Potencial de ação óptico subtipo específico gravações em humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas de Cardiomyocytes Ventricular

Cardiomyocytes (CMs) derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são uma ferramenta emergente para dissecar os mecanismos moleculares da doença de coração, para investigar novas terapias e a tela para drogas cardíacos adversos efeitos^{1,2 ,3}. Desde o início, arrhythmogenic doenças como canalopatias têm sido um importante foco desta área de investigação⁴. Consequentemente, métodos para investigar fenótipos elétricos do CMs, como arritmias ou alterações em morfologias do potencial de ação (AP), são o cerne desta tecnologia.

Uma consideração importante na aplicação de iPSC-CMs é que protocolos de diferenciação cardíaca atual não resulta em uma população homogênea de células. Em vez disso, eles são uma mistura de células, assemelhando-se a nó sinusal, atrial e CMs ventriculares em diferentes níveis de maturação^5,6,7,8. Esta heterogeneidade pode ser uma fonte relevante de variabilidade experimental, especialmente se são investigados parâmetros como duração de AP (APD), que intrinsecamente diferem entre os subtipos CM (por exemplo, a APD é menor no atrial do que em CMs ventriculares). A abordagem convencional para resolver este problema é para investigar único iPSC-CMs usando o método de braçadeira do remendo e classificar cada célula como nodal-, atrial-, ou como ventricular, com base na sua morfologia AP⁹. Qualquer análise subsequente pode ser restringido em seguida para as células que representa o subtipo CM de interesse. A grande desvantagem dessa estratégia é seu throughput limitado e a falta de escalabilidade. Além disso, a natureza invasiva da eletrofisiologia de braçadeira do remendo não permite a imagem das mesmas células sequencialmente durante períodos de tempo prolongado.

Aqui, nós fornecemos detalhes experimentais em um método¹⁰ desenvolvido para imagem opticamente APs em subtipos específicos de iPSC-CMs. Isso supera o problema da heterogeneidade do subtipo e aumenta drasticamente o throughput em comparação com os métodos convencionais, permitindo a rápida fenotipagem de iPSC-CMs carregando variantes genéticas ou sendo agentes expostos a farmacológica.

Visão geral da abordagem de imagem óptica subtipo específico

Um indicador de tensão geneticamente codificado (GEVI), cujas propriedades de fluorescência mudam após a despolarização e repolarização da membrana celular, é usado para imagem opticamente alterações do potencial de membrana da CMs. O GEVI aplicado aqui é a proteína fluorescente sensor de voltagem VSFP-CR¹¹, que consiste em um domínio transmembrana sensor de tensão, fundido a um par de um verde (trevo) e uma proteína fluorescente vermelha (mRuby2) (figura 1A). Devido a grande proximidade dos dois fluorophores, a excitação da proteína verde fluorescente resulta em uma fração da energia da excitação sendo transferida para a proteína fluorescente vermelha através de transferência de energia de ressonância de Förster (FRET). Portanto, a excitação da proteína verde fluorescente resulta em uma emissão de ambos o verde e as proteínas fluorescentes vermelhas (figura 1A, painel superior). Quando a célula depolarizes, um rearranjo estrutural do sensor de tensão ocorre que se traduz em uma reorientação das duas proteínas fluorescentes, aumentando a eficiência do FRET. Assim, ainda mais a energia de excitação é transferida de verde para a proteína fluorescente vermelha (figura 1A, painel inferior). Como resultado, em uma célula despolarizada, a emissão de fluorescência verde é redutor, e a emissão de fluorescência vermelha é mais brilhante do que em uma célula no potencial de membrana (figura 1B) a descansar.

