Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Periferik kan ve lenf dokusu birincil insan T hücre sinaptik arabirimi değerlendirilmesi

Published: July 30, 2018 doi: 10.3791/58143
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 2, 4
1Department of Microbiology and Immunology, Thomas Jefferson University, 2Department of Microbiology and Institute for Immunology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Medicine Huddinge, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital Huddinge, 4Departments of Microbiology and Immunology and Medical Oncology, Sidney Kimmel Cancer Center, Thomas Jefferson University

Summary

Protokol düzlemsel lipid bilayers kullanarak sinaptik arabirimleri oluşturmak için birincil poliklonal insan T hücreleri yeteneklerini çalışmaya bir teknik anlatılmaktadır. İnsan birincil T hücreler lenf düğümleri ve periferik kan elde fark synapse oluşumu yeteneğini göstermek için bu tekniği kullanın.

Abstract

Dynamics mevcut anlayış ve yapısal özellikleri T-hücre sinaptik arayüzlerin düzlemsel bilayers Cam destekli ve vitrokullanımı ile büyük ölçüde kararlı olmuştur-türetilmiş T-Hücre klonlar ya da hatları1,2 ,3,4. Bu bulgular birincil insan T hücrelerine kan gelen izole veya lenfoid uygulamak nasıl dokular bilinmemektedir, hücre Analizi5için yeterli sayıda almak üzere kısmen önemli zorluklar nedeniyle. Burada bu bir teknik etkinleştirme ve adezyon molekülleri içeren düzlemsel lipid bilayers oluşturmak için çok kanallı akışı slaytlar istismar geliştirilmesi yoluyla ele. Akış slaytlar düşük yüksekliği hızlı hücre sedimantasyon hücre: bilayer eki, böylece araştırmacılar sinaptik arabirimi oluşumu dinamik ve granül yayın kinetik çalışmaya izin eşitlemek için teşvik etmektedir. Biz az 10 olarak sinaptik arabiriminin analiz etmek için bu yaklaşım uygulamak4 ' e 105 birincil cryopreserved T hücreler lenf düğümleri (içinde) ve periferik kan (PB) izole. Sonuçları ortaya çıkarmak roman düzlemsel lipid bilayer tekniği birincil insan T hücreleri kan ve doku bağlamında sağlık ve hastalık, türetilmiş biyofiziksel özelliklerini sağlar.

Introduction

T-hücre bağışıklık sinapslarda ve T hücrelerinin fonksiyonel etkinlik onların bağlantı yapısal özelliklerinden bilimsel bilgi öncelikle hücre hatları kursundan üretti ve PB türetilmiş klonlar. Bu bulgular için birincil T hücreleri arasında bir ilişki ne derece elde kan veya insan lenfoid doku kalır belirsiz, lenfoid ve diğer dokularda bulunan T hücre sinaptik arabirimleri şu ana kadar analiz değil gibi. Önemlisi, gelişmekte olan verileri doku yerleşik ve lenfoid organ elde T hücreleri fenotip ve fonksiyonel etkinlik bu PB6,7göre önemli farklılıklar olabileceğini göstermektedir. Bu daha fazla daha iyi birincil insan T hücreleri T-hücre sinaptik arabiriminde özelliklerini anlamak gerek katılaşmış.

Bu amaçla, biz bize insan PB ve LN. izole az 105 birincil T hücreleri ile T-hücre/bilayer arayüzleri görüntüleme gerçekleştirmesini sağlayan çok kanallı akışı slaytlar içine yerleştirilmiş lipid bilayers istismar bir roman mini ölçek yaklaşım geliştirdik Bu roman tekniği daha iyi model ve in vivo hücre-hücre etkileşimleri anlamak için birincil insan T-hücre sinaptik arabirimleri biyofiziksel özelliklerini sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışma Helsinki Bildirgesi uygun olarak yapılmıştır. Tüm katılımcılar Yazılı onam alındı ve kan ve lenf nodu (IRB #809316, IRB # 815056) Pennsylvania Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulunun onayı ile satın alınan. Tüm insan denekler yetişkindi. Kordon kan örnekleri nazikçe işçi ve kadın Doğum bölümü & Thomas Jefferson Üniversitesi'nde kadın hastalıkları teslim tarafından temin edilmiştir. Tüm örneklerini de-tespit edildi.

