Summary
Bu yöntem, decellularization karmaşık bir solid organ ozmotik şok ve perfüzyon en az organ matris bozulma ile iyonik deterjan dayalı basit bir protokol kullanarak sağlar. Gerçek zamanlı akış dinamiği ve hücresel enkaz çıkış izleme ile basınçlı bir kese içinde insan kalpleri bir roman decellularization tekniği oluşmaktadır.
Abstract
Organ nakli son aşama kalp yetmezliği olan hastalar için nihai çözümdür. Ama donör kalp sınırlıdır, immünosupresyon gereklidir ve sonuçta ret oluşabilir. Bir işlev oluşturma, otolog biyo-yapay kalp bu sorunları çözebilir. Biofabrication, iskele ve hücreleri oluşur bir kalp bir seçenektir. Doku özel kompozisyon yanı sıra mikro ve makro mimarisi ile doğal bir iskele insanlar ya da domuz gibi büyük hayvanlar tarafından decellularizing kalpler elde edilebilir. Decellularization ise 3D hücre dışı matriks ve damarlara koruyarak ve "cellularization" daha sonra bir timepoint sağlayan hücresel enkaz yıkama içerir. O perfüzyon decellularization karmaşık organları bulmak bizim romanından büyük harfe çevirmeyi mümkündür, transplantable insan kalpleri bir ters içinde basınçlı bir kese içinde yerleştirerek decellularize için daha fazla bir "fizyolojik" yöntemini geliştirdik Yönlendirme, kontrollü baskı altında. Basınçlı bir kese kullanılmasının amacı kapalı ve miyokard perfüzyon geliştirmek tutmak aort kapak arasında basınç gradyanları oluşturmaktır. Akış dinamiği ve hücresel enkaz kaldırma sırasında bize sıvı giriş akımı ve enkaz çıkış akışı izlemek izin decellularization eşzamanlı değerlendirilmesi, böylece olabilir bir iskele oluşturmak basit kardiyak onarım için kullanılan (Örneğin bir yama olarak veya Vana iskele) veya bir bütün-organ iskele olarak.
Introduction
Yüksek mortalite hastalarda kalp yetmezliği yol açar. Allo-nakli son aşama kalp yetmezliği için nihai tedavi seçeneğidir. Ancak, donör organ sıkıntısı nedeniyle nakli için uzun bir bekleme listesi ve hastalar yüz nakli sonrası ömür boyu immünosupresyon arasında değişen kronik organ ret1,2Engelli. Decellularized insan ölçekli mavi kalpler olan bir hastanın kendi kullanıma tarafından Biyomühendislik fonksiyonel kalp hücreleri bu Engelli3aşmak.
Önemli bir adım "mühendislik", uygun vasküler ve parenkimal yapısı, kompozisyon ve hizalama kılavuzunu fonksiyonu ile bir iskele oluşturulması ve organizasyon teslim edilen hücre kullanılan bir kalptir. Uygun çerçeve varlığında, iskele üzerinde seribaşı hücreleri çevreyi tanımak ve bu organ bir parçası olarak beklenen işlevi gerçekleştirmek gerekir. Bize göre ideal iskele gerekli özellikleri decellularized organ hücre dışı matriks (dECM) oluşur.
İçsel damarlara kullanarak, karmaşık bütün-organ decellularization antegrade veya hassas 3D hücre dışı matriks ve damarlara2koruyarak hücresel bileşenleri kaldırmak için retrograd perfüzyon4 üzerinden elde edilebilir, 5,6,7. Vivo, besin dağıtım ve atık kaldırma8için olduğu gibi fonksiyonel damarlara Biyomühendislik tüm organlarda sadece önemlidir. Koroner perfüzyon decellularization fareler4veya domuz4,7,9,10,11 decellularized kalpler yaratmada etkili olduğu kanıtlanmıştır ,12,13ve insanlar5,7,14,15,16. Henüz, vanalar, kulakçık ve "ince" diğer bölgeler bütünlüğünü muzdarip olabilir.
İnsan boyutunda decellularized kalp iskele basınç kontrol7,9,10,11,12 veya infüzyon akış hızı Denetim13, kullanarak domuz elde edilebilir 17 ve basınç kullanarak insan bağışçılardan5,7,14,15kontrol. İnsan donör kalplerin decellularization 4-8 gün içinde 80-100 mmHg dik yönlendirme5,15,16 ya da 16 gün boyunca 60 mmHg14 , kontrollü baskı altında kontrollü baskı altında oluşur . Antegrade altında decellularization, basınç kontrollü aort kapak yetkinlik koroner perfüzyon verimlilik ve aortik kökü sabit basınçta korumada önemli bir rol oynar. Önceki çalışmalarımız kalp yönünü decellularization yordam ve bu nedenle iskele bütünlük içinde son9sırasında koroner perfüzyon verimliliğini etkiler ortaya koydu.