Figura 1: imagem ótica da membrana potencial com CR. VSFP (A), A diagrama esquemático mostrando a ação da proteína fluorescente sensível à tensão QUE VSFP-CR é mostrado. Após a despolarização da membrana celular, um rearranjo estrutural no domínio transmembranar do sensor de tensão se traduz em uma reorientação do verde (GFP) e vermelha (RFP) fluorescente da proteína, aumentando a eficiência da intramolecular Förster transferência de energia de ressonância (FRET). Espectros (B) a emissão de um VSFP em cima da excitação da GFP em células com o potencial de membrana de repouso (painel superior) e em células despolarizadas (painel inferior) são retratados. A mudança espectral após a despolarização é exagerada para maior clareza. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As mudanças na eficiência FRET espelhando as flutuações do potencial de membrana são fotografadas usando um microscópio de fluorescência, equipado com um divisor de imagem, que separa a emissão de fluorescência vermelha e verde e projeta-los sobre duas áreas adjacentes de o chip de uma câmera de sCMOS (Figura 2). Com esta configuração, a emissão de fluorescência em duas bandas de comprimento de onda diferente pode ser gravada simultaneamente, que permite o cálculo de um rácio de fluorescência verde-vermelho-para refletir o potencial em cada imagem de uma lapso de tempo série de membrana.

Figura 2: configuração do sistema de geração de imagens. Os principais componentes do sistema de imagem usados para imagem as mudanças espectrais da proteína fluorescente tensão sensível as alterações de potencial de membrana em uma alta resolução temporal de espelhamento são retratadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A expressão de VSFP-CR em CMs é conseguida Lentivirus transdução. Para direcionar a expressão para o subtipo CM de interesse, o lentivirus contém um elemento de promotor (o MLC2v enhancer) que especificamente drives transcrição em ventricular como iPSC-CMs¹⁰. Quando o iPSC-CMs que representam uma mistura de células semelhantes a atrial, nodal, como e ventricular, como é transfectado com este lentivirus, VSFP-CR é expresso apenas nas células como ventricular. Uma vez que a imagem latente ótica potencial de ação depende deste sensor fluorescente, os potenciais de ação gravados exclusivamente representam o subtipo CM de interesse (Figura 3).

Figura 3: expressão de VSFP orientada por promotor para a imagem latente de potencial de membrana do subtipo específico. (um) este esquema mostra como gravações de potencial de ação óptico subtipo específico de casos são atingidas. (b) iPSC-CMs infectados com um VSFP sob o controle do atrapalha-MLC2v ventricular específicas são mostrados. A expressão do sensor de tensão é observada somente em CMs ventricular, como no canal de GFP (painel esquerdo). O contraste de fase (painel central) e a imagem de superposição (painel direito) também são fornecidos. Linhas brancas pontilhadas marcam limites da célula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. preparação dos Cardiomyocytes iPSC-derivado para a imagem latente

Nota: Métodos de diferenciação de cultura e cardíaca de iPSC foram publicados antes de^12,13,14 e não serão discutidos aqui em detalhes. A purificação de iPSC-CMs microdissection manual, separação magnética celular ou seleção de lactato é recomendada, dependendo do protocolo de diferenciação utilizado. Para o seguinte protocolo, microdissected explantes de bater áreas, geradas usando uma monocamada diferenciação protocolo¹³, foram tiradas no dia 15 de uma diferenciação cardíaca e cultivadas até o dia 30 de placas revestidas de fibronectina, conforme descrito antes das¹⁰.