1. yalıtım CD4+ T hücreleri bir görüntü analizi için

  1. 107 dondurulmuş periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) veya lenf nodu mononükleer hücreler (LNMCs) toplanan örnekleri içeren 1 mL aliquot çözülme. Steril bir başlık, penisilin/streptomisin ve glutamin ile RPMI 9 mL çözdürülen hücreleri ekleyin.
    1. Centrifugate 300 x g 4 ° C'de 10 dakika için hücreleri süpernatant Aspire edin ve 5 mL ilave RPMI % 10 içeren hücrelerde resuspend FBS (tam orta). CO2 kuluçka 37 ° C'de gecede hücrelerde kuluçkaya
  2. Ertesi gün, CD4 arındırmak+ T hücreleri tarafından olumsuz immunomagnetic üreticinin yönerge göre piyasada bulunan bir seti kullanarak sıralama.
  3. Taze arıtılmış CD4 sayısı ölçmek için+ T hücreleri, hücre süspansiyon 5 µL bir trypan mavi çözüm eşit bir hacmi ile karıştırın. Bir hemasitometre hücre trypan ile yük mavi karışımı ve hemasitometre 5 bölümlerini içinde canlı hücreleri saymak.
  4. Hücre sayı ortalamasını almak ve özgün hücre süspansiyon hücre sayısı belirlemek: hücreler/1 mL sayısı = x 2 x 104ortalama sayısı. İzole hücre toplam sayısı çok küçük ise, hücre sayım olmadan olduğu gibi kullanın.
  5. Hücreleri vasıl 300 x g 10 dk santrifüj kapasitesi ve onları arabellekte bir tahlil (20 mM HEPES, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2 mM Na2HPO4, 5 mM D-glikoz, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2ve % 1 insan serum albümin) 105 resuspend < /C13 > hücreler/50 µL veya daha az ve hücreleri (için 1-2 h) 4 ° C'de deneylerde kullanıma hazır kadar tutun.
  6. Tüm biyolojik atık ilgili kurumsal yönergelere uygun bir biçimde atın.
  7. Denetimi hücre nüfus isterseniz, kordon kanı PBMC aktif CD8 T hücrelerden hazırlamak, 5 mL anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları 10 µg/mL ve 1 µg/mL karışımı ile kaplı bir T25 kültür şişesi tam orta de 107 hücreleri yer , sırasıyla.
  8. Ertesi gün, aktif kordon kanı hücreleri balonun kaldırmak için onları yıkamak ile taze 1 x tamamlamak orta ve rekombinant IL-2 huzurunda hücreleri genişletin (100 U/mL) 2 hafta boyunca.
  9. Kordon kanı CD8 arındırmak+ T hücreleri üreticinin yönerge göre piyasada bulunan kit kullanarak negatif immunomagnetic sıralayarak. Hücreleri saymak ve tahlil arabellek medyaya LN ve PB CD8 için 1.3-1.6 adımlarda açıklandığı gibi döviz+ T hücreleri.