Bizim önceki iş9devamı olarak, biz bütün-kalp decellularization geliştirmek için bir kalp zarını benzeri kese onda eklendi bir roman kavramı tanıtmak. Biz ters odaklı, basınçlı torbalar içinde ve aortik kök 120 mmHg, kontrollü baskı altında yerleştirilen insan gönül decellularization açıklar. Bu iletişim kuralı akışı profil ve koroner perfüzyon verimliliği ve hücre enkaz kaldırma değerlendirmek için decellularization yordam boyunca dışa akış ortamlarının topluluğu izleme içerir. Biyokimyasal deneyleri sonra yönteminin etkinliğini test etmek için gerçekleştirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler Etik Komitesi yönergelere Teksas Kalp Enstitüsü'nden yapıştırılır.
1. organ hazırlık
Not: LifeGift, Texas (http://www.lifegift.org), kar amacı gütmeyen organ tedarik organizasyon ile işbirliği hibe insan kalp nakli için uygun değildir araştırma onaylı izni ile kullanılmaya başlanmıştır.
- Kalpler temin etmek, intravenöz kalpleri için 30.000 U heparin süzülür. Güvenli bir şekilde aort Minikardiyopleji yöntemi kanül dikiş ve bir klempe perfüzyon çizgi ekleyin. İnferior vena kava (sağ kalbe boşaltmaya IVC) sorgulamaktı. Sol üst pulmoner ven veya kalbin sol Odalar havalandırma için sol atriyal apendiks keser.
- Minikardiyopleji yöntemi veya heparinized tuz 1 litre süzülür. Aort şubeleri, üstün vena kava (SVC) ve vasküler veya çevreleyen doku ekleri yürekten serbest bırakmak için diğer pulmoner damarlar incelemek. Buzlu tuzlu çözüm iyi heparinized kalbinde daldırın.
- Bağışlanan insan kalbi inceleyin (anteriorly ve özafagusu, Şekil 1). Kalp parçalanmış bir tepsiye yerleştirin ve herhangi bir yapısal hasar veya anatomik malformasyonlar için orijinal olup. Eğer karaciğer ve/veya akciğer nakli için tedarik, kalp bir kısa inferior vena kava ve/veya sol atriyal posterior duvar yokluğu ile takdim edebilir miyim?
- İç kontrol için olası hataları - atriyal septal defekt (ASD), ventriküler septal defekt (VSD) veya vana (aort, akciğer, mitral, triküspit) malformasyonu edin.
- Septal defekt varsa, uygun dikiş (Şekil 2A, 2B) ile düzeltin. Septal defektlerde düzeltilmesi ile pulmoner arter (PA) çıkış bulanıklık ölçüm decellularization ilerlemesini izlemek için gereklidir. Sola doğru şant septal defekt düzeltilmesi kaldırır, dolayısıyla, PA çıkım temsil eder çıkış koroner dolaşım koroner sinüs yoluyla gelen.
- Superior ve inferior vena kava 2-0 ipek sütür (Şekil 2C) ile ligate.
- Aort (Ao) sonraki cannulation için ana PA (Şekil 2B) uzak incelemek.
- Bağlayıcılar, Ao ve PA gemi (Şekil 3) çapı göre eklemek ve onları ile 2-0 ipek sütür (Şekil 4A) güvenli.
- Pulmoner ven deliklerini birini kullanarak bir boru hattı (Şekil 4B) sol atrium ve sol ventrikül (LV) (Şekil 3), doğru yerleştirin.
- Bir infüzyon hattı Ao ve PA (Şekil 3) bir çıkış hattına yerleştirilen konektörüne bağlayın.
- Hazırlanan kalp (ters) ters yönde polyester bir kese içine koyun.
- Kalp ile kese bir perfüzyon konteyner içine yerleştirin ve kapağı (Şekil 4 c) kapatın.
- Her satır (kapsayıcı çapı göre) kauçuk tıpa ilgili bağlantı noktalarına bağlanmak ve polyester kese (Şekil 4 c ve Şekil 5B) imzalamaya perfüzyon konteyner kapağı takın.
- 1 x tamponlanmış fosfat serum (PBS) (136 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 ve 1.8 mM KH2PO4 ' te distile su, pH 7,4) çıkış PA ve satırından doğrulamak için kauçuk tıpa infüzyon portundan sıvı LV. eklenen
- Bu akış damarlara kan herhangi bir kalıntı izleri organı temizlemek için kullanın. Akış gözlem değil yapılırsa, gevşek olarak bağlantı çizgileri sıkın.
2. sistem kurulumu ve Organ Decellularization yordamı
- Biyoreaktör montaj ve bir dik yönde (Şekil 5) yerleştirin. Perfüzyon sistemi içerir bir kişisel bilgisayar (PC), oransal-integral-türev (PID) denetleyicisi, Ao infüzyon için peristaltik pompa, perfüzyon biyoreaktör, LV perfusate saklama (2L aspiratör şişeyle alt basınç baş kapsayıcısı Tabancan) ve peristaltik pompa basınç baş konteyner üzerinden fazla sıvıyı ve çıkış PA toplamak için
- Kauçuk septum perfüzyon biyoreaktör (Şekil 5A) üstüne yerleştirilmiş kauçuk kapak yüzey bağlantı noktalarına infüzyon çizgi, basınç-kafa çizgi, PA-çıkış hattı ve biyoreaktör drenaj hattı bağlayın.
- Kalpler 120 mmHg aort kökünde ölçülen sürekli baskı altında decellularize. Ortalama basınç LV 14-18 mmHg bütün decellularization sürecinde içinde olmalıdır.
