Summary
Het protocol beschrijft een techniek om te bestuderen van de mogelijkheid van primaire polyklonale menselijke T cellen vormen van synaptic interfaces met behulp van vlakke lipide bilayers. We gebruiken deze techniek te laten zien van de differentiële synapse formatie vermogen van menselijke primaire T-cellen afgeleid van lymfeklieren en perifeer bloed.
Abstract
Het huidige begrip van de dynamiek en structurele kenmerken van T-cel synaptic interfaces is grotendeels bepaald door het gebruik van glas-gesteund vlakke bilayers en in vitro-afgeleide T-cell klonen of lijnen van1,2 ,3,4. Hoe deze bevindingen van toepassing zijn op de primaire menselijke T-cellen geïsoleerd van bloed of lymfoïde weefsels niet bekend is, deels te wijten aan de grote moeilijkheden bij het verkrijgen van een voldoende aantal cellen voor analyse5. Hier aanpakken we dit door middel van de ontwikkeling van een techniek die exploitatie van meerkanaals stroom dia's om te bouwen van vlakke lipide bilayers met activeren en hechting van de moleculen. De geringe hoogte van de stroom dia's bevordert snelle cel sedimentatie om te synchroniseren van cel: dubbelgelaagde bijlage, waardoor onderzoekers de dynamiek van de formatie van het synaptische interface en de kinetiek van de release van de korrels te gaan studeren. We passen deze benadering voor het analyseren van de synaptische interface van zo weinig als 104 naar 105 primaire cryopreserved T cellen geïsoleerd uit lymfklieren (LN) en perifeer bloed (PB). De resultaten onthullen dat de roman vlakke lipide dubbelgelaagde techniek de studie van de biofysische eigenschappen van primaire menselijke T-cellen afgeleid van bloed en de weefsels in het kader van gezondheid en ziekte maakt.
Introduction
Wetenschappelijke kennis van de structurele kenmerken van T-cel immuun synapsen en hun link naar de functionele activiteit van T cellen is gegenereerd voornamelijk uit de studie van cellijnen en klonen afgeleid van PB. In welke mate deze bevindingen hebben betrekking op primaire T-cellen verkregen uit blijft bloed of menselijke lymfoïde weefsels onduidelijk, zoals de synaptische interfaces van T-cellen die woonachtig zijn in de lymfoïde en andere weefsels hebben tot nu toe niet is geanalyseerd. Belangrijker, suggereren opkomende gegevens dat weefsel-ingezetene en lymfoïde-orgel-afgeleide T-cellen kunnen aanzienlijke verschillen in hun fenotype en functionele activiteit in vergelijking met PB6,7. Dit heeft verder verhard de noodzaak om de functies van de T-cel synaptic interface in primaire menselijke T cellen beter te begrijpen.
Daartoe hebben we een aanpak van de nieuwe mini schaal benutten van lipide bilayers ingebouwd in meerkanaals stroom dia's, zodat we kunnen uitvoeren van de beeldvorming van T-cel/dubbelgelaagde interfaces met minder dan 105 primaire T cellen geïsoleerd van menselijke PB en LN. Deze nieuwe techniek maakt het mogelijk de studie van de biofysische eigenschappen van primaire menselijke T-cel synaptic interfaces om beter model en in vivo cel interacties begrijpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd uitgevoerd overeenkomstig de verklaring van Helsinki. Schriftelijke toestemming is verkregen van alle deelnemers, en bloed-en lymfeklier werden verworven met de goedkeuring van de institutionele Review Board aan de Universiteit van Pennsylvania (IRB #809316, IRB # 815056). Alle proefpersonen waren volwassenen. Koord bloedmonsters werden beschikbaar gesteld door arbeid en levering van de afdeling Obstetrie & gynaecologie aan de Thomas Jefferson University. Alle monsters waren-geïdentificeerde.
1. isolatie van CD4+ T cellen voor een beeldanalyse
-
Ontdooi een hoeveelheid van 1 mL met 107 bevroren perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) of lymfeknoop mononucleaire cellen (LNMCs) uit verzamelde monsters. Meng in een steriele kap, de ontdooide cellen 9 mL RPMI aangevuld met penicilline/streptomycine en glutamine.
- Centrifugate de cellen gedurende 10 minuten bij 300 x g bij 4 ° C, gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cellen in 5 mL aangevuld RPMI bevattende 10 gewichtspercenten FBS (volledige medium). Incubeer de cellen overnachting in een CO2 incubator bij 37 ° C.
- De volgende dag, zuiveren CD4+ T cellen door negatieve immunomagnetic sorteren met behulp van een commercieel beschikbare kit volgens de instructie van de fabrikant.