2. düzlemsel Lipid Bilayers hazırlanması için bileşenler

  1. Başka bir yerde5açıklandığı gibi lipozomlar 3 tür hazırlamak: (a) 0.4 mM DOPC (1,2-dioleoyl -sn- glycero-3-phosphocholine) lipozomlar, (b) 0.4 mM DOPC lipozomlar 33 mol % köpekler-NTA içeren (1,2-dioleoyl -sn- glycero - 3-[(N-(5- amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic asit) succinyl] (amonyum tuz)) lipidler, 4 mol % Biotinyl-Cap-PE içeren (c) 0.4 mM DOPC lipozomlar (1,2-dioleoyl -sn- glycero-3-phosphoethanolamine - N-(kap biotinyl) (sodyum tuzu)).
  2. %5 kazein çözüm yukarıda açıklanan5olarak hazırlayın.
    1. 5 g kazein tozu Ultrasaf Su 100 ml dağıtılması ve 10 M sodyum hidroksit 350 µL ekleyin. Her şey üzerinde düzenli bir manyetik karıştırıcı, oda sıcaklığında 2 h için kullanılabilir ölçeğine göre yavaş hızda karıştırın ve sonra 4 ° C'de gece 7.3 ve ultracentrifuge 100.000 x g 4 ° C'de 2 h için çözüm pH ayarlama Süpernatant 0,22 µm steril filtre ile filtre ve çözüm aliquots-80 ° C'de depolayın
      Dikkat: Sodyum hidroksit çözüm kimyasal yanıklara neden ve gözlerle temas üzerine kalıcı körlüğe neden olabilir. Lastik eldiven, Emanet giyim ve göz koruması bu kimyasal ya da çözümleri işlerken kullanır.
  3. Etiket anti-CD3 antikor ile mono-bionylated antikor molekülleri ile yukarıda açıklanan yaklaşım8üretmek için biotin.
    1. Dimetil sülfoksit (DMSO) 0.1 mg/mL, Biotin-PEO4-NHS çözeltilerine hazırlayın. Antikor fosfat tamponlu tuz (PBS) 100 mM sodyum bikarbonat içeren 0.5 ml 1 mg Biotin-PEO4-NHS çözüm 3.7 µL ekleyin.
    2. Karışımı oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya. Alexa Fluor 488 NHS ester adlı 10 mg/mL DMSO çözeltisi hazırlamak. Alexa Fluor 488 NHS ester çözüm Biotin-PEO4-NHS tarafından 10 kat molar aşırı etiketli antikor ekleyin.
    3. Karışımı yavaş karıştırma üzerinde düzenli bir manyetik karıştırıcı ile Oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. İlişkisiz boya boyutu-dışlama Kromatografi kullanarak ayırın.
    4. 280, antikor çözümün optik yoğunluk ölçerek antikor konsantrasyonu belirlemek nm (bir280). 577, etiketli antikorlar optik yoğunluğunu ölçmek nm (bir577).
    5. Boya antikor oranı aşağıdaki denklemi kullanarak belirleyin:
      Equation
      Not: ek ayrıntılar üreticinin iletişim kuralı'nda bulabilirsiniz.
  4. Rekombinant çözünür ICAM-1 protein3,4,9,10daha önce açıklandığı gibi bir Drosophila ifade sisteminde hızlı.
    1. Klon cDNA kodlama ile ICAM-1 ectodomain içine Drosophila ifade vektör DEVRESEL_ÖDEME/V5-O'nun bir His ile eklenmiş bir Rekombinant protein üretmek için bir indüklenebilir metallothionein organizatörü ile6 etiketi C-terminal ucunda.
    2. S2 hücreleri elde edilen ICAM-1 içeren plazmid ve G418 ifade vektör Co transfect. Kararlı transfectants % 10 fetal buzağı serum (FCS) ve 0,5 mg/mL G418 ile 3 hafta boyunca takıma Schneider'ın Drosophila medya kullanarak seçin. Serum içermeyen böcek orta hücrelerde genişletin ve bir protein ifade ile 0,5 mM CuSO4 3 d için teşvik.
    3. Kültür süpernatant 10 x konsantre ve PBS üzerinden karşı teğet akışı yoğunlaştırıcı yukarıda açıklanan11olarak diyaliz.
    4. Süpernatant konsantre kültür Sepharose ile kovalent immobilize bir anti-ICAM-1 monoklonal antikor içeren bir sütun için geçerli ve ilişkili ICAM-1 50 mM glisin arabelleği, pH 3.0 ile elute. Hemen eluted ICAM-1 protein 2 M Tris arabelleği, pH 8.0 ile etkisiz hale getirin.
    5. PBS, pH 8.0 karşı eluted malzeme diyaliz ve bir sütun içeren Ni-NTA özel diyaliz malzeme ekleyin. Çözünür ICAM-1 200 mM imidazole, pH 8.0 ile elute. PBS arabellek, pH 8.0 karşı eluted malzeme diyaliz.
    6. Arıtılmış ICAM-1 Cy5 NHS ester göre üreticinin yönerge ile etiketleyin.
      Not: En iyi son boya protein oranı 1: 1'dir.
  5. Fab üretmek papain sindirim tarafından bir anti-CD107a antikor parçaları ve Fab arındırmak parçaları3daha önce açıklandığı gibi İyon Kromatografi tarafından. Etiket Alexa Fluor 568 NHS ester göre üreticinin yönerge ile Fab parçaları.