- Kalpler aşağıdaki gibi decellularize: hipertonik çözüm (500 mM NaCl), Hipotonik çözüm (20 mM NaCl), Sodyum Lauryl Sülfat (%1 SDS) çözüm, 120 h 2 h 4 h ve son yıkama 1 X PBS (Şekil 6A) 120 L ile.
- Kalpler sabit basınç kontrol (120 mmHg) altında decellularize. İnfüzyon akış hızı Ao içine kalp bağımlı olup, ortalama olarak, 98.06±16.22 mL/dk'ya hipertonik çözüm, 76.14±7.90 mL/dk'ya hipotonik eriyik, 151.50±5.76 mL/dk'ya SDS ve 185.24±7.10 mL/dk'ya PBS. Her reaktif tüketilen toplam hacmi hipertonik çözüm için 23.36±5.70 L ve 9.13±1.26 L hipotonik eriyik için ortalamasını alır.
- % 1 SDS (kalp ağırlığının gram başına 1 L) son 60 L SDS perfüzyon sonuna kadar recirculate. Şekil 6A gösterir zaman çizelgesi decellularization işlemi için veri toplama için bitiş noktalarını alabilme: akış hızı (Ao ve PA) izleme ve çıkış koleksiyonundan (PA ve sigara-PA) baskı kafası decellularization sırasında.
- SVC ve IVC bakmaksızın, varsaymak makul çünkü tüm sıvı PA toplanan gerçek koroner perfüzyon (Şekil 5B) sonucudur. Koroner perfüzyon verimliliği doğrudan perfusate PA dışarı akış hızı tarafından infüzyon çözüm akış hızı Ao bölerek belirleyin:
Koroner perfüzyon verimliliği =
(%). - PA ve LV ve yinelenen infüzyon çözümlerinde açık alt 96-şey plaka bir kuyu başına 200 μL yükleme ve 280 absorbans okuyarak elde perfusate karşılaştırmalı analizi gerçekleştirmek nm. Ampirik olarak farklı değerler, denedikten sonra seçilen absorbans değeri en iyi vermek için değerleri normalleştirilmiş bulundu.
- Temiz infüzyon reaktif bulanıklık denetimi olarak kullanın. Çıkış perfusate bulanıklık hücre artıkları fiyasko temsil eder ve anında decellularization sırasında işlem izleme aracı olarak sayılabilir.
- 1 X PBS 10 L ile son yıkama sırasında 500 mL %0,1 Perasetik asit çözeltilerine (v/v) PBS önde gelen 10N NaOH ile etkisiz hale steril etkisiz % 2.1 Perasetik asit çözeltisi, ekleyin. Bu çözüm iskele sterilize etmek için kullanın.
(%).3. Decellularized kalpler değerlendirilmesi
Not: decellularization sonra temsilcisi kalp koroner anjiyo görüntüleme ve biyokimyasal testleri için kullanılır.
- Koroner anjiyografi koroner damarlara intactness incelemek için temsilcisi decellularized insan kalbinin gerçekleştirin. Kısaca, bir fluoroskop kullanarak, görüntü insan kalbi enjeksiyon kontrast ajanın ana sağ ve sol koroner arterler koroner ostial kanül aracılığıyla sonra decellularized.
- Kalan Deoksiribonükleik asit (DNA), glikozaminoglikan (GAG) ve SDS düzeyleri decellularized dokularda değerlendirmek için 19 alanları örnekleri almak için decellularized kalp incelemek. Tabanı kalbin ventrikül kaldırın ve ventrikül 4 eşit bölüme (Şekil 6C) incelemek. Her bölümün anterior ve posteiror sağ ventrikül (RV), anterior ve posteiror LV ve interventricular septum (serum) bölün. Tepe içeren doku içine belgili tanımlık LV ve RV örnekleme için kesmiştim.
- Doku örneği DNA, GAG ve SDS deneyleri (~ 15 mg ıslak ağırlık) için kesti.
- 3 h 65 ° c için 1 M NaOH örneklerinde sindirerek tarafından çift iplikçikli DNA (dsDNA) ayıklamak ve pH 7-10 x Tris-EDTA (TE) tampon ve 1 M hidroklorik asit (HCl) kullanımı için ayarlayın.
- Bir buzağı timus standart bir dsDNA tahlil seti kullanarak dsDNA ölçmek ( Tablo malzemelerigörmek). Bir Floresan Mikroplaka Okuyucu kullanarak yinelenen örnekleri okumak (uyarma 480 nm ve emisyon, 520 nm). Kadavra (% kadavra) o her dokusunda dsDNA konsantrasyon karşılaştırarak decellularized kalplerinde kalan dsDNA yüzdesini hesaplamak.
- Sülfürlü GAGs doku örnekleri bir çözümde papain ayıklama (EDTA disodyum tuz, sistein HCl ile 0.2 M sodyum fosfat tampon, sodyum asetat ve papain) 65 ° C'de 3 saat sindirerek tarafından çözüm elde edilir. GAG içeriğinde (yinelenen) glikozaminoglikan tahlil Kit kullanarak ölçün.