1. Levar a célula pratos de cultura fora da incubadora e coletar manualmente os explantes cardíacas em tubos microcentrifuga usando uma pipeta de 200 µ l. Depois da sedimentação, aspirar a sobrenadante de cultura celular e delicadamente lavar os explantes 2x com Hank está equilibrado sal solução (HBSS).
2. Dissociar o iPSC-CMs por adicionar colagenase tipo II (430 U/mL em HBSS) e incube-os a 37 ° C por 30 min.
3. Após a sedimentação da célula grande restante agrupa, recolher o sobrenadante que contém o único dissociado iPSC-CMs e adicione isto ao meio de manutenção CM fresco contendo uma concentração alta de soro fetal bovino (FBS) (DMEM-F12, 20% FBS, 2mm L-Glutamine, 1: 100 MEM não aminoácidos essenciais, 100 U/mL de penicilina-estreptomicina e β-Mercaptoetanol de 0,1 mM).
4. Repita a dissociação se permanecem aglomerados de células grandes. Colete único iPSC-CMs por centrifugação e Resuspenda os meio de CM, contendo uma baixa concentração de FBS (2% FBS).
5. Re-sementes iPSC-CMs único em uma densidade permitindo que as imagens subsequentes de células individuais em um 3,5 cm vidro-fundo microdish de cultura celular que foi revestida com fibronectina (2 µ g/cm²). Otimize a densidade de semeadura antes de engajar-se em experiências de alta produtividade. Geralmente, 5 – 10 explantes cardíacas por prato de 3,5 cm são suficientes; no entanto, esta fortemente depende do tamanho do explante e pureza.
6. Cultura do único iPSC-CMs após sua dissociação em meio de manutenção CM contendo 2% FBS pelo menos 48 h para garantir uma recuperação suficiente.
   Nota: Nas próximas etapas, o iPSC-CMs é transfectado com um lentivirus GEVI VSFP-CR sob o controle de um intensificador de MLC2v ¹⁰ para alcançar uma expressão de GEVI ventricular específica de codificação. Alternativamente, construções de Lentivirus que permite expressar a GEVI especificamente em nodal ou atrial-células, ou uma construção inespecíficas, abrigando o promotor PGK ubiquitously-expresso, pode ser usado¹⁰. Particulas de Lentivirus plasmídeos estão disponíveis mediante pedido.
   Cuidado: Ao trabalhar com particulas de Lentivirus, certifique-se de que o ambiente de trabalho tem o nível de biossegurança adequadas, respeitar as instruções de segurança para trabalhar com agentes potencialmente infecciosos e tome as precauções de segurança necessárias.
7. Preparar o meio de infecção misturando o lentivirus¹⁰-contendo cultura de pilha sobrenadante, que tem sido produzida em células HEK293 conforme descrito antes de¹⁵, com meio de manutenção de CMs (consulte a etapa 1.3) em uma proporção de 1:1.
8. Adicione brometo de hexadimethrine em uma concentração final de 8 µ g/mL para melhorar a eficiência da infecção.
   Nota: Devido à infecção de alta eficiência de iPSC-CMs concentração prévia de lentivirus através de ultracentrifugação geralmente não é necessária.
9. Aspire o meio de manutenção de CM do único iPSC-CMs e substituí-lo por meio de infecção preparado durante as etapas 1.7 e 1.8. Cultura do iPSC-CMs único infectado no meio de infecção por 12 horas a 37 ° C. Em seguida, Aspire o meio e substituí-lo novamente por meio de manutenção do CM.
   Nota: Um sinal de fluorescência da GEVI aparece 48 h após a infecção. Uma imagem das gravações de potencial de membrana é recomendada, 72 h após a infecção, na melhor das hipóteses, para assegurar uma força de sinal adequada. Único infectados iPSC-CMs podem ser cultivadas pelo menos 3 semanas e cuja imagem sequencialmente. Se extensa fotobranqueamento ocorre durante uma sessão de imagens, o sinal de fluorescência se recupera ao longo do tempo.
10. Antes de imagem, trocar o meio de cultura celular pela solução de Tyrode suplementada com Ca^{2 +} (135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl₂, glicose 10 mM, 1.8 mM CaCl₂e 10 mM HEPES; pH 7,35).