3. düzlemsel Lipid Cam destekli Bilayers oluşumu

  1. Bir taze asidik piranha çözüm 140 mL konsantre sülfürik asit ve % 30 hidrojen peroksit 60 mL karıştırarak hazırlayın. Cam coverslips akışı slaytlar için onları 30 dk. tutun asit piranha çözümde cam coverslip Polipropilen makas tipi forseps ile ıslatarak yıkayın.
    Dikkat: Son derece güçlü bir oksitleyici Piranha çözümdür. Aşınma koruyucu gözlük ya da gözlük ya da kalın lastik eldiven ile birlikte tam yüz bir kalkan çözüm işleme sırasında her zaman unutmayın. Piranha çözüm bir duman başlık altında sadece çalışmak. Patlayabilir o olabilir gibi Isıtma, taşıma veya herhangi bir anında kullanım, sallıyorum kaçının. Piranha atık kurşun içeren çukur bir cam şişe içine toplamak. Kurumsal Güvenlik Komitesi uygun atık kullanımı hakkında başvurun.
  2. Yıkanmış coverslips 7 durulama taze su içeren şişeler sırayla aktarmadan tarafından Ultrasaf Su ile x. Su kalan izin vermek bir yana coverslips ıslak kuru cam geride bırakarak temiz cam kapalı rulo seti.
    1. Alternatif olarak, bir vakum pompa bağlı bir pipet ucu dikkatle kalan su damlacıkları coverslips kaldırmak için kullanın.
  3. Steril başlık, lipozom mix bilayers yapmak için üretmek için çeşitli lipitler dilutions gerçekleştirin. İlk olarak, DOPC lipozomlar 37 µL ve Biotinyl-Cap-PE lipozomlar 3 µL birleştirir. İkinci olarak, DOPC lipozomlar 14 µL ve köpekler-NTA lipozomlar 15 µL karıştırın. Üçüncü olarak, ilk Mix 1 µL son lipozom karışımı imal etmek ikinci mix 29 µL için ekleyin.
  4. Steril başlık, bir çalışma alanı tarafından kuru coverslips yakın ile ayarlayın. Aliquot 2 µL son lipozom karışımı (bkz. Adım 3.3) tam olarak kendinden yapışkanlı slayt kanal merkezinde. Hemen ve çok hassas bir temiz ve kuru coverslip slayt ile hizalayın ve slayt yapışkan tarafındaki coverslip yavaşça indirin.
    1. Birden fazla slayt hazırlama, iş bir slayt üzerinde teker teker beri lipozom karışımı hızla buharlaşır. Slayt çevirin ve polipropilen makas tipi forseps dış halkasındaki kaydıraklı, slip kaçağı önlemek için slayda sıkıca bağlı olduğundan emin yapma coverslip periferik kişiye hafif bir basınç uygulamak için kullanın.
      Not: kırılma veya coverslip çatlama önlemek için slayt kanalları karşı basın değil.
    2. Slayt üzerinde yeniden açın ve derleme dış slayt tarafındaki bilayer çevresinde kalıcı bir kalem ile çizim 4 nokta tarafından bir damla coverslip ve kanal slayt arasında gibi görünüