Artigo de método

Potencial de ação óptico subtipo específico gravações em humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas de Cardiomyocytes Ventricular

DOI:

10.3791/58134

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27 de setembro de 2018

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1Medical Department I, University Hospital Klinikum rechts der Isar, Technical University of Munich, 2German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), Munich Heart Alliance, 3Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Aqui nós apresentamos um método de potenciais de ação opticamente imagem, especificamente em pluripotentes induzidas ventricular, como células-tronco derivadas cardiomyocytes. O método baseia-se na expressão de uma proteína fluorescente sensível à tensão orientado para o promotor.

Resumo

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Cardiomyocytes gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSC-CMs) são uma ferramenta emergente em pesquisa cardiovascular. Ao invés de ser uma população homogênea de células, o iPSC-CMs gerado pelos protocolos de diferenciação atual representam uma mistura de células com ventricular-, atrial-e nodal, como fenótipos, que dificulta a análise fenotípica. Aqui, um método para opticamente registro de potenciais de ação, especificamente do tipo ventricular iPSC-CMs é apresentado. Isto é conseguido pelo Lentivirus transdução com uma construção em que um indicador de tensão geneticamente codificado está sob o controle de um elemento promotor específico ventricular. Quando iPSC-CMs são transfectadas com essa construção, o sensor de tensão é expressa exclusivamente em ventricular células, permitindo gravações de potencial de membrana óptico subtipo específico usando microscopia de fluorescência de lapso de tempo.

Introdução

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Cardiomyocytes (CMs) derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são uma ferramenta emergente para dissecar os mecanismos moleculares da doença de coração, para investigar novas terapias e a tela para drogas cardíacos adversos efeitos1,2 ,3. Desde o início, arrhythmogenic doenças como canalopatias têm sido um importante foco desta área de investigação4. Consequentemente, métodos para investigar fenótipos elétricos do CMs, como arritmias ou alterações em morfologias do potencial de ação (AP), são o cerne desta tecnologia.

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Protocolo

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1. preparação dos Cardiomyocytes iPSC-derivado para a imagem latente

Nota: Métodos de diferenciação de cultura e cardíaca de iPSC foram publicados antes de12,13,14 e não serão discutidos aqui em detalhes. A purificação de iPSC-CMs microdissection manual, separação magnética celular ou seleção de lactato é recomendada, dependendo do protocolo de diferenciação utilizado. Para o seguinte protocolo, microdissected explantes de bater áreas, geradas usando uma monocamada diferenciação protocolo13, foram tiradas no dia 15 de uma dife....

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Resultados

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Na figura 4a, um único representante iPSC-CM é retratado com as linhas pontilhadas brancas marcando o ROI desenhado durante a análise de imagem na RFP (lado esquerdo) e o canal GFP (lado direito). O sinal do canal RFP mostra um aumento periódico em intensidade fluorescente durante cada potencial de ação (figura 4b, painel superior). Conforme descrito na introdução, este é devido a uma crescente FRET causado por alterações do pote.......

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Discussão

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O método descrito aqui permite que uma gravação óptica de APs de um subtipo específico (ou seja, células ventriculares) de CMs gerado a partir de iPSCs humana. IPSC-CMs humanos são uma ferramenta emergente para resolver uma enorme variedade de problemas biológicos e médicos, e a diferenciação de diferentes subtipos de CM é uma importante fonte de variabilidade experimental. Usando elementos específicos do promotor, a expressão de um GEVI especificamente é alcançada em CMs que representa o subtipo de interesse, q.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado por doações da Fundação alemã de pesquisa (Si 1747/1-1), a outra Kröner-Fresenius-Stiftung e a Deutsche Stiftung für Herzforschung.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
-MercaptoetanolInvitrogen21985023
DMEM-F12 MédioInvitrogen21331046
FBS (Soro Fetal Bovino)Invitrogen16141079
MEM Aminoácidos Não EssenciaisInvitrogen11140050
GlutaMax-I SuplementoInvitrogen35050061L-Glutamina alternativa
Penicilina-EstreptomicinaInvitrogen15140122
Fibronectina plasma bovinoSigma-AldrichF1141 
Colagenase tipo IIWorthington BiochemLS004174
Brometo de hexadimetrina (Polybrene)Sigma-AldrichH9268aumentando a infecção lentiviral
Microplacas com fundo de vidro de 3,5 cmMatTek corporation, Ashland, MA, EUAP35G-1.5-14-C
Suporte para microscópioLeica Microsystems, Wetzlar, AlemanhaDMI6000B
Objetiva de microscópioLeica Microsystems, Wetzlar, AlemanhaHCX PL APO 63X/1.4-0.6 Câmera sCMOS de óleo
Andor Technology, Belfast, Reino UnidoZyla V
Cubo de filtro de microscópio: filtro de excitaçãoChroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, EUAET480/40Xpassa-banda 480/40
Cubo de filtro de microscópio: espelho dicróicoChroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, EUAT505lpxrlongpass 505 nm
Divisor de imagem  Cairn Research, Faversham, Reino UnidoOptoSplit II
Cubo de filtro divisor de imagem: espelho dicróicoAHF Analysentechnik GmbH, Tü bigen, Alemanha568LPXRlongpass 568 nm
Cubo de filtro divisor de imagem: filtro de emissão 1 (emissão GFP)AHF Analysentechnik GmbH, Tü bigen, Alemanha520/28 BrightLine HCpassa-banda 520/28 nm
Cubo de filtro divisor de imagem: filtro de emissão 2 (emissão RFP)AHF Analysentechnik GmbH, Tü bigen, Alemanha630/75 ET Passagembanda passa-banda 630/75 nm
Inserção de estimulaçãoWarner Instruments, Hamden, CT, EUARC-37FS
de

Referências

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  1. Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing. Pharmacology & Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).
  2. Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A.

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Etiquetas

Ventricular CardiomyocytesOptical Action PotentialGenetically Encoded Voltage IndicatorLentiviral TransductionVentricular Specific PromoterTime lapse Fluorescence MicroscopyImage SplitterRegion Of Interest AnalysisAction Potential DurationElectrical Pacing Stimulation

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