2. óptica membrana potencial gravações

1. Coloque a câmara de imagens contendo o iPSC-CMs no palco de um microscópio de epifluorescência invertido equipado com um divisor de imagem, os conjuntos de filtro apropriado e uma câmera (por exemplo, uma câmera sCMOS) capaz de imagem de alta velocidade em alta sensibilidade.
   Nota: por exemplo, uso uma excitação de passa-banda 480/40 nm filtro combinado com 500 nm passe longo dicroicas espelho no microscópio, e um espelho dicroico passe longo de 568 nm combinado com 28/520 nm e filtros de emissão de passa-banda 630/75 nm no separador imagem. Para a imagem latente de célula única, um objectivo de imersão de óleo de alta ampliação, alta--abertura numérica fornece a melhor relação sinal-ruído.
2. Se a estimulação elétrica é necessário, instalar os eletrodos de estimulação na câmara de imagens e conectá-los a um gerador de estímulo.
   Nota: Usamos um ritmo baixo-relevo que continha dois eléctrodos de platina e equipado para os pratos de cultura 3,5 cm vidro-fundo celular. As células localizadas entre os eletrodos foram fotografadas. Parâmetros de estimulação típicos são pulsos retangulares de 5 ms de duração, com uma amplitude de 10 V/cm de distância de eletrodo.
3. Opcionalmente, use um palco de microscópio aquecida para garantir uma temperatura estável de iPSC-CMs durante a geração de imagens, ou mesmo uma configuração de câmara de incubação microscópio se destina-se a longo prazo imagem.
4. Traga as células para se concentrar e coloque uma célula expressando a GEVI no centro do campo de visão.
   Nota: Isto é feito mais convenientemente usando as oculares do microscópio usando uma proteína verde fluorescente (GFP) ou um vermelho proteína fluorescente (RFP) filtro definido para identificar células expressando a GEVI.
5. Defina o caminho óptico, para que a luz emitida é roteada para o divisor de imagem. Alternar o cubo do filtro no microscópio para esse para ser combinado com os filtros no separador imagem (consulte a Tabela de materiais).
6. No software controlar a câmera, defina as configurações de aquisição para que a imagem latente de alta velocidade (por exemplo, 100 frames por segundo, com um tempo de exposição de 10 ms por quadro) é possível.
   Nota: Normalmente, isso envolve o binning de pixels da câmera (por exemplo, 8x8 pixels do chip câmera são guardados para gerar um pixel no filme lapso de tempo).
7. Configure o divisor de imagem de acordo com as instruções do fabricante. As duas imagens que representam as duas bandas de comprimento de onda de emissão diferentes devem ser adjacentes uns aos outros, cada um ocupando metade da imagem.
   Nota: Este passo tem de ser realizada somente 1 x no início de cada sessão de imagens.
8. Verificar e, se necessário, ajustar o foco da imagem produzida pela câmera.
9. Ajustar o brilho da luz iluminação é evitar qualquer saturação dos pixels; Isto pode ser feito facilmente usando uma paleta de cores na qual pixels saturados são representados por uma cor única.
   Nota: Durante todos estes preparativos antes da imagem latente, limitar a exposição da amostra à excitação leve a quantidade necessária (ou seja, não deixe a luz acesa por longos períodos de tempo) para evitar o fotobranqueamento da GEVI.
10. Configurar a aquisição da série de tempo (por exemplo, 5.000 imagens em 100 frames por segundo durante uma série de 50 s). Dim a luz no quarto (incluindo monitores de computador) para evitar a luz influencia a medição. Se o obturador de luz de excitação não é controlado pelo software da imagem latente, abri-lo pouco antes de iniciar a aquisição.
11. Inicie a aquisição da série imagem. Se a estimulação elétrica é desejada, inicie a sequência de estimulação no ponto de tempo apropriado, a menos que é iniciado automaticamente pelo software da imagem latente. Se a aplicação de um agente farmacológico é procurada, fazer isto manualmente (por exemplo, por pipetagem 100 µ l do agente em uma concentração final dez vezes para a câmara de gravação contendo 900 µ l de tampão e delicadamente, misturando-o com a pipeta) ou usando um sistema de fluxo constante de perfusão.
12. Quando a aquisição for concluída, feche o obturador de luz de excitação, se necessário. Salve a gravação para o disco rígido.
13. Deixando as configurações de gravação (ou seja, tempo de exposição, taxa de quadros e intensidade da luz) inalteradas, realizar uma gravação da fluorescência fundo (como na etapa 2.11) sobre uma região da lamela não contendo células ou sobre outra lamela sobre o qual não as células têm sido semeadas.
    Nota: Se as medições sequenciais são executadas sem alterar as configurações de aquisição, apenas uma gravação de fluorescência de fundo é necessária para todas as medições.
14. Se desejado, realizar experiências adicionais (etapas 2.4 – 2.13) em diferentes iPSC-CMs localizados na mesma lamela. Esteja ciente de que todos os CMs na lamela serão afetados no caso de uma droga foi aplicada.