- Voor het meten van het aantal CD4 vers gezuiverde+ T cellen, Meng 5 µL van de celsuspensie met een gelijk volume van de oplossing van een trypan blauw. Laden van een hemocytometer met een cel-trypan blauwe mengsel en tellen de levende cellen binnen de 5 onderdelen van de hemocytometer.
- Neem het gemiddelde van het aantal cellen en bepalen van het aantal cellen in de oorspronkelijke celsuspensie: het aantal cellen/1 mL = het gemiddelde aantal x 2 x 10-4. Als het totale aantal geïsoleerde cellen te klein is, gebruikt u de cellen zoals hij is zonder het tellen.
- Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 10 minuten en resuspendeer hen in een assay buffer (20 mM HEPES, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2 mM nb2HPO4, 5 mM D-glucose, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2en 1% menselijk serumalbumine) op 105 < /C13 > cellen/50 µL of minder en houden van de cellen bij 4 ° C (voor 1-2 h) tot klaar voor gebruik in de experimenten.
- Verwijdering van alle biologische afval volgens de relevante institutionele richtlijnen.
- Indien gewenst als een controle-celpopulatie, bereiden van geactiveerde CD8 T-cellen uit navelstrengbloed PBMC, plaatst u 107 cellen in 5 mL voor volledige medium in een maatkolf van T25 cultuur bedekt met een mengsel van antilichamen van de anti-CD3 en anti-CD28 op 10 µg/mL en 1 µg/mL , respectievelijk.
- De volgende dag, de geactiveerde koord bloedcellen verwijderen uit de kolf, was ze 1 x met verse medium voltooien en uit te breiden van de cellen in het bijzijn van recombinante IL-2 (100 U/mL) voor 2 weken.
- Zuiveren van de CD8 navelstrengbloed+ T cellen door negatieve immunomagnetic sorteren met behulp van de verkrijgbare kit volgens de instructie van de fabrikant. Cellen tellen en de media aan de assay buffer te wisselen zoals beschreven in stappen 1.3-1.6 voor LN en PB CD8+ T cellen.
2. onderdelen voor de bereiding van de vlakke lipide-Bilayers
- 3 soort liposomen zoals elders beschreven5bereiden: (a) 0.4 mM DOPC (1,2-dioleoyl -sn- glycero-3-fosfocholine) liposomen, (b) 0.4 mM DOPC liposomen met 33% van de mol honden-NTA (1,2-dioleoyl -sn- glycero - 3-[(N-(5- amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic zuur) succinyl] (ammoniumzout)) lipiden, (c) 0,4 mM DOPC liposomen met 4 mol % Biotinyl-Cap-PE (1,2-dioleoyl -sn- glycero-3-phosphoethanolamine - N-(GLB biotinyl) (natriumzout)).
-
5% caseïne-oplossing te bereiden als eerder beschreven5.
- Los 5 g caseïnepoeder in 100 mL ultrazuiver water en Voeg 350 µL van 10 M natriumhydroxide-oplossing. Roer alles op een regelmatige magneetroerder met een langzame snelheid volgens de beschikbare schaal, bij kamertemperatuur gedurende 2 uur, en dan 's nachts bij 4 ° C. Breng de pH op 7.3 en ultracentrifuge de oplossing voor 2 h bij 100.000 x g bij 4 ° C. De bovendrijvende vloeistof filteren met een 0,22 µm steriele filter en bewaar de oplossing in aliquots bij-80 ° C.
Let op: natriumhydroxide-oplossing kan veroorzaken chemische brandwonden en permanente blindheid bij aanraking met de ogen veroorzaken. Gebruik rubberen handschoenen, veiligheidskleding en bescherming van de ogen bij de behandeling van deze chemische stof of haar oplossingen.
- Los 5 g caseïnepoeder in 100 mL ultrazuiver water en Voeg 350 µL van 10 M natriumhydroxide-oplossing. Roer alles op een regelmatige magneetroerder met een langzame snelheid volgens de beschikbare schaal, bij kamertemperatuur gedurende 2 uur, en dan 's nachts bij 4 ° C. Breng de pH op 7.3 en ultracentrifuge de oplossing voor 2 h bij 100.000 x g bij 4 ° C. De bovendrijvende vloeistof filteren met een 0,22 µm steriele filter en bewaar de oplossing in aliquots bij-80 ° C.
-
Label anti-CD3 antilichaam met biotine voor de productie van mono-bionylated antilichamenmolecules met een eerder beschreven aanpak8.
- Bereid een oplossing van biotine-PEO4-NHS in dimethylsulfoxide (DMSO) op 0,1 mg/mL. Voeg 3.7 µL van de Biotine-PEO4-NHS-oplossing tot 1 mg van antilichaam in 0,5 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 100 mM natriumbicarbonaat.
