto de tungstênio
3-0 VICRYL Sutura	Ethicon	J423H	3-0 VICRYL UNDYED 27" FS-2 CORTE
piXarray 100 Sistema de Radiografia de Espécime Digital	Bioptics, Inc		Sistema de Raios X de
Gabinete Einhorn Dispositivo de Dobra de 3 Pontos	N/A	N/A	Custom Built

309597 Ferramentas