3. análise

> Nota: Dependendo do software de imagem usado (que geralmente é um pacote de software proprietário fornecido pelo fabricante da câmera ou a fluorescência de toda sistema de imagem), pode ser possível realizar a análise das imagens adquiridas em parte ou mesmo inteiramente dentro deste pacote de software. No entanto, aqui um fluxo de trabalho de análise de imagem que pode ser executada com o software de código aberto (ou seja, a plataforma de análise de imagem ImageJ)¹⁶, que pode ser convenientemente instalado usando uma distribuição como Fiji¹⁷e o pacote de dados R computação estatística¹⁸ são descritos. Resumidamente, as regiões de interesse (ROIs), que representa células ou plano de fundo são desenhadas no ImageJ e média fluorescência nestes ROIs ao longo do tempo é exportada para um arquivo para ser, então, mais analisados em R ou, alternativamente, com software de planilha.

1. No software de imagens, salvar ou exportar a série de tempo imagem adquirida (a gravação contendo as células e a gravação de fundo correspondente) para um formato (por exemplo, TIF) que pode ser lido pelo ImageJ. Como alternativa, use o plugin BioFormats (https://imagej.net/Bio-Formats), que fornece rotinas permitindo ImageJ ler formatos de arquivo proprietários de diferentes marcas de fabricantes de sistema de imagem.
   Observação: As etapas a seguir assumem que os intervalos de imagens são as mesmas em toda a gravação. Se isso não for o caso, pode ser necessário exportar as informações de tempo a partir do software da imagem latente e incluí-lo na uma análise mais aprofundada.
2. Abra a pilha TIF que contém as células no ImageJ.
3. Use a ferramenta de seleção à mão livre para desenhar um ROI mais um casos fluorescente no canal vermelho. Certifique-se de que o ROI é grande o suficiente para que a célula não se move fora do ROI enquanto contratantes.
4. Abra o plugin Gerenciador de ROI ('Analyze | Ferramentas | Gerente de ROI') e pressione o botão 'Adicionar [t]' para adicionar este ROI como ROI1.
5. Arraste o ROI sobre a mesma célula em canal verde e adicionar este ROI como ROI2.
6. No ' analisar | Conjunto de medições menu, desmarque todas as opções exceto 'Quer dizer cinza valor'.
   Nota: Isto tem que ser feito apenas 1x em uma sessão do ImageJ.
7. No Gerenciador de ROI, pressione a ' mais | Medida de multi' botão. Selecione as opções 'Medir todas as fatias' e 'Uma linha por fatia' e pressione 'Okey'. Abre uma janela contendo uma planilha com três linhas (o número de fatias e a fluorescência média no dois ROIs que representa a célula no vermelho e no canal da mancha verde, respectivamente).
8. Uso ' arquivo | Salvar como para salvar a planilha em um arquivo de valores separados por vírgula (CSV).
9. Feche a janela com a pilha de imagem e a janela de planilha sem fechar a janela do Gerenciador de ROI. Abra a pilha TIF que contém a medida de fundo.
10. No Gerenciador de ROI, pressione a ' mais | Medida de multi' botão. Selecione as opções 'Medir todas as fatias' e 'Uma linha por fatia' e pressione 'Okey'.
11. Uso ' arquivo | Salvar como de salvar a planilha com os dados de fundo em outro arquivo CSV.
    Nota: Os cálculos a seguintes podem ser feitos com o software de planilha eletrônica. Usamos o software de R¹⁸. Um exemplo simples de script que lê os dados de célula e plano de fundo dos arquivos "cell.csv" e "background.csv" executa os cálculos e traça o curso do tempo do sinal do potencial de membrana é fornecido como complementar 1 arquivo de código.
12. Desde a gravação de fundo, calcule a intensidade média no vermelho e no canal da mancha verde. Subtraia este sinal de fundo de sinais que representa a célula no canal vermelho e verde para calcular RFP de correção de fundo e sinais GFP, respectivamente.
13. Como um substituto para o potencial de membrana, calcule a relação RFP/GFP.
    Nota: Esta relação é adimensional. Alternativamente, ele pode ser normalizado para o seu valor inicial (ou seja, ΔR/R₀). Importante, útil informações estão contidas as mudanças temporais e não em valores absolutos desta relação. Devido à desigual fotobranqueamento a GFP e RFP, pode ocorrer uma deriva de base este rácio. Se necessário, tal deriva de uma linha de base pode ser corrigida por construir uma curva de base e isso subtraindo o RFP/GFP relação¹⁰.

Na figura 4a, um único representante iPSC-CM é retratado com as linhas pontilhadas brancas marcando o ROI desenhado durante a análise de imagem na RFP (lado esquerdo) e o canal GFP (lado direito). O sinal do canal RFP mostra um aumento periódico em intensidade fluorescente durante cada potencial de ação (figura 4b, painel superior). Conforme descrito na introdução, este é devido a uma crescente FRET causado por alterações do potencial de membrana (Figura 1). Respondendo, o sinal GFP mostra uma diminuição periódica da intensidade fluorescente (figura 4b, painel médio). A proporção RFP/GFP (figura 4b, painel inferior) é o sinal biológico utilizado em análises a jusante, tais como APD50 e APD90 medições. Usando este método, 30 dias de idade ventricular como iPSC-CMs passeados a 0,5 Hz mostrou uma média APD50 (a duração desde o início do potencial de ação até a repolarização é completada por 50%) de ms 439 (± 46 ms) e uma média APD90 (a duração até a repolarização é completada por 90%) de 520 ms (± 47 ms) (Figura 4C).

Figura 4: princípios de análise de imagem e as características básicas de potencial de ação. (um) a RFP simultaneamente gravada (lado direito) e fluorescência de GFP (lado esquerdo) de um único iPSC-CM é mostrada. Linhas brancas pontilhadas representam as regiões de interesse (ROI) utilizados para a análise de imagens. (b) Raw, da correção de fundo RFP, GFP, e sinais RFP/GFP derivados o ROI são mostrados. (c) os meios e SEM de APD90 e APD50 de ventricular, como único iPSC-CMs em temperatura ambiente e com ritmo de 0,5 Hz são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para demonstrar que o método também é capaz de captar as alterações na duração do potencial de ação, iPSC-CMs eletricamente foram estimulados a aumentar taxas de estimulação que variam de 0,4 a 2,5 Hz, aumentando a taxa de cada cinco batidas (Figura 5). Um sinal de potencial de membrana típico opticamente-gravado de iPSC-um CM é mostrado na Figura 5a. Os quatro primeiros potenciais de ação a cada taxa de batida foram em média, demonstrando uma redução progressiva dos potenciais de ação a maior surra taxas (Figura 5b). Uma média de batidas passeadas subsequentes é um método eficaz de reduzir o ruído inerente de potenciais de ação gravada opticamente10. Deve ser mencionado que o experimento retratado não pode capturar o montante total do potencial de ação dependente da taxa de gordura possível, dado que temos passeado a célula para apenas cinco batidas a cada taxa de estimulação, que pode não ser suficiente para atingir o equilíbrio.

Figura 5: efeito da frequência de estimulação sobre a duração do potencial de ação. (um) Um iPSC-CM foi passeado a aumentar as frequências que variam de 0,4 a 2,5 Hz, conforme indicado (os pulsos de estimulação elétricos simples são representados por setas). (b) para cada frequência de estimulação, um AP em média foi calculado a partir da quatro primeiros APs nesta frequência. As APs em média são plotados como uma sobreposição, demonstrando o AP encurtamento com aumento das taxas de estimulação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O método também pode ser usado para investigar os efeitos eletrofisiológicos de drogas aplicados ao iPSC-CMs (Figura 6). Aqui, isoproterenol, agonista β-adrenoreceptor não-seletivo, foi aplicada espontaneamente batendo iPSC-CMs conforme indicado, levando a um rápido aumento da taxa de espancamento (Figura 6a). Uma curva de dose-resposta, mostrando o efeito de diferentes concentrações de Isoproterenol sobre a frequência de batimento de iPSC-CMs é mostrada na Figura 6b.

Figura 6: efeito do isoproterenol sobre a frequência de batimento. (um) o traçado representativo potencial bruto de ação óptico de uma surra espontaneamente iPSC-CM único é mostrado. Isoproterenol (com uma concentração final de 1 µM) foi adicionado para iPSC-CMs, conforme indicado pela barra. (b) esta curva dose-resposta mostra o efeito do isoproterenol diferentes concentrações sobre a frequência de batimento de iPSC-CMs. erro barras representam o desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada para divulgar.