- Laat het mengsel gedurende 2 uur bij kamertemperatuur inwerken. Bereid een oplossing van Alexa Fluor 488 NHS ester 10 mg/ml in DMSO. De Alexa Fluor 488 NHS ester oplossing aan het antilichaam gelabeld door Biotine-PEO4-NHS op een 10-fold molaire overmaat toevoegen.
- Incubeer het mengsel gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met langzaam roeren op een regelmatige magneetroerder. De niet-afhankelijke kleurstof met behulp van grootte-uitsluiting chromatografie te scheiden.
- De antilichaam-concentratie te bepalen door het meten van de extinctie van de oplossing van het antilichaam bij 280 nm (een280). Meet de extinctie van de gelabelde antilichamen op 577 nm (een577).
- Het bepalen van de verhouding van de kleurstof-naar-antilichaam met behulp van de volgende vergelijking:
Opmerking: Extra details vinden in protocol van de fabrikant.
-
Express een recombinant oplosbare ICAM-1 proteïne in een systeem van Drosophila expressie, zoals eerder beschreven van3,4,9,10.
- Kloon, met cDNA codering, de ectodomain van ICAM-1 in Drosophila expressie vector bet/V5-zijn met een afleidbare metallothionein promotor te produceren een recombinant eiwit toegevoegd met een zijn6 -tag op het einde van de C-terminal.
- Co transfect S2 cellen met de resulterende ICAM-1 met plasmide en een G418 expressie vector. Selecteer stabiele transfectants met behulp van Schneiders Drosophila Media aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS) en 0,5 mg/mL G418 voor 3 weken. Vouw de cellen in serumvrij insect medium en veroorzaken een eiwit expressie met 0,5 mM CuSO4 voor 3 d.
- Concentreer je de cultuur supernatant 10 x en dialyze tegen PBS via een tangentiële stroom concentrator als eerder beschreven11.
- De geconcentreerde cultuur supernatant van toepassing op een kolom met Sepharose met een covalent geïmmobiliseerdet anti-ICAM-1 monoclonal antilichaam en elueer de afhankelijke ICAM-1 met een 50 mM glycine buffer, pH 3.0. Het eluted eiwit ICAM-1 met een 2 M Tris buffer, pH 8,0 onmiddellijk te neutraliseren.
- Dialyze van het eluted materiaal tegen PBS, pH 8.0 en de dialyzed materiaal toevoegen aan een kolom met Ni-NTA agarose. Elueer oplosbare ICAM-1 met 200 mM imidazool, pH 8,0. Dialyze het eluted materiaal tegen een PBS-buffer, pH 8,0.
- Label de gezuiverde ICAM-1 met Cy5 NHS ester volgens de instructie van de fabrikant.
Opmerking: De beste definitieve kleurstof-naar-eiwitverhouding is 1:1.
- Produceren van Fab fragmenten van een anti-CD107a antistof door papaïne spijsvertering en zuiveren van de Fab fragmenten door ionenwisselingschromatografie zoals eerder beschreven van3. Label de Fab-met Alexa Fluor 568 NHS ester volgens de instructie van de fabrikant fragmenten.
3. vorming van vlakke lipide glas-ondersteunde Bilayers
- Bereid een fris zure piranha-oplossing door het mengen van 140 mL geconcentreerd zwavelzuur en 60 mL van 30% waterstofperoxide. De coverslips van het glas voor de stroom dia's wassen door inweken hen in de zure piranha-oplossing voor 30 min. Hold het glas dekglaasje aan met polypropyleen scissor-type pincet.
Let op: Piranha-oplossing is een zeer sterke oxidator. Vergeet niet om slijtage veiligheidsbril of bril of een full-face schild samen met dikke rubberen handschoenen te allen tijde tijdens het verwerken van de oplossing. Werken alleen met piranha-oplossing in een zuurkast. Vermijd Verwarming, het vervoer, of het schudden op elk gewenst moment tijdens het gebruik, zoals het kan ontploffen. De piranha afval in een glazen fles met een gat van lood-bevattende verzamelen. Neem contact op met de institutionele Veiligheidscommissie over juiste afval-gebruik. -
Spoel de gewassen coverslips 7 x met ultrazuiver water door het overbrengen van hen opeenvolgend in bekerglazen met vers water. Set de natte coverslips opzij te laten de resterende water uit het schone glas rollen, het droog glas achterlaat.
- Ook gebruiken een uiteinde van de pipet gekoppeld aan een vacuümpomp om zorgvuldig de resterende waterdruppels van de coverslips.
- In de steriele kap, uitgevoerd door verdunningen van verschillende lipiden te produceren van de liposomen mix voor het maken van bilayers. Eerst, 37 µL van DOPC liposomen en 3 µL van Biotinyl-Pet-PE liposomen te combineren. Ten tweede, meng 14 µL van DOPC liposomen en 15 µL van honden-NTA liposomen. Derde, voeg 1 µL van de eerste mix aan 29 µL van de tweede mix te fabriceren van het definitieve liposoom mengsel.
-
Een werkruimte met droge coverslips dicht door instellen in de steriele kap. Aliquot 2 µL van het mengsel van definitieve liposoom (zie stap 3.3) precies in het midden van een zelfklevende dia-kanaal. Onmiddellijk en zeer nauwkeurig uitlijnen een schoon en droog dekglaasje aan de dia en zachtjes lager het dekglaasje aan aan de plakkerige kant van de dia.
- Als meer dan één dia voorbereidt, werken op één dia tegelijk omdat het liposoom mengsel snel verdampt. Het omdraaien van de dia en gebruik van de buitenste ring van polypropyleen scissor-type verlostang om een zachte druk uitoefenen op het perifere contact van het dekglaasje aan de dia, ervoor te zorgen dat de slip stevig is aangesloten op de dia te sluiten van lekkage.
Opmerking: Druk niet op tegen de kanalen van de dia te voorkomen breken of barsten van het dekglaasje aan. - Zet de dia opnieuw en markeer de positie van de gevormde dubbelgelaagde, die eruit als een druppel tussen het dekglaasje aan en de dia kanaal door tekening 4 stippen met een permanent marker rond de dubbelgelaagde aan de kant van de externe dia van de vergadering ziet.
- Als meer dan één dia voorbereidt, werken op één dia tegelijk omdat het liposoom mengsel snel verdampt. Het omdraaien van de dia en gebruik van de buitenste ring van polypropyleen scissor-type verlostang om een zachte druk uitoefenen op het perifere contact van het dekglaasje aan de dia, ervoor te zorgen dat de slip stevig is aangesloten op de dia te sluiten van lekkage.
- Voordat de eerste injectie van een vloeistof in het kanaal, één poort van het kanaal aanwijzen als de ingangshaven en de andere als de uitlaatopening en onderhouden van deze benaming gedurende het gehele experiment.
- Voorkom vorming van bubbels, het einde van het uiteinde van de pipet direct invoegen de ingangshaven van het kanaal. Langzaam vullen van de kanalen van de dia met 50 µL van warme (ten minste kamertemperatuur) assay buffer (zie stap 1.5 voor de samenstelling van de buffer).
- Bereid een 0.5 M nickel(II) chloride oplossing. Ontdooi een 2 mL hoeveelheid caseïne oplossing in een waterbad bij 37 ° C gedurende 30 minuten en vullen met een nikkel-chloride oplossing bij een eindconcentratie van 200 µM.
- De bilayers door het eerst injecteren 100 µL van de caseïne-oplossing in de ingangshaven van het kanaal en vervolgens onmiddellijk 100 µL van de uitlaatopening op de dia te verwijderen door pipetteren wassen. Blokkeren de bilayers met dezelfde oplossing door het injecteren van 100 µL van de caseïne-oplossing in de ingangshaven van elk kanaal en de dia gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
- Ontdooi aliquots van Cy5-ICAM-1-zijn6 en daar eiwitten. De eiwitten in de buffer van de bepaling in de definitieve concentratie van 2 µg/mL elke combineren. Centrifugeer de oplossing voor 30 min op 20.000 x g en 4 ° C tot het verwijderen van eventuele aggregaten.
- De rest van de blokkerende oplossing uit de uitlaatopening van de dia-kanaal verwijderen door pipetteren. Breng 100 µL van de oplossing met ICAM-1 en daar in de ingangshaven.
- Laat de dia gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur inwerken. Elke overschrijding van de eiwit-oplossing uit de uitlaatopening verwijderen. Wassen van de dubbelgelaagde 2 x door het eerst injecteren 100 µL van de buffer van de bepaling in de ingangshaven van het kanaal en vervolgens 100 µL van de uitlaatopening onmiddellijk te verwijderen.
- Verdun een Alexa Fluor-488-gemerkte anti-CD3 antilichaam met de assay buffer een eindconcentratie van 2 µg/mL. Injecteren van 100 µL van de antilichaam-oplossing in de ingangshaven van de dia en laat het gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur inwerken. Elke overschrijding van de eiwit-oplossing uit de uitlaatopening verwijderen. Wassen van de dubbelgelaagde 2 x met 100 µL van de buffer assay zoals in stap 3.11.
