Summary
Cette méthode permet de DÉCELLULARISATION d’un organe solide complexe à l’aide d’un protocole simple basé sur un choc osmotique et la perfusion de détergent ionique avec une interruption minimale orgue matrice. Elle compose d’une technique de DÉCELLULARISATION roman pour les coeurs humains à l’intérieur d’une poche sous pression avec un suivi en temps réel du débit de flux dynamique et cellulaires de débris.
Abstract
La solution ultime pour les patients atteints d’insuffisance cardiaque terminale est une transplantation d’organe. Mais coeurs donneurs sont limitées, immunosuppression est nécessaire, et finalement le rejet peut se produire. Création d’une fonctionnelle, autologue coeur bio-artificiel pourrait résoudre ces défis. Biofabrication d’un cœur composé de cellules et l’échafaudage est une option. Un échafaudage naturel avec la composition spécifique des tissus, mais aussi les micro - et macro-architecture peut être obtenu par les coeurs decellularizing les humains ou les grands animaux comme le porc. DÉCELLULARISATION consiste à laver les débris cellulaires, tout en préservant les système vasculaire et la matrice extracellulaire 3D et permettant de « cellularisation » à un plus tard validant. Capitalisant sur notre roman trouver cette DÉCELLULARISATION de perfusion des organes complexes est possible, nous avons développé une méthode plus « physiologique » pour decellularize les coeurs humains non transplantables en les plaçant à l’intérieur d’une poche sous pression, dans une inversion orientation, sous pression contrôlée. À l’aide d’une poche sous pression vise à créer des gradients de pression à travers la valve aortique à garder fermée et améliorer la perfusion myocardique. Évaluation simultanée de la dynamique de l’écoulement et l’élimination de débris cellulaires lors DÉCELLULARISATION nous a permis de surveiller les transmissions apports et les retraits de débris, générant ainsi un échafaudage qui peut être utilisé soit pour une simple réparation cardiaque (par exemple comme un patch ou échafaudage de soupape) ou comme un échafaudage tout grand orgue.
Introduction
Insuffisance cardiaque entraîne une mortalité élevée chez les patients. L’option de traitement ultime pour l’insuffisance cardiaque terminale est allo-greffe. Cependant, il y a une longue liste d’attente pour une transplantation en raison de la pénurie d’organes de donneurs et les patients visage après la transplantation les obstacles qui vont de l’immunosuppression à orgue chronique rejet1,2. Cœurs fonctionnels bioingénierie de repeuplement DECELLULARISE coeurs à taille humaine avec un personnel du patient les cellules pourraient contourner ces obstacles3.
Une étape importante dans « engineering », un coeur est la création d’un échafaudage avec une structure vasculaire et parenchymateuse appropriée, composition et fonction pour guider l’alignement et l’Organisation des cellules livrées. En présence d’un cadre approprié, les cellules ensemencées sur l’échafaud devraient reconnaître l’environnement et remplir la fonction attendue dans le cadre de cet organe. À notre avis, matrice extracellulaire DECELLULARISE orgue (dECM) comprend les caractéristiques nécessaires de l’échafaudage idéal.
En utilisant la vascularisation intrinsèque, complexe DÉCELLULARISATION ensemble-organe peut être atteint via antérograde ou rétrograde perfusion4 pour supprimer les composants cellulaires tout en préservant la matrice extracellulaire 3D délicate et système vasculaire2, 5,6,7. Une vascularisation fonctionnelle est importante dans les organes entiers de bioingénierie justes comme in vivo, pour la distribution des éléments nutritifs et d’enlèvement des déchets8. DÉCELLULARISATION perfusion coronaire s’est avérée pour être efficace dans la création de DECELLULARISE coeurs de rats4ou cochons4,7,9,10,11 ,12,13et les humains5,7,14,15,16. Pourtant, l’intégrité des valves, oreillettes et autres régions « minces » peut souffrir.
Taille humaine DECELLULARISE coeur échafaudages peuvent être obtenus auprès de porcs à l’aide de pression contrôle7,9,10,11,12 ou infusion débit taux contrôle13, 17 et de donneurs humains en utilisant la pression de contrôle5,7,14,15. DÉCELLULARISATION de coeurs donneurs humains se produit plus de 4 à 8 jours sous pression contrôlée à 80-100 mmHg à orientation verticale5,15,16 ou plus de 16 jours sous pression contrôlée à 60 mmHg14 . Sous antérograde, DÉCELLULARISATION sous pression contrôlée, la compétence de la valve aortique joue un rôle crucial dans le maintien de l’efficacité de la perfusion coronaire et pression stable à la racine aortique. Nos travaux antérieurs ont révélé que l’orientation du cœur influe sur son efficacité de perfusion coronarienne au cours de la procédure de DÉCELLULARISATION et, par conséquent, l’intégrité de l’échafaudage à la fin9.