- SDS tahlil içinde ısıtmalı bir vakum ve ölçü Kuru ağırlık için örnekleri lyophilize. Kurutulmuş örnekleri 200 µL ultrasaf su ekleyin ve kalan SDS çözümde ayıklamak için homojenize. Bu SDS Çözüm kloroform ve metilen mavisi çözüm (metilen mavisi 0.01 M HCL 1 L 12 mg) karıştırın. SDS metilen mavisi boya bağlama yaparak organik katmanda ayrı olacak.
- Bir Floresan Mikroplaka Okuyucu kullanılarak okunan absorbans (655 nm) standartları ve kalan SDS hesaplamak için yinelenen örnekleri. Bu doku Kuru ağırlık SDS değerine normalleştirmek.
- Örnek bölgelerinden kalın (Yani, LV, RV ve septum) decellularization sonra hücresel kaldırma işlemini onaylamak için doğrusal olmayan optik mikroskobu (NLOM) ile insan kalbi. NLOM kurulum bizim önceki yayınları18,19,20içinde detaylı. NLOM bize görüntü hücre, elastin, kollajen ve myosin lifleri onun iki fotonlu Floresan (TPF) ve ikinci harmonik üretimi (SHG) kanalları aracılığıyla herhangi bir eksojen leke veya boya21kullanmadan sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
120 mmHg, sürekli baskı altında antegrade aort perfüzyon ile 7 gün decellularization sonra insan kalbi yarı saydam (Şekil 6B) döndü. Kalp fena halde biyokimyasal (DNA, GAG ve SDS) Analizi (Şekil 6Cson decellularized ürün değerlendirmek için) için 19 bölümlere disseke.
Decellularization süreci boyunca infüzyon debisi basınç çeşitli farklı çözümleri sabit tutuldu. Akış hızı Ao yavaş yavaş 96.68±23.54 80.59±12.41 mL/dk (%16.64) perfüzyon çözüm olarak azalmıştır (Şekil 7A) içine hipertonik hipotonik için değişti. Buna ek olarak, debi ne zaman perfüzyon çözüm hipotonik SDS için değişik 110.61±14.40 mL/dk (%54.31) 71.68±10.63 arttı. SDS perfüzyon sırasında infüzyon akış hızı 110±14.40 ve 176.31±44.03 mL/dk arasında dalgalanma. Çıkış hızı PA (Şekil 7B) başlangıçta (Şekil 7A) benzer bir eğilim gösterdi. Ancak, çıkış oranı % 1 SDS perfüzyon 35.77±9.07 27.08±4.09 mL/dk. koroner perfüzyon verimliliği azalmıştır sırasında aort kapak açıklık ve benzer eğilimleri değerlendirmek için kullanıldı. Zamanla farklı reaktifler damarlara (Şekil 7C) periosteum olarak verimliliği azalmıştır. 1 X PBS yıkama ilk saat içinde perfüzyon verimliliği özgün önceden hipotonik eriyik değerine geri yüklendi (1-h PBS %28.39±3.61 %31.02±7.16 1-h hipotonik, a ). %46.08±9.89, %28.08±7.12, %25.70±5.30 ve %28.39±3.61 hipertonik çözüm, Hipotonik eriyik, % 1 SDS ve 1 X PBS, ortalama koroner perfüzyon verimliliği idi (Şekil 7 d).
Çıkış perfusate PA ve LV aynı anda toplanan, enkaz içeriklerini olabilir (Şekil 8A) 280 ölçülen absorbans spektroskopisi ile karşılaştırıldığında nm (Şekil 8B). PA ve LV atık bulanıklık perfüzyon her çözümün sırasında zamanla azaldı; Ancak, bulanıklık PA daha ani bir renk değişikliği ile karşılaştırıldığında LV başlangıç perfüzyon dönemde gözlenen gösterdi. Hipotonik eriyik için hipertonik geçtikten sonra 1.15±0.03 1.40±0.07 (%21.73 artış) için değiştirilmiş PA çıkış ve LV bulanıklık 1.24±0.07 (%9.73 artış) 1.13±0.05 değişti. % 1 SDS perfüzyon ilk saat içinde bulanıklık PA ve 1.11±0.04 için 1.75±0.26 (%56.65 artış) LV atık için 2.77±0.15 (%136.75 artış) 1.17±0.04 değişti. Çıkış bulanıklık ve hücre enkaz silinerek geçiş arasındaki korelasyon protein konsantrasyonu çıkım örneklerinde sayısal bicinchoninic asit (BCA) protein tahlil kullanılarak değerlendirilmiştir. 6 insan gönül decellularization elde edilen sonuçları protein konsantrasyonu ve R2 atık bulanıklık arasında doğrusal bir ilişki ortaya 0,95 (ekil 8 c) =.
Bütün kalp decellularization tamamlanmasından sonra koroner anjiyo sağlam koroner damarlara (Şekil 9) korunması doğruladı. Herhangi bir hücre varlığı TPF kanalları (Şekil 10) gözlendi olarak kalın yerlerde (Yani, RV, LV ve septum) decellularized insan kalbi katmanlardan Miyokardiyum doğrusal olmayan optik görüntüleme hücre kaldırma, doğruladı. Hücreleri (Yani, cardiomyocytes veya kardiyak fibroblastlar) onların autofluorescence ile kolayca TPF kanalda onların oval ve uzun şekil türleri morfoloji tarafından tespit edilebilir. Decellularization süreci ve hücresel enkaz kaldırma etkinliğini sağlamak için decellularized insan kalpleri daha fazla DNA, sülfürlü GAGs ve bu bölgelerde kalan SDS düzeylerini ölçmek için 19 bölgeleri (Şekil 6C) hasılat. Tüm bölgelerde DNA kadavra kalbi az % 10 idi. DNA sağ atrium (8,39 %10,38 - kadavra göre) ve sol atrium (5,11 %7.60-) en yüksek (Şekil 11A) yapıldı.
Şekil 1: kadavra kalbi bir organ tedarik Ajansı. Anterior ve posteiror görünümlerini kadavra insan kalbi. İnferior vena kava ve sağ kulakçık bölümünü kesikli bölgede gözlemlediği gibi eksik. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: kontrol için septal ve/veya anatomik anomaliler Vana. (A) kontrol patent deliği ovale (PFO) ise mevcut (sağ ve sol atrium arasındaki iletişimi). (B) 5-0 polipropilen sütür PFO kapatmak için sürekli bir biçimde uygulanır. (C) sağ atrium 5-0 polipropilen çalışan bir dikiş ile kapalı. (D) ana pulmoner arter artan aort uzak tarafından künt diseksiyon kesmiştim. FO: deliği ovale; PA: pulmoner arter; Ao: aort. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: infüzyon biyoreaktör bileşenlerinin. Decellularization sistemi (A) kauçuk kapak ile 4 bağlantı noktası oluşur; (B) çıkış hattı pulmoner arter (PA); bağlanmasına (E) infüzyon radarı kilit PA ve aort (Ao), (D) ekleme satırı için sol ventrikül (LV), (C, F) konektörlerle satır aort, (G) polyester kese ile (H) perfüzyon konteyner bağlı olması. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: insan kalbi cannulation ve infüzyon biyoreaktör montaj. (A) pulmoner arter (PA) ve tek tek cannulated aort (Ao) gösteren kalp ön görünümü. (B) kanül gösterilen kalp görünümünü arka sol ventrikül (LV) aracılığıyla pulmoner ven (PV) ile yönlendirilmiş. (C) derleme sonra infüzyon biyoreaktör içinde insan kalbi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: sistem kurulumu baskı kafası ters odaklı decellularization. (A) tam decellularization sistem oluşur: bir bilgisayar, bir orantılı-integral-türev (PID) denetleyicisi, pompalar, bir biyoreaktör ve pulmoner arter (PA) ve sol ventrikül (LV) atık toplama için rezervuar. Ao: aort. Oklar, akış yönünü gösterir. (B) insan kalbi perfüzyon biyoreaktör içinde kurulum ve perfusate/atık decellularization sırasında ilişkili akış yollarının şeması. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: insan kalbi decellularization yordam ve sonrası decellularization incelenmesi şematik gösterimi. (A) diyagram decellularization yordam. (B) önünde ve posterior decellularized insan kalbi incelenmesi. (C) bir insan kalbi diseksiyon içine dört kesit (Bölüm A bölümüne D) biyokimyasal tahlil analiz için brüt. Boyama insan kalpleri içinde kalan lipofucin ifade tarafından nedeniyle oluşur. Boyama normalde iç ventrikül yüzey veya epicardium ve Miyokardiyum arasındaki sınır sunar. LA: sol atriyum; RA: Sağ atrium; LV: sol ventrikül; RV: sağ ventrikül; Karınca: anterior; Mesaj: arka; Hyper: hipertonik; Hipo: hipotonik; SDS: Sodyum Lauryl Sülfat; PBS: serum fosfat tamponlu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: hızlandırılmış akışı dynamics sırasında decellularization. (A) aort yordamı sırasında çözümlerinizle decellularization infüzyon akış hızı. (B) decellularization sırasında PA atık oranı akışı. (C) koroner perfüzyon verimlilik decellularization sırasında. (D) koroner perfüzyon verimliliği farklı çözümler/reaktifler perfüzyon sırasında demek. N = 6. Verileri temsil eden mean±SEM. PA: pulmoner arter; Hyper: hipertonik; Hipo: hipotonik; SDS: Sodyum Lauryl Sülfat; PBS: fosfat tamponlu tuz; SEM: standart hata demek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8: Hızlandırılmış hücre enkaz silinerek geçiş sırasında decellularization. (A) çıkış medya koleksiyonunuzu PA ve sigara-PA (sol ventrikül). (B) sonuç bulanıklık ölçüm, 280 nm. (C) protein konsantrasyonu ve bulanıklık arasında doğrusal korelasyon var. n = 6 insan kalpleri. Denetim temiz decellularization bir çözüm oldu. Verileri temsil eden mean±SEM. PA: pulmoner arter; Hyper: hipertonik; Hipo: hipotonik; SDS: Sodyum Lauryl Sülfat; SEM: standart hata demek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 9: decellularized insan kalp koroner anjiyo decellularization sonra thevascular açıklık doğruladı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 10: kadavra ve decellularized Miyokardiyum üzerinden doğrusal olmayan optik mikroskobu kullanılarak elde resimleri oval veya uzun şekil türleri decellularized içinde morfoloji ile hiçbir