4. beeldvorming van de T-cellen interactie met de vlakke dubbelgelaagde
-
Verwarm de fase en de doelstelling van een Microscoop confocal of totale interne reflectie fluorescentie (TIRF), totdat de temperatuur wordt geëquilibreerd bij 37 ° C. Instellen van de dia met de bilayer(s) in het verwarmde werkgebied. Het werkgebied verplaatsen naar een juiste positie volgens de inkt merken en focus op de dubbelgelaagde fluorescentie van Cy-gelabelde ICAM-1 moleculen in dienst.
- Gebruik een 61 X doelstelling voor de confocal microscoop, of een 100 X doelstelling voor de TIRF-Microscoop, met passende filterinstellingen.
-
Voor de submodule release beeldvorming door TIRF microscopie, toevoegen van Alexa Fluor-568-gelabelde anti-CD107a antistof Fab fragmenten aan de celsuspensie op een eindconcentratie van 4 µg/mL vóór het injecteren van de cellen in de havens van de ingang.
- Resuspendeer de bereid CD4+ T cellen geïsoleerd van LN, de PB of koord bloed en 50 µL van de celsuspensie injecteren de ingangshaven van het kanaal van de dia met de dubbelgelaagde.
- Kies het gewenste aantal velden en records beelden van elk veld 1 x om de 2 min voor 30 min na de injectie.
- Helder-veld, gereflecteerde licht en fluorescerende kanalen (Alexa 488 en Cy5) van de confocal microscoop te verwerven van de beelden misbruiken. TIRF modus gebruiken voor Alexa-Fluor-488 en Alexa-Fluor-568 fluorescentie en widefield voor Cy5 fluorescentie, evenals lichte-veld imaging, op de TIRF-Microscoop.
5. de beeldanalyse
- Analyseer de verworven beelden met behulp van de juiste software. Observeren cel morfologie in de doorvallend licht beelden en uitsluiten geclusterd en zichtbaar beschadigd of apoptotic cellen uit de analyse. Deelnemen aan de analyse alleen die cellen die productief samenwerken met het dubbelgelaagde oppervlak (dat wil zeggen, cellen accumulatie van Alexa-Fluor-488 fluorescentie (anti-CD3 antistoffen) bij de interface).
- Bepaal de grootte van de cel adhesie gebied in 20 min. na de inleiding van de cel-dubbelgelaagde interactie.
Opmerking: De hechting area is de donkere ontwikkeld op het raakvlak van de cel-dubbelgelaagde op de interferentie reflectie microscopie (IRM) beelden. - Observeer een accumulatie van Cy5-ICAM-1 fluorescentie en een formatie van het kruispunt van de ring door gescheiden Cy-ICAM-1 moleculen in de cel-dubbelgelaagde interface. Als een opgebouwde ICAM-1 moleculen gevormd een hechting ring afslag van ten minste twee opeenvolgende beelden, wijzen dergelijke cellen als cellen ontwikkelen een perifere supramoleculaire activerend cluster (pSMAC)12.
- Evalueren de submodule release door het meten van de intensiteit van de fluorescentie Alexa-Fluor-568 op het raakvlak van T-cel-dubbelgelaagde over de achtergrond fluorescentie buiten de contactpunten in de nabijheid van de cel. Cellen met een ratio van Alexa-Fluor-568 signaal-naar-achtergrond van ten minste 1,3 als degranulating cellen aanwijzen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eerst, vergeleken we de structuur van de synaptische interface gevormd door geactiveerde koord-bloed-afgeleide CD8+ T cellen blootgesteld aan lipide bilayers gebouwd ofwel in traditionele grootschalige stroom cel systemen (Zie de Tabel van materialen voor details)1 ,2,3,4 of in meerkanaals stroom dia's. De bilayers bevatte TL-geëtiketteerden anti-CD3 en ICAM-1 op 50 moleculen/µm2 en 300 moleculen/µm2, respectievelijk. CD8+ T cellen afgeleid van menselijke navelstrengbloed werden geactiveerd door een stimulatie met plaat-gebonden anti-CD3 en anti-CD28 antilichamen13,14. Er was geen verschil tussen CD8+ T cellen die gevormde klassieke immunologische synapsen op de lipide-bilayers gebouwd in de cel van de stroom of de multichannel stroom dia (Figuur 1). Alle andere experimenten werden uitgevoerd met lipide-bilayers gemaakt in de multichannel stroom dia's.
Vervolgens onderzochten we de capaciteit van menselijke CD4 PB - en LN-afgeleide+ T cellen te vormen van synaptic interfaces met de vlakke lipide-bilayers en de vrijgave van de korrels. We misbruikt TIRF microscopie om te maximaliseren van de verticale resolutie op het raakvlak van T-cel-dubbelgelaagde gevisualiseerd degranulating cellen en evalueren van de kinetiek van de submodule release. We 4 groepen cellen waargenomen voor beide LN - en PBMC-afgeleide CD4+ T cellen: sommige T-cellen volwassen immuun synapsen opgericht, maar ofwel heeft of heb niet vrijgeven korrels, andere T-cellen vrijgegeven de korrels zonder een vorming van volwassen synapsen, en nog steeds andere T-cellen gevormd synapsen noch vrijgegeven van de korrels (Figuur 2)7. Het verschil tussen LN - en PBMC-afgeleide CD4+ T cellen werd duidelijk toen de kinetiek van de submodule release werd geëvalueerd. PBMC afkomstige CD4+ T cellen waren in staat om te beginnen met het vrijgeven van korrels bijna tweemaal zo snel als LN-afgeleide CD4+ cellen (Figuur 3)7. Over het geheel genomen de gegevens aantonen dat ondanks een heterogeniteit van CD4 LN - en PBMC-afgeleide+ T-cellen, deze bevatte een fractie van T cellen staat snelle degranulatie.
Figuur 1: vergelijking van de dia-stroomsysteem en conventionele stroom kamer. (A) dit paneel toont de multichannel stroom schuif waardoor een samenstel van 6 glas-gesteund vlakke lipide-bilayers. Elke dubbelgelaagde is verbonden met de levering en de afrit havens. Minder dan 1 x 105 cellen zijn voldoende voor de analyse. (B) dit paneel toont de conventionele stroomsysteem voor kamer waardoor een samenstel van 1 glas-gesteund vlakke lipide dubbelgelaagde. 2 x 106 cellen zijn vereist voor de analyse. De andere deelvensters show (C en D) representatieve TIRF microscopie (E en F) confocal met interferentie reflectie microscopie (IRM) beelden van de interface die is ontwikkeld door geactiveerd koord-bloed-afgeleide CD8 T cellen. De cellen werden blootgesteld aan een lipide dubbelgelaagde met ICAM-1 (300 moleculen/µm2) en anti-CD3 antilichamen (50 moleculen/µm2) verworven (C en E) in stroom dia's of (D en F) in een conventionele stroomsysteem onder vergelijkbare omstandigheden. De TIRF microscopie en confocal met IRM images zijn geschoten met behulp van 100 X en 60 X vergroting doelstellingen, respectievelijk. Het percentage van T-cellen die vorm volwassen af op de bilayers gebouwd in beide stroom dia of conventionele stroom kamer was erg vergelijkbaar maar varieert tussen experimenten van 75% tot 90%. In alle afbeeldingen, worden Cy-5-geëtiketteerd ICAM-1 moleculen weergegeven in het blauw; Anti-CD3 Alexa Fluor-488-gelabelde antilichamen worden weergegeven in het groen; Anti-CD107a Alexa Fluor-568-gelabelde antilichamen gebonden aan CD107a worden weergegeven in het rood; IRM-beelden worden getoond in cyaan; en de schaal-balken zijn 10 µm in lengte. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Structuur van een T-cel-dubbelgelaagde interface en het patroon van degranulatie door lymfeklier en perifere bloed mononucleaire CD4+ T cellen. LNMC - of PBMC-afgeleide cellen wordt gesorteerd te scheiden van CD4+ T cellen die werden blootgesteld aan de bilayers met 50 moleculen/µm2 van anti-CD3 antilichamen en 300 moleculen/µm2 van ICAM-1 proteïne. De interface tussen de cellen en de bilayers werd door TIRF microscopie beeld. De schaal bars zijn 5 µm. (A) deze representatieve beelden van een T-cel - dubbelgelaagde interface aantonen dat de structuur van de T-cel-dubbelgelaagde interfaces en degranulatie patroon. (B) de Toon van deze diagrammen een voorstelling van LNMC en PBMC-afkomstige CD4+ T cellen met een verschillende structuur van synaptic interfaces en patronen van submodule release. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Dynamische veranderingen van de structuur van een T-cel-dubbelgelaagde-interface en de kinetiek van een degranulatie van lymfeklier en perifere bloed mononucleaire CD4+ T cellen. (A) dit paneel toont tijdafhankelijke wijzigingen van een T-cel-dubbelgelaagde-interface en de verschijning van vrijgegeven korrels. De schaal bars zijn 5 µm. (B) dit paneel toont een kwantificatie van de kinetiek van een submodule vrijlating door CD4 LN-afgeleide+ T cellen (gesloten cirkels) en CD4 PBMC afkomstige+ T cellen (open cirkels). Elke individuele rondje geeft aan dat de tijd van de eerste verschijning van een aantoonbaar submodule vrijlating door afzonderlijke cellen. De mediaan en IQR (interkwartielafstand) worden weergegeven voor alle scatter percelen. Mann-Whitney-tests werden uitgevoerd om te vergelijken van de verschillen tussen de aangegeven groepen van T-cellen. P < 0,05, ** P < 0,01. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De nieuwe techniek hier beschreven maakt gebruik van soortgelijke reagentia moeten bouwen vlakke bilayers in de conventionele stroom cel5 en met succes kan worden toegepast voor het uitvoeren van de beeldvorming van primaire menselijke T-cel-dubbelgelaagde interfaces3,4 ,15. De techniek biedt een significante vermindering van het gebruik van fluorescerend moleculen en vereist 10 – 20 x minder T-cellen ten opzichte van een stroom cel systeem5, maken de mogelijkheid om het analyseren van de primaire mens T-cellen van het bloed en andere weefsels.
Het aantal ingespoten cellen die worden gebruikt in deze studie konden we om het imago van ongeveer 50 cellen per veld met een 60 X doelstelling imaging. Een grotere concentratie resulteerde in cel aggregatie, vermindering van het aantal cellen geschikt voor analyse. Wij kunnen verder het verminderen van het aantal ingespoten cellen 10 – 50 x, maar de ondergrens van het celaantal hangt af van cel heterogeniteit, op het aantal imaging velden, en de proefopzet. Sommige onderzoekers hebben vroeger bilayers gebouwd in een open zaal met een glazen bodem, die een soortgelijk aantal cellen voor analyse16vereist. Echter zorgt het gesloten systeem hier beschreven, met een hoogte van het kanaal van 0,1 - 0,4 mm, voor snelle cel sedimentatie voor het synchroniseren van de gehechtheid van de cel en de analyse van de T-cel-respons zonder het risico van vloeibare verdamping. Het kleverige dia systeem verder toelaat de vorming van maximaal drie bilayers per kanaal. Dus, hetzelfde monster cel kan worden gebruikt voor de analyse van het gedrag van de cel op verschillende bilayers met een verschillende samenstelling van stimulerend, hechting en costimulatory moleculen.
Sommige voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen tijdens de vergadering van de kleverige dia's en coverslips voor een succesvolle dubbelgelaagde formatie. In het bijzonder de coverslips moet volledig droog, aangezien zelfs een kleine hoeveelheid vloeistof liet op het glasoppervlak kan resulteren in lekkage tijdens de dubbelgelaagde wassen procedure. Nog belangrijker is, is het essentieel om zelfs de bijgevoegde dekglaasje aan aan de randen van het contact met de buitenste ring van polypropyleen scissor-type verlostang om te voorkomen lekkage (zoals beschreven in stap 3.4.1). Het is ook belangrijk om te voorkomen dat eventuele borrelen in de havens van de ingang van de kanalen. Als alle bubbels een kanaal binnenkomen, zijn ze bijna onmogelijk te verwijderen en ruïneren de dubbelgelaagde in het kanaal. Ook is het belangrijk te voorkomen dat een snelle pipetteren, aangezien de turbulente stroming van vloeistof kan bubbels in het kanaal introduceren en de dubbelgelaagde schade.
Een release van cytolytische korrels wordt gedetecteerd door de verschijning van CD107a op het grensvlak van T-cel-dubbelgelaagde. Fab regio's van de anti-CD107a Alexa Fluor-568-gelabelde antilichamen worden toegevoegd aan CD8 T cellen vóór het laden op de bilayers. TIRF microscopie exploiteert een vluchtig Golf om te verlichten van het gebied ongeveer 100 nm boven de dubbelgelaagde in het volume gedefinieerd als vluchtig volume, waardoor om de verticale resolutie van de beeldvorming te verhogen. Gelabeld antilichaam Fabs, die zeer snel binnen het vluchtig volume bij 37 ° C verspreiden, genereren geen een opspoorbaar signaal van de tl. Tijdens de fusie van de membraan van gespecialiseerde lysosomen met lytische moleculen met de celmembraan, CD107a membraan eiwit verschijnt op de T contact cellen oppervlak op verschillende locaties. De Fabs krijgen afhankelijk van het eiwit CD107s op dat moment. Gekoppeld aan het CD107a eiwit, vormen Fab(s) TL-geëtiketteerden immobiel clusters die het genereren van een heldere fluorescentie aantoonbaar door TIRF microscopie, indicatieve van T cel degranulatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de R01AI118694 NIH-subsidie aan Michael R. Betts, waaronder sub award 566950 naar Yuri Sykulev. Wij danken de Sidney Kimmel Cancer Center Bioimaging gedeelde Resource voor hun uitstekende steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD4 T cell isolation kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-533 | |
| CD8 T cells Isolation Kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-495 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| DOGS NTA | Avanti Polar Lipids | 790528C | |
| Biotinyl Cap PE | Avanti Polar Lipids | 870273C | |
| Human Serum Albumin | Octapharma USA | NDC 68982-643-01 | |
| sticky-Slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky-Slides | ibidi | 10812 | |
| Bioptech FCS2 Chamber | Bioptech | 060319-2-03 | |
| anti-CD3 antibody | Thermo Fisher Scientific | 16-0037-81 | OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC |
| anti- CD28 antibody | Genetex | GTX14664 | 9.3 clone |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Biotin-PEO4-NHS | Thermo Fisher Scientific | 21329 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5 | |
| Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10235 | |
| Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10238 | |
| Amersham Cy5 NHS Ester | GE Life Science | PA15101 | |
| pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
| pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection | ATCC | 37409 | |
| Serum free Drosophial media Insect-XPRESS | Lonza | 12-730Q | |
| Hybridoma YN1/1.7.4 | ATCC | CRL1878 | The hybridoma secrets antibody against ICAM-1. |
| Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B | Sigma-Aldrich | C9142 | Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody. |
| MasterFlex tangential flow concentrator | Cole-Parmer | 77601-60 7592-40 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Centramate Lab Tangential Flow Systems | Pall Laboratory | FS002K10 OS010T12 FS005K10 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30210 | |
| Dialysis tubing | Spectra/Por | 131384 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | |
| mouse anti-human antibody against CD107a | BD Bioscences | 555798 | Clone H4A3 |
| Ansell Natural Blue Gloves | Fisher Scientific | 19-014-539 | |
| Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps | Thermo Fisher Scientific | 6320-0010 | |
| Streptavidin | ProZyme | SA10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60X oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table | |
| TIRF microscope | Andor | Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS) | |
| MetaMorph Premier Image Analysis Software | Molecular devices |
References
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Somersalo, K., et al. Cytotoxic T lymphocytes form an antigen-independent ring junction. Journal of Clinical Investigation. 113, 49-57 (2004).
- Beal, A. M., et al. Protein kinase C theta regulates stability of the peripheral adhesion ring junction and contributes to the sensitivity of target cell lysis by CTL. The Journal of Immunology. 181, 4815-4824 (2008).
- Beal, A. M., et al. Kinetics of early T cell receptor signaling regulate the pathway of lytic granule delivery to the secretory domain. Immunity. 31, 632-642 (2009).
- Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 18, Unit 18 13 (2007).
- Reuter, M. A., et al. HIV-Specific CD8(+) T Cells Exhibit Reduced and Differentially Regulated Cytolytic Activity in Lymphoid Tissue. Cell Reports. 21, 3458-3470 (2017).
- Buggert, M., et al. Limited immune surveillance in lymphoid tissue by cytolytic CD4+ T cells during health and HIV disease. PLoS Pathogens. 14, e1006973 (2018).
- Carrasco, Y. R., Fleire, S. J., Cameron, T., Dustin, M. L., Batista, F. D. LFA-1/ICAM-1 interaction lowers the threshold of B cell activation by facilitating B cell adhesion and synapse formation. Immunity. 20, 589-599 (2004).
- Anikeeva, N., et al. Distinct role of lymphocyte function-associated antigen-1 in mediating effective cytolytic activity by cytotoxic T lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 6437-6442 (2005).
- Steblyanko, M., Anikeeva, N., Campbell, K. S., Keen, J. H., Sykulev, Y. Integrins Influence the Size and Dynamics of Signaling Microclusters in a Pyk2-dependent Manner. The Journal of Biological Chemistry. 290, 11833-11842 (2015).
- Anikeeva, N., Lebedeva, T., Sumaroka, M., Kalams, S. A., Sykulev, Y. Soluble HIV-specific T-cell receptor: expression, purification and analysis of the specificity. Journal of Immunological Methods. 277, 75-86 (2003).
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Riddell, S. R., Greenberg, P. D. The use of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to clone and expand human antigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 128, 189-201 (1990).
- Lin, S. J., Yu, J. C., Cheng, P. J., Hsiao, S. S., Kuo, M. L. Effect of interleukin-15 on anti-CD3/anti-CD28 induced apoptosis of umbilical cord blood CD4+ T cells. European Journal of Haematology. 71, 425-432 (2003).
- Anikeeva, N., Sykulev, Y. Mechanisms controlling granule-mediated cytolytic activity of cytotoxic T lymphocytes. Immunologic Research. 51, 183-194 (2011).
- Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463, 963-967 (2010).