Dans le prolongement de notre précédent travail9, nous introduisons un nouveau concept dans lequel une pochette comme péricarde est ajoutée afin d’améliorer ensemble-coeur DÉCELLULARISATION. Nous décrivons la DÉCELLULARISATION de coeurs humains placés à l’intérieur de pochettes sous pression, orientés inversement et sous pression contrôlée à 120 mmHg à la racine aortique. Ce protocole comprend la surveillance de la collection des médias de flux sortant tout au long de la procédure de DÉCELLULARISATION afin d’évaluer l’efficacité de la perfusion coronaire et l’enlèvement des débris cellulaires et le profil d’écoulement. Des épreuves biochimiques sont ensuite effectuées pour vérifier l’efficacité de la méthode.
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Protocol
Toutes les expériences respecté les directives du Comité éthique de l’Institut de cardiologie de Texas.
1. préparation de l’orgue
NOTE : En collaboration avec LifeGift, une organisation des achats sans but lucratif orgue au Texas (http://www.lifegift.org), a fait donnée des cœurs humains ne conviennent pas pour la transplantation ont été utilisés pour la recherche avec consentement approuvé.
- Pour se procurer des coeurs, par voie intraveineuse infuser 30 000 héparine U aux coeurs. Solidement la cardioplégie canule dans l’aorte de suture et fixer une ligne de perfusion fixées. Perforer la veine cave inférieure (VCI) pour évacuer le coeur droit. Couper la veine pulmonaire supérieure gauche ou l’auricule gauche pour évacuer les chambres à gauche du cœur.
- Laisser infuser 1 L de la cardioplégie ou du sérum physiologique hépariné. Disséquer les branches de l’aorte, veine cave supérieure (SVC) et autres veines pulmonaires pour libérer le cœur de toutes les pièces jointes des tissus environnants ou vasculaire. Plongez au cœur bien hépariné dans une solution saline glacé.
- Inspecter le coeur humain donné (aussi bien antérieurement et postérieurement, Figure 1). Placez le coeur sur un plateau de dissection et vérifier si des dommages structurels ou des malformations anatomiques. Si le foie ou des poumons ont été achetés à la transplantation, le coeur peut présenter avec une veine cave inférieure courte et/ou l’absence de paroi postérieure de l’oreillette gauche.
- Effectuer une inspection interne pour d’éventuels vices - communication interauriculaire (ASD), communication interventriculaire (VSD) ou malformation de la valve (aortique, pulmonaire, mitrale, tricuspide).
- S’il présent un défaut septal, corrigez-le avec des sutures (Figure 2 a, 2 b). La correction des défauts septaux est nécessaire pour suivre les progrès de DÉCELLULARISATION via des mesures de turbidité sortie artère pulmonaire (AP). Correction du défaut septal supprime gauche droite shunt, par conséquent, la sortie de PA représente l’écoulement de la circulation coronarienne dans le sinus coronaire.
- Ligaturer la veine cave supérieure et inférieure avec suture de soie de 2-0 (Figure 2).
- Disséquer l’aorte (Ao) loin de la PA principal (Figure 2D) pour canulation ultérieur.
- Insérez les connecteurs, basés sur le diamètre de la cuve, (Figure 3) en Ao et PA et fixez-les avec sutures soie 2-0 (Figure 4 a).
- Insérer une ligne de tuyaux grâce à l’oreillette gauche (Figure 4 b) et vers le ventricule gauche (VG) (Figure 3), en utilisant un des orifices de la veine pulmonaire.
- Se connecter à une ligne de perfusion au connecteur placé dans la zone d’occupation et la ligne de sortie à celle de l’autorité palestinienne (Figure 3).
- Placer le cœur disposé dans une pochette polyester orientation inversée (tête en bas).
- Placez la pochette avec le coeur dans un récipient de perfusion et fermer le couvercle (Figure 4).
- Chacune des lignes se connecter aux ports respectifs dans le bouchon en caoutchouc (basé sur le diamètre du conteneur) et l’insérer dans le couvercle du conteneur perfusion pour sceller la pochette polyester (Figure 4 et Figure 5 b).
- Perfuse de tampon phosphate salin (PBS) (136 mM NaCl, KCl 2,7 mM, 10 mM Na2HPO4 et 1,8 mM KH2PO4 dans l’eau distillée, pH 7,4) de le x 1 via le port de perfusion du bouchon en caoutchouc pour vérifier le débit sortant de l’autorité palestinienne et de la ligne inséré dans LV
- Utilisez ce flux pour nettoyer l’orgue de toute trace résiduelle de sang dans les vaisseaux. Si le débit n’est pas observé, serrer des câbles de raccordement qu’ils pourraient être lâches.
2. système d’installation et de la procédure de DÉCELLULARISATION orgue
- Assembler le bioréacteur et placer dans une orientation verticale (Figure 5). Le système de perfusion comprend un ordinateur personnel (PC), le contrôleur proportionnel-intégral-dérivé (PID), une pompe péristaltique pour perfusion Ao, un bioréacteur de perfusion, un réservoir de tête de pression pour rétention de perfusat LV (bouteille 2L aspirateur avec fond arme de poing) et une pompe péristaltique pour drainer l’excès de liquide dans le conteneur de tête de pression et de percevoir l’écoulement du PA
- Dans le septum en caoutchouc, connectez la ligne d’infusion et pression-tête de ligne, ligne PA-sortie ligne drainant bioréacteur jusqu’aux ports de surface de bouchon en caoutchouc placées sur le bioréacteur de perfusion (Figure 5 a).
- Decellularize coeurs sous pression constante de 120 mmHg, mesurée à la racine aortique. La pression moyenne du VG doit relever de 14 à 18 mmHg pendant tout le processus entier DÉCELLULARISATION.
- Decellularize coeurs comme suit : 4 h de solution hypertonique (500 mM NaCl), 2 h d’une solution hypotonique (20 mM NaCl), 120 h de solution de sodium dodecyl sulfate (SDS de 1 %) et un lavage final avec 120 L de solution de 1 PBS X (Figure 6 a).
- Decellularize les coeurs sous contrôle de la pression constante (120 mmHg). Débit de perfusion en Ao dépend du cœur et est, en moyenne, 98.06±16.22 mL/min pour une solution hypertonique, 76.14±7.90 mL/min pour une solution hypotonique, 151.50±5.76 mL/min pour le SDS et 185.24±7.10 mL/min pour PBS. Le volume total consommé de chaque réactif en moyenne 23.36±5.70 L d’une solution hypertonique et L 9.13±1.26 pour une solution hypotonique.
- Recycler la finale L 60 du SDS de 1 % (1 litre par gramme de poids du coeur) jusqu'à la fin de la perfusion de SDS. Figure 6 a montre un calendrier pour le processus de DÉCELLULARISATION, suscitant des points de terminaison pour la collecte de données : flux de monitorage du rythme (Ao et PA) et la collection de sortie (PA et non-PA) de la tête de pression pendant DÉCELLULARISATION.
- Puisque le SVC et IVC sont ligaturés, il est raisonnable de supposer que tous les fluides recueillis auprès de l’autorité palestinienne sont le résultat de la perfusion coronaire réel (Figure 5 b). Déterminer l’efficacité de la perfusion coronaire en divisant directement le débit du perfusat hors de l’autorité palestinienne par la vitesse d’écoulement de la solution perfusée dans Ao :
Efficacité de la perfusion coronaire =
(%). - Effectuer une analyse comparative du perfusat obtenu de l’autorité palestinienne et le LV et les solutions infusées en double de chargement 200 μL / puits dans une plaque 96 puits à fond transparent et lecture d’absorbance à 280 nm. La valeur d’absorbance, sélectionnée empiriquement après avoir essayé différentes valeurs, a été trouvée pour donner le meilleur normalisé des valeurs.
- Utiliser la turbidité du réactif infusée propre comme le contrôle. La turbidité du perfusat sortant représente l’affouillement des débris cellulaires et peut être quantifiée instantanément pendant DÉCELLULARISATION comme un outil de suivi du processus.
- Pendant le lavage final avec 10 L de solution 1 PBS X, ajouter 500 mL de stérile solution d’acide peracétique 2,1 % neutralisée, neutralisée avec NaOH 10N, menant à une solution acide peracétique à 0,1 % (v/v) dans du PBS. Cette solution permet de stériliser l’échafaud.
(%).3. évaluation des cœurs DECELLULARISE
Remarque : Après DÉCELLULARISATION, représentant coeurs servira pour des dosages biochimiques et d’imagerie angiographie coronarienne.
- Effectuer l’angiographie coronaire du coeur humain DECELLULARISE représentatif d’examiner le caractère intact de la vascularisation coronaire. En bref, à l’aide d’un fluoroscope, image DECELLULARISE coeur humain après injection d’agent de contraste dans une canule ostiale coronaire dans les principales artères coronaires gauche et droite.
- Disséquer le coeur DECELLULARISE pour obtenir des échantillons de 19 régions pour évaluer les restants d’acide désoxyribonucléique (ADN), les glycosaminoglycanes (GAG) et les niveaux SDS dans les tissus DECELLULARISE. Retirer la base du cœur des ventricules et disséquer les ventricules en 4 parties égales (Figure 6). Diviser chaque section dans le ventricule droit antérieur et postérieur (RV), le LV antérieur et postérieur et le septum interventriculaire (IVS). Les tissus contenant l’apex sont disséqué dans le LV et RV pour l’échantillonnage.
- Couper les échantillons de tissus pour des analyses ADN, GAG et le SDS (~ 15 mg de poids humide).
- Extraire l’ADN à double brin (dsDNA) par digestion des échantillons de 1 NaOH M pendant 3 h à 65 ° C et ajuster le pH à 7 à l’aide de tampons de Tris-EDTA (TE) x 10 et 1 M d’acide chlorhydrique (HCl).
- Quantifier l’ADN double brin en utilisant un ADN double brin trousse avec un standard de thymus de veau (voir Table des matières). Lire des échantillons en double à l’aide d’un lecteur de microplaques de fluorescence (excitation à 480 nm et d’émission à 520 nm). Calculer le pourcentage de dsDNA résiduelle dans les coeurs DECELLULARISE en comparant la concentration d’ADN double brin dans chacun des tissus cadavériques (cadavériques %) à celui.
- Obtenir des GAGs sulfatés dans la solution de digestion des échantillons de tissu dans une solution d’extraction papaïne (tampon de phosphate de sodium 0,2 M avec cystéine sel, chlorhydrate de disodium EDTA, acétate de sodium et papaïne) à 65 ° C pendant 3 heures. Mesurer les GAG contenu (en double) en utilisant un Kit de dosage de glycosaminoglycanes.
- Lyophiliser des échantillons pour l’analyse SDS dans une chauffée vide et mesure de poids sec. Ajouter 200 µL d’eau ultrapure à chaque échantillon séché et homogénéiser pour extraire le SDS résiduel en solution. Mélanger cette solution SDS au chloroforme et une solution de bleu de méthylène (12 mg de bleu de méthylène dans 1 L de 0,01 M HCl). Le SDS se sépareront dans la couche organique en se liant à la teinture au bleu de méthylène.
- À l’aide d’un lecteur de microplaques de fluorescence, lire l’absorbance (655 nm) des normes et des échantillons en double exemplaire pour calculer le SDS résiduel. Normaliser cette valeur SDS à poids sec des tissus.
- Échantillons d’image provenant de régions épaisses (c.-à-d., LV, RV et cloison) du coeur humain au microscope optique non linéaire (NLOM) pour confirmer la suppression cellulaire après DÉCELLULARISATION. Le programme d’installation NLOM est détaillée dans nos précédentes publications18,19,20. NLOM nous permet à la cellule d’image, l’élastine, les fibres de collagène et de la myosine à travers ses deux photons fluorescence (TPF) et la deuxième génération d’harmoniques (SHG) chaînes sans utiliser aucune tache ou colorant exogène21.
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Representative Results
Après une DÉCELLULARISATION 7 jours avec perfusion aortique antérograde sous pression constante de 120 mmHg, le cœur de l’homme tourna translucide (Figure 6 b). Le cœur a été grossièrement disséqué en 19 sections pour une analyse biochimique (ADN, GAG et SDS) (Figure 6) pour évaluer le produit final DECELLULARISE.
Tout au long du processus de DÉCELLULARISATION, débit de perfusion de différentes solutions variées que la pression était maintenue constante. Le débit d’eau dans la zone d’occupation (Figure 7 a) est progressivement passée de 96.68±23.54 à 80.59±12.41 mL/min (16,64 %) comme la solution de perfusion remplacée par hypertonique hypotonique. En revanche, débit a augmenté de 71.68±10.63 à 110.61±14.40 mL/min (54,31 %) lorsque la solution de perfusion passe de hypotonique à SDS. Au cours de la perfusion de SDS, débit de perfusion a oscillé entre 110±14.40 et 176.31±44.03 mL/min. Initialement, le taux d’écoulement de PA (Figure 7 b) ont montré une tendance semblable (Figure 7 a). Toutefois, le taux de sortie durant la perfusion de SDS de 1 % est passée de 35.77±9.07 à 27.08±4.09 mL/min. efficacité de perfusion coronaire a été utilisé pour évaluer des tendances similaires ainsi que la perméabilité de la valve aortique. L’efficacité a diminué au fil du temps comme différents réactifs perfusée par le système vasculaire (Figure 7). Au cours de la première heure du 1 lavage X PBS, efficacité de perfusion a été restaurée à la valeur initiale de la solution pré hypotonique (28.39±3.61 % à PBS 1 h vs 31.02±7.16 % 1-h hypotonique). L’efficacité moyenne de perfusion coronaire ont été de 46.08±9.89 %, 28.08±7.12 %, 25.70±5.30 % et 28.39±3.61 % avec une solution hypertonique, la solution hypotonique, 1 % SDS et 1 X PBS, respectivement (Figure 7).
Puisque le perfusat sortant de PA et BT ont été recueillies en même temps, leur contenu de débris puisse être comparés (Figure 8 a) par spectroscopie absorbance mesurée à 280 nm (Figure 8 b). La turbidité de l’eau résiduaire de PA et LV a diminué au fil du temps durant la perfusion de chaque solution ; Toutefois, la turbidité de l’autorité palestinienne ont montré un plus brusque changement de couleur par rapport à celle mesurée de LV au cours de la période de perfusion initiale. Après le passage d’un hypertonique à une solution hypotonique, la turbidité d’écoulement PA changé de 1.15±0.03 à 1.40±0.07 (21,73 % d’augmentation) et de LV passe de 1.13±0.05 à 1.24±0.07 (9,73 % d’augmentation). Au cours de la première heure de perfusion de 1 % SDS, turbidité remplacée par 1.17±0.04 2.77±0.15 (136,75 % d’augmentation) pour PA et 1.11±0.04 à 1.75±0.26 (56,65 % d’augmentation) de l’effluent de LV. La corrélation entre la turbidité de l’écoulement et lavage de débris de cellules a été évaluée à l’aide de l’analyse de protéine bicinchoninic acide (BCA), lorsque la concentration de protéines a été quantifiée dans les échantillons d’écoulement. Les résultats obtenus par la DÉCELLULARISATION de 6 cœurs humains ont révélé une corrélation linéaire entre la concentration de protéines et de la turbidité effluent avec R2 = 0,95 (Figure 8).
A l’issue de son ensemble-coeur DÉCELLULARISATION, l’angiographie coronarienne a confirmé la préservation de la vascularisation coronaire intacte (Figure 9). Imagerie optique non linéaire des couches du myocarde des zones épaisses (c.-à-d., RV, LV et septum) au cœur de l’homme DECELLULARISE a confirmé la suppression de cellules, qu’aucune présence de cellules a été observée dans les canaux de TPF (Figure 10). Cellules (c.-à-d., les cardiomyocytes ou les fibroblastes cardiaques) avec leur autofluorescence peuvent être facilement identifiés dans le canal de TPF par leurs morphologies de forme ovale et allongée. Afin d’assurer l’efficacité des processus de DÉCELLULARISATION et enlèvement de débris cellulaires, le cœur des hommes DECELLULARISE ont été davantage majoré en 19 régions (Figure 6) pour quantifier les niveaux d’ADN, GAGs sulfatés et le SDS restant dans ces régions. ADN dans toutes les régions était inférieur à 10 % du coeur cadavérique. L’ADN dans l’oreillette droite (8.39 à 10,38 % par rapport aux cadavres) et gauche atrium (5,11 % à 7,60 %) était plus élevé (Figure 11 a).
Figure 1 : cadavérique cœur humain d’une Agence d’approvisionnement organ. Vues antérieures et postérieures du cœur humain provenant de cadavres. Veine cave inférieure et une partie de l’oreillette droite sont manquants, comme observé dans la région en pointillés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Inspection pour septal et/ou des anomalies anatomiques des soupapes. (A) vérifier si foramen ovale perméable (FOP) est présent (communication entre l’oreillette droite et gauche). (B) une suture en polypropylène 5-0 est appliquée de façon continue pour fermer le FOP. (C) l’oreillette droite est fermée par une suture en cours d’exécution en polypropylène 5-0. (D) l’artère pulmonaire principale ait été découpé loin de l’aorte ascendante par une dissection émoussée. FO : foramen ovale perméable ; PA : l’artère pulmonaire ; AO : aorte. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : composants du bioréacteur perfusion. Le système de DÉCELLULARISATION est composé du bouchon en caoutchouc (A) avec 4 ports ; Ligne de sortie (B) pour vous connecter à l’artère pulmonaire (AP) ; (C, F) connecteurs luer-lock pour PA et l’aorte (Ao), (D) repère d’insertion pour le ventricule gauche (VG), infusion (E) line pour être connecté à l’aorte, pochette polyester (G) et (H) Perfusion conteneur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Assemblée de coeur humain canulation et infusion de bioréacteur. (A) vue antérieure du cœur montrant l’artère pulmonaire (AP) et l’aorte (Ao) canulé individuellement. (B) vue postérieure du coeur montrant la canule dirigées vers le ventricule gauche (VG) par l’intermédiaire de veines pulmonaires (PV). (C) le coeur humain à l’intérieur le bioréacteur de perfusion après le montage. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : configuration du système d’inversé DÉCELLULARISATION orientée avec tête de pression. (A) le système de DÉCELLULARISATION complet se compose de : un ordinateur, un régulateur proportionnel-intégral-dérivé (PID), pompes, un bioréacteur et réservoirs destiné à recueillir l’effluent de l’artère pulmonaire (AP) et le ventricule gauche (VG). AO : aorte. Les flèches indiquent la direction du flux. (B) le schéma de l’installation du cœur humain à l’intérieur de bioréacteur de perfusion et les chemins d’écoulement associé du perfusat/effluent pendant DÉCELLULARISATION. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : représentation schématique de la DÉCELLULARISATION procédure DÉCELLULARISATION après un examen et d’un cœur humain. (A) schéma de la procédure de DÉCELLULARISATION. (B) antérieure et postérieure examen d’un cœur humain DECELLULARISE. (C) brut : dissection d’un coeur humain en quatre sections (section A à la section D) pour l’analyse du dosage biochimique. La coloration dans le cœur humain est causée par des dépôts résiduels lipofucin. La coloration est normalement présente dans la surface ventriculaire interne ou la limite entre épicarde et myocarde. LA : oreillette gauche ; RA : oreillette droite ; LV : ventricule gauche ; RV : ventricule droit ; Ant : antérieure ; Message : postérieur ; Hyper : hypertonique ; Hypo : hypotonique ; SDS : sodium dodécyl sulfate ; PBS : solution saline tamponnée au phosphate. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : dynamique de l’écoulement accéléré pendant DÉCELLULARISATION. (A) débit de perfusion de solutions DÉCELLULARISATION dans l’aorte au cours de la procédure. (B) débit des effluents de PA pendant DÉCELLULARISATION. (C) l’efficacité de la perfusion coronaire pendant DÉCELLULARISATION. (D) signifie efficacité de perfusion coronaire pendant la perfusion de solutions/réactifs différents. N = 6. Les données représentent ±SEM. PA : artère pulmonaire ; Hyper : hypertonique ; Hypo : hypotonique ; SDS : sodium dodécyl sulfate ; PBS : phosphate buffered saline ; SEM : erreur-type de la moyenne. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : lavage de débris cellulaires Time-lapse pendant DÉCELLULARISATION. Collection de médias de sortie (A) de PA et non-PA (ventricule gauche). (B) résultat d’une mesure de la turbidité à 280 nm. (C) il existe une corrélation linéaire entre la turbidité et la concentration de protéines. n = 6 coeurs humains. Le contrôle était DÉCELLULARISATION propre solution. Les données représentent ±SEM. PA : artère pulmonaire ; Hyper : hypertonique ; Hypo : hypotonique ; SDS : sodium dodécyl sulfate ; SEM : erreur-type de la moyenne. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : angiographie coronaire du coeur humain DECELLULARISE confirme la perméabilité thevascular après DÉCELLULARISATION. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 10 : Images obtenues à l’aide de la microscopie optique non linéaire du myocarde cadavérique et DECELLULARISE ne montrent aucune présence de cellules (c.-à-d., les cardiomyocytes ou les fibroblastes cardiaques) avec des morphologies de forme ovale ou allongée dans la DECELLULARISE LV, RV et cloison. LV : gauche ventricule ; RV : ventricule droit ; TPF : fluorescence de deux photons ; SHG : génération de seconde harmonique. Certaines cellules cardiaques sont indiqués par des flèches. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 11 : résultats du dosage biochimique. (A) restants de l’ADN par rapport au cœur provenant de cadavres dans les tissus DECELLULARISE. (B) restant GAG par rapport au cœur provenant de cadavres dans les tissus DECELLULARISE. (C) le SDS reste dans les tissus DECELLULARISE. n = 6 coeurs humains. Les données représentent ±SEM. LA : gauche atrium ; RA : oreillette droite ; LV : ventricule gauche ; RV : ventricule droit ; Ant : antérieure ; Message : postérieur ; SDS : sodium dodécyl sulfate ; SEM : erreur-type de la moyenne. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Méthode | Pro | Con |
| Perfusion de Langendorff verticale classique | · Facile d’accès au cœur de réparer pendant DÉCELLULARISATION | · Contraintes excessives sur l’aorte en raison du poids du coeur |
| · Débit de perfusion élevée durant la perfusion de SDS sous le contrôle de la pression constante | ||
| · Efficacité de la perfusion coronaire basse durant la perfusion de SDS | ||
| · La portion de l’artère aorte/pulmonaire au-dessus de ligne de ligature de canule pouvait obtenir déshydratée et facilement contaminée | ||
| Perfusion de Langendorff inversée à l’intérieur d’une poche sous pression | · Réduire au minimum la contrainte exercée sur l’aorte en raison du poids du coeur | · Difficile d’accès au cœur si la réparation est nécessaire. |
| · Débit de perfusion faible durant la perfusion de SDS sous le contrôle de la pression constante | ||
| · Amélioration de l’efficacité de la perfusion coronaire pendant la perfusion de SDS | ||
| · Aucun tissus ne vont être séchés puisque le coeur entier est submergé/hydraté. |
Tableau 1 : Un résumé des avantages et inconvénients de DÉCELLULARISATION ensemble-coeur l’utilisation conventionnelle perfusion verticale vs inversé Langendorff perfusion à l’intérieur d’une poche sous pression.
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Discussion
À notre connaissance, c’est la première étude à DÉCELLULARISATION rapport inversé de cœurs humains à l’intérieur d’une poche sous pression avec Time-lapse suivi de l’enlèvement des débris débit taux et cellules. La pochette du péricarde-comme conserve l’orientation du cœur stable tout au long de la procédure de DÉCELLULARISATION. Immerger et inversant les cœurs entiers à l’intérieur d’une poche empêche la déshydratation et minimise les contraintes excessives sur l’aorte (à partir du poids du coeur) où par rapport à la classique verticale Langendorff perfusion DÉCELLULARISATION méthode9. Ceci, à son tour, conserve la compétence de la valve aortique.
Pour obtenir une efficacité maximale DÉCELLULARISATION, résistance vasculaire coronaire doit être faible pour assurer une perfusion adéquate et cohérente du fluide à travers le myocarde ensemble. Dans le modèle de DÉCELLULARISATION ensemble-coeur à l’aide de perfusion rétrograde, le liquide s’accumule dans les ventricules et élève la pression intraventriculaire, qui, à son tour, augmente la résistance vasculaire coronaire et limite l’écoulement des fluides. Même si la valve aortique est intacte, la cavité ventriculaire remplit secondaire à une fuite de physiologique et à son tour comprime la paroi ventriculaire.
Notre technique de decellularizing un coeur à l’intérieur d’une poche sous pression est destiné à atténuer ce problème et augmenter l’efficacité de DÉCELLULARISATION. Une pression de 120 mmHg à la racine aortique et 14 mmHg dans la poche est maintenue tout au long du processus de DÉCELLULARISATION. Ces valeurs de pression sont très proches des limites physiologiques (80-120 mmHg dans l’aorte) et 15 mm Hg pour la pression télédiastolique ventriculaire gauche22. Selon Murthy et al. 23, le débit sanguin myocardique taux s’étend de 0,61 à 1,10 mL/min/g et le cœur humain poids24,25 est environ 245 à 308 g ; par conséquent, le débit coronaire physiologique est d’environ 149,45 à 338.80 mL/min, mais dépend du poids du coeur. Notre taux d’écoulement de PA variait de 20 à 50 mL/min, ce qui est inférieur à la valeur du débit coronaire physiologiques et pouvaient être dues à des situations différentes 2 : 1) la perfusion de solutions au coeur de produire un oedème et il est aussi normal anatomiques drainage du système coronaire à la cavité du ventricule gauche ; 2) comme la DÉCELLULARISATION se produit, liquide est également perdue à travers les murs DECELLULARISE en raison d’un accroissement naturel de leur perméabilité. Cette différence de pression empêche l’effondrement des vaisseaux et leur permet de rester brevet. En outre, ce système maintient le cœur dans des conditions anatomiques relatives sans comprimer la paroi myocardique, qui augmenterait la résistance vasculaire coronaire et nuire à la circulation intravasculaire des solutions DÉCELLULARISATION. Le profil de vitesse de flux perfusion du cœur humain (Figure 7 a) est très similaire à ce que nous avons observé dans nos DÉCELLULARISATION inversée de9de coeur de porc, avec le plus bas taux de débit de perfusion survenant pendant la perfusion hypotonique et une légère augmentation de flux de taux (110.61±14.40 mL/min à 176.31±44.03 mL/min) survenant pendant la perfusion de SDS de 1 %. Notre débit de perfusion (valeur moyenne = 151.50±3.71 mL/min) pendant 1 % SDS perfusion était comparable, ou même inférieure à celle de DÉCELLULARISATION coeur humain rapportée par Guyette et al. 14 cependant, notre méthode est effectuée avec controle de pression de 120 mmHg et leur méthode utilisée 60 mmHg. Cette différence de pressions de perfusion suggère une efficacité supérieure de fermeture de la valve aortique dans notre technique puisqu’un débit de perfusion inférieur pourrait maintenir une pression plus élevée. Une autre possibilité est que l’augmentation de la résistance coronaire était due à la pression à l’intérieur de la pochette 14 mmHg. En outre, notre méthode de coeur humain montre une tendance similaire de diminution de la perfusion coronaire efficacité (~ 30 %, chiffre 7, 7D) de hyper au remplacement de la solution hypotonique par rapport à notre DÉCELLULARISATION coeur porcine inversé (~ 10 % en inversé orientation9contre 1 à 2 % en orientation verticale). Toutefois, cette nouvelle méthode pourrait préserver l’efficacité de la perfusion coronaire pendant la perfusion de SDS comparable à une perfusion de solution et semble donc supérieure à notre méthode préalable d’inversion de l’échantillon. Le tableau 1 répertorie les avantages et inconvénients de perfusion verticale conventionnel vs inversé Langendorff perfusion à l’intérieur d’une poche sous pression.
En plus de la vitesse d’écoulement, suivi de turbidité de sortie pourrait être un autre outil utile pour évaluer l’efficacité et le progrès de DÉCELLULARISATION. Au cours de DÉCELLULARISATION, turbidité de l’eau résiduaire de l’autorité palestinienne était supérieure à celui de l’effluent provenant de sites non-PA (Figure 8 b). Ceci suggère que la plupart de la perfusé solution traversait la vascularisation pour DÉCELLULARISATION « correcte ». Mais pour que cela soit valable, il faut ce qui suit : Chambre des shunts, ou la perméabilité de la valve aortique. Une inspection attentive et minutieuse est donc nécessaire pour prévenir une défaillance de la méthode en raison d’irrégularités anatomiques. Le profil de turbidité (Figure 8 b) du processus DÉCELLULARISATION tout coeur démontrée des tendances similaires comme précédemment indiqué, avec changement de turbidité brusque au cours de la période de transition initiale des différents perfusats9.
Un objectif principal pour les tissus DECELLULARISE doit être en mesure de les repeupler avec des cellules et de réaliser des fonctionnalités, de prolifération, de maturation et de fixation des cellules haute. Nos tissus DECELLULARISE ont été cellularized avec succès pour diverses applications26,27, où les tissus ont été cellularized avec succès et atteint thrombogénicité inférieure. Dans nos analyses biochimiques des cœurs humains DECELLULARISE, nous avons évalué 19 régions avec des épaisseurs de tissus différents. L’ADN et le SDS dans les tissus DECELLULARISE varient, avec la valeur la plus élevée obtenue dans l’oreillette droite et gauche. Cela pourrait être causé par l’orientation du cœur dans une configuration inversée, dans laquelle les débris cellulaires était coincé au fond de la poche ou où des pressions externes réduction du flux. DÉCELLULARISATION perfusion s’appuie sur les structures coeur intact, y compris les affluents et les coronaires intacts. Que ces organes sont achetés auprès de donneurs d’organes multiples, ces âmes ont généralement une grande partie de leurs oreillettes supprimé. Lors de la préparation de ces organes et la réparation de la paroi de l’oreillette, il y avait rupture dans l’irrigation de ces régions, mettre en péril l’écoulement des solutions DÉCELLULARISATION. Pour DÉCELLULARISATION non perfusion cardiaque, autres groupes de recherche ont signalé 2-6 % d’ADN restes en rat28, porcine29,30 et humaine31 contre coeur cadavérique respectif. Cependant, ils ont utilisaient de gel-dégel28,29,30, enzyme29,de sérum et30 31 dans leur protocole de DÉCELLULARISATION, susceptible d’endommager l’ECM à un degré supérieur à notre technique axée sur la perfusion. Il sera essentiel de développer des méthodes pour traiter adéquatement ces restrictions.
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Disclosures
Dr Taylor est le fondateur et actionnaire de Miromatrix Medical, Inc. Cette relation est gérée conformément aux conflits d’intérêts politiques de l’Université du Minnesota et le Texas Heart Institute ; les autres auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par l’octroi de fonds de dotation de Houston et le Texas Emerging Technology Fund. Les auteurs remercient l’Agence d’approvisionnement orgue LifeGift, Inc. et la famille du donateur pour la réalisation de cette étude.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-0 silk suture | Ethicon | SA85H | Suture used to ligate superior and inferior vena cava |
| 1/4" x 3/8" connector with luer | NovoSci | 332023-000 | Connect aorta and pulmonary artery |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer | HV-96410-16 | Tubing to connect heart chambers/veins |
| infusion and outflow line | Smiths Medical | MX452FL | For flowing solutions through the vasculature |
| Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches) | Fisher scientific | 01-812-17 | Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization |
| Snapware Square-Grip Canister | Snapware | 1022 | 1-liter Container used for perfusing heart |
| Black rubber stoppers | VWR | 59586-162 | To seal the perfusion container |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | 881003 | To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids |
| 2 L aspirator bottle with bottom sidearm | VWR | 89001-532 | For holding solutions/perfusate |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | For quantifying dsDNA |
| Calf thymus standard | Sigma | D4522 | DNA standard |
| Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit | Biocolor Ltd | Blyscan #B1000 | GAG assay kit |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 Pro | For analytical assays |
| GE fluoroscopy | General Electric | OEC 9900 Elite | Angiogram |
| Visipaque | GE | 13233575 | Contrast agent |
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