varlığı hücre (Örneğin, cardiomyocytes veya kardiyak fibroblastlar) göster LV, RV ve septum. LV: sol ventrikül; RV: sağ ventrikül; TPF: iki foton floresans; SHG: ikinci harmonik üretimi. Bazı kalp hücreleri oklarla belirtilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 11: biyokimyasal tahlil sonuçları. (A) kalan DNA decellularized dokularda kadavra kalbi göre. (B) kalan GAG decellularized dokularda kadavra kalbi göre. (C) kalan SDS decellularized dokularda. n = 6 insan kalpleri. Verileri temsil eden mean±SEM. LA: sol atriyum; RA: Sağ atrium; LV: sol ventrikül; RV: sağ ventrikül; Karınca: anterior; Mesaj: arka; SDS: Sodyum Lauryl Sülfat; SEM: standart hata demek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Yöntemi | Pro | Con |
| Geleneksel dik Langendorff perfüzyon | · Kolay erişim sırasında decellularization onarmak için kalp | · Aort kalp ağırlığı nedeniyle üzerinde aşırı yük |
| · SDS perfüzyon sabit basınç kontrol altında sırasında yüksek infüzyon akış hızı | ||
| · SDS perfüzyon sırasında düşük koroner perfüzyon verimliliği | ||
| · Aort/pulmoner arter kanül ligasyonu çizgisinin üstündeki bölümünü susuz ve kolayca kontamine | ||
| Basınçlı bir kese içinde ters Langendorff perfüzyon | · Aort kalp ağırlığı sayesinde ilinde zorlanma en aza indirmek | · Erişimi zor tamir eğer kalp gereklidir. |
| · Düşük infüzyon akış hızı sabit basınç kontrol altında SDS perfüzyon sırasında | ||
| · SDS perfüzyon sırasında gelişmiş koroner perfüzyon verimliliği | ||
| · Bütün kalp batık/sulu olduğundan hiçbir doku kurumuş. |
Tablo 1: Artılarını ve eksilerini geleneksel dik perfüzyon basınçlı bir kese içinde ters Langendorff perfüzyon vs kullanarak bütün-kalp decellularization bir özeti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bilgimizi, akış hızı ve hücre enkaz kaldırma zaman hata izleme ile ters rapor decellularization basınçlı bir kese içinde insan gönül için ilk çalışmadır. Kalp zarını benzeri kese kalp yönünü decellularization yordam sabit tutar. Batış ve tüm kalpleri bir kese içinde ters çevirme dehidratasyon engeller ve aort (dan kalp ağırlık) üzerinde aşırı yük ne zaman en aza indirir geleneksel dik Langendorff perfüzyon decellularization Yöntem9' a göre. Bu, sırayla, aort kapak yeterliliğinin korur.
Maksimal decellularization verimliliği elde etmek için koroner vasküler direnç yeterli ve tutarlı perfüzyon sıvı tüm Miyokardiyum aracılığıyla sağlamak için düşük olması gerekir. Retrograd perfüzyon kullanarak bütün-kalp decellularization modelinde, sıvı ventrikül içinde birikir ve intraventriküler basınç, hangi, sırayla, koroner damar direncini artırır ve sıvı akışını sınırlayan yükseltir. Aort kapak sağlam olsa bile, ventrikül boşluğuna fizyolojik sızıntı için ikincil doldurur ve sırayla ventrikül duvar sıkıştırır.
Bir kalp basınçlı bir kese içinde decellularizing bizim tekniği bu sorunu hafifletmek ve decellularization verimliliği artırmak hedefleniyor. Aortik kök 120 mmHg ve 14 mmHg bir çantada bir basınç decellularization süreci boyunca korunur. Bu basınç değerleri çok fizyolojik aralığı (aort 80-120 mmHg) ve sol ventrikül end-diastolik basınç2215 mmHg yakındır. Göre Murthy vd. 23, miyokardiyal kan akış hızı arasında değişmektedir 0.61 1.10 mL/dk/g ve insan kalp ağırlık24,25 yaklaşık 245-308 g; Bu nedenle, fizyolojik Koroner akım hızını 149.45 için 338.80 mL/dk, ama kalp kilo bağlıdır. Bizim çıkış hızı PA fizyolojik Koroner akım hızı değeri az olan 50 mL/dk 20 değişiyordu ve 2 farklı durumlardan neden olmuş: 1) kalp çözümlerinin infüzyon üretmek ödem ve ayrıca normal anatomik drenaj sol ventrikül boşluğuna koroner sisteminin; 2) gibi decellularization oluşur, sıvı aracılığıyla da kaybolur onların geçirgenliği. doğal bir artış nedeniyle decellularized duvarlar Bu basınç fark damarları çöküşü engeller ve patent kalmasını sağlar. Ayrıca, bu sistem göreli anatomik koşullarında kalp koroner damar direncini artırmak ve decellularization çözümler damar içi dolaşım zarar miyokard duvar sıkıştırmadan saklar. İnfüzyon akış oranı profil (Şekil 7A) insan gönül ne biz domuz kalp9, ters bizim decellularization içinde hipotonik perfüzyon ve hafif bir artış sırasında meydana gelen en düşük infüzyon akış hızı ile gözlenen için çok benzer akış hızı (176.31±44.03 mL/dk 110.61±14.40 mL/dk) % 1 SDS perfüzyon sırasında meydana gelen. Bizim infüzyon akış hızı (yani değer 151.50±3.71 mL/dk =) % 1 SDS sırasında perfüzyon karşılaştırılabilir veya bile daha az insan kalbi decellularization Guyette vd tarafından bildirilen için 14 ancak, bizim yöntemi 120 mmHg basınç kontrolü ile gerçekleştirilir ve 60 mmHg onların yöntemi kullanılır. Bu farklılığı perfüzyon basıncı daha düşük bir infüzyon akış oranı daha yüksek basınç korumak olabilir aort kapak kapatma bizim teknik bir üstün etkinliğini gösteriyor. Başka bir ihtimal artmış koroner direnci kese içinde uygulanan 14 mmHg baskısı yüzünden oldu. Ayrıca, bizim insan kalbi yöntemi hiper hipotonik çözüm değiştirmek bizim ters domuz kalp decellularization (~ % 10'luk karşılaştırıldığında üzerinden koroner perfüzyon verimliliği (~ %30, Şekil 7C, 7 D) azalan benzer bir eğilim gösterdi. "9yönelimivs dik yönde % 1-2 ters). Ancak, bu roman yöntemi koroner perfüzyon verimliliği SDS perfüzyon sırasında çözüm perfüzyon karşılaştırılabilir korumak ve böylece bizim önceki örnek inversiyon yöntemine üstün görünür. Tablo 1 profesyoneller listeler ve eksilerini geleneksel dik perfüzyon vs Langendorff perfüzyon basınçlı bir kese içinde ters.
Akış oranına ek olarak, çıkış bulanıklık izleme decellularization ilerleme ve etkinliğini değerlendirmek için yararlı bir araç olabilir. Decellularization sırasında bulanıklık PA atık, atık--dan non-PA yer (Şekil 8B) daha yüksek. Bu perfused çoğu göstermektedir çözüm için "uygun" decellularization damarlara aracılığıyla gidiyordu. Bunun geçerli olması için aşağıda ele alınması gereken henüz: arası şant veya aort kapak açıklık odası. Dikkatli ve titiz inceleme bu nedenle Yöntem anatomik sigara talimatnamelerini nedeniyle önlemek için gereklidir. Bütün kalp decellularization sürecinin bulanıklık profil (Şekil 8B) benzer eğilimler farklı perfusates9ilk geçiş dönemi sırasında ani bulanıklık değişiklikle daha önce gösterildiği gibi gösterdi.
Bir ana decellularized dokular için onları içeren hücreleri yeniden doldurmanız ve yüksek hücre eki, nükleer silahların yayılmasına karşı olgunlaşma ve işlevsellik elde edebilmek için hedeftir. Decellularized dokularımız başarıyla nerede dokular başarıyla cellularized ve alt thrombogenicity elde çeşitli uygulamalar26,27, cellularized. İçinde bizim biyokimyasal analizler decellularized insan gönül 19 bölgeleri farklı doku kalınlıkları ile değerlendirildi. DNA ve SDS decellularized dokularda, sağ ve sol atriyum içerisinde alınan en yüksek değeri ile çeşitli. Bu neyin hücre artıkları kese alt kısmında tuzak olduğunu ya da nerede akışını dış basınç azalır ters yapılandırmasında, kalp yönünü tarafından kaynaklanabilir. Perfüzyon decellularization olduğu gibi söz ve kolları da dahil olmak üzere zarar görmemiş kalp yapıları üzerinde dayanır. Bu organların çoklu organ bağış tedarik gibi bu kalpler genellikle onların kulakçık kaldırıldı büyük bir kısmı var. Bu organlar ve atriyal duvar tamiri hazırlanması sırasında bu bölgelerde decellularization çözümleri akışının tehlikeye, sulama bozulma vardı. Perfüzyon kalp decellularization için diğer araştırma grupları sıçan28, domuz29,30 ve insan31 ilgili kadavra kalbi ile karşılaştırıldığında % 2-6 artık DNA bildirdin. Ancak, donma-çözülme28,29,30, kullanılan enzim29,30 ve serum31 ' de ECM daha büyük bir ölçüde zarar verebilir onların decellularization Protokolü Bizim perfüzyon tabanlı teknik. Yeterince bu sınırlamaları gidermek için yöntemler geliştirmek önemli olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Doktor Taylor kurucusu ve Miromatrix tıp, Inc hissedar. Bu ilişki çatışması ilkelerine uygun olarak Minnesota Üniversitesi ve Teksas Kalp Enstitüsü tarafından yönetilmektedir; diğer yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Bu araştırma Houston bağış hibe ve Texas gelişmekte olan teknoloji Fonu tarafından desteklenmiştir. Organ tedarik ajansı yazarlar kabul LifeGift, Inc. ve vericinin aileler bu çalışma mümkün yapmak için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-0 silk suture | Ethicon | SA85H | Suture used to ligate superior and inferior vena cava |
| 1/4" x 3/8" connector with luer | NovoSci | 332023-000 | Connect aorta and pulmonary artery |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer | HV-96410-16 | Tubing to connect heart chambers/veins |
| infusion and outflow line | Smiths Medical | MX452FL | For flowing solutions through the vasculature |
| Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches) | Fisher scientific | 01-812-17 | Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization |
| Snapware Square-Grip Canister | Snapware | 1022 | 1-liter Container used for perfusing heart |
| Black rubber stoppers | VWR | 59586-162 | To seal the perfusion container |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | 881003 | To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids |
| 2 L aspirator bottle with bottom sidearm | VWR | 89001-532 | For holding solutions/perfusate |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | For quantifying dsDNA |
| Calf thymus standard | Sigma | D4522 | DNA standard |
| Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit | Biocolor Ltd | Blyscan #B1000 | GAG assay kit |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 Pro | For analytical assays |
| GE fluoroscopy | General Electric | OEC 9900 Elite | Angiogram |
| Visipaque | GE | 13233575 | Contrast agent |
References
- Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics--2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
- Zia, S., et al. Hearts beating through decellularized scaffolds: whole-organ engineering for cardiac regeneration and transplantation. Critical Reviews in Biotechnology. 36 (4), 705-715 (2016).
- Zimmermann, W. H. Strip and Dress the Human Heart. Circulation Research. 118 (1), 12-13 (2016).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
- Sanchez, P. L., et al. Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts. Biomaterials. 61, 279-289 (2015).
- Peloso, A., et al. Current achievements and future perspectives in whole-organ bioengineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 107 (2015).
- Guyette, J. P., et al.
- Momtahan, N., Sukavaneshvar, S., Roeder, B. L., Cook, A. D. Strategies and Processes to Decellularize and Cellularize Hearts to Generate Functional Organs and Reduce the Risk of Thrombosis. Tissue Engineering Part B-Reviews. 21 (1), 115-132 (2015).
- Lee, P. F., et al. Inverted orientation improves decellularization of whole porcine hearts. Acta Biomaterialia. , (2016).
- Momtahan, N., et al. Automation of Pressure Control Improves Whole Porcine Heart Decellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Weymann, A., et al. Development and Evaluation of a Perfusion Decellularization Porcine Heart Model - Generation of 3-Dimensional Myocardial Neoscaffolds. Circulation Journal. 75 (4), 852-860 (2011).
- Weymann, A., et al. Bioartificial heart: A human-sized porcine model--the way ahead. PLoS One. 9 (11), e111591 (2014).
- Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. Journal of Visualized Experiments. (70), e50059 (2012).
- Guyette, J. P., et al. Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).
- Sanchez, P. L., et al. Data from acellular human heart matrix. Data Brief. 8, 211-219 (2016).
- Garreta, E., et al. Myocardial commitment from human pluripotent stem cells: Rapid production of human heart grafts. Biomaterials. 98, 64-78 (2016).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of Cardiac Extracellular Matrix from an Intact Porcine Heart. Tissue Engineering Part C-Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Larson, A. M., Yeh, A. T. Ex vivo characterization of sub-10-fs pulses. Optics Letters. 31 (11), 1681-1683 (2006).
- Lee, P. F., Yeh, A. T., Bayless, K. J. Nonlinear optical microscopy reveals invading endothelial cells anisotropically alter three-dimensional collagen matrices. Experimental Cell Research. 315 (3), 396-410 (2009).
- Lee, P. F., Bai, Y., Smith, R. L., Bayless, K. J., Yeh, A. T. Angiogenic responses are enhanced in mechanically and microscopically characterized, microbial transglutaminase crosslinked collagen matrices with increased stiffness. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7178-7190 (2013).
- Wu, Z., et al.
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Murthy, V. L., et al. Clinical Quantification of Myocardial Blood Flow Using PET: Joint Position Paper of the SNMMI Cardiovascular Council and the ASNC. Journal of Nuclear Cardiology. 25 (1), 269-297 (2018).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal organ weights in men: Part I-the heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 33 (4), 362-367 (2012).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal Organ Weights in Women: Part I-The Heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 36 (3), 176-181 (2015).
- Robertson, M. J., Dries-Devlin, J. L., Kren, S. M., Burchfield, J. S., Taylor, D. A. Optimizing cellularization of whole decellularized heart extracellular matrix. PLoS One. 9 (2), e90406 (2014).
- Robertson, M. J., Soibam, B., O'Leary, J. G., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. Cellularization of rat liver: An in vitro model for assessing human drug metabolism and liver biology. PLoS One. 13 (1), e0191892 (2018).
- Baghalishahi, M., et al. Cardiac extracellular matrix hydrogel together with or without inducer cocktail improves human adipose tissue-derived stem cells differentiation into cardiomyocyte-like cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2018).
- Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal of Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
- Freytes, D. O., O'Neill, J. D., Duan-Arnold, Y., Wrona, E. A., Vunjak-Novakovic, G. Natural cardiac extracellular matrix hydrogels for cultivation of human stem cell-derived cardiomyocytes. Methods Molecular Biology. 1181, 69-81 (2014).
- Oberwallner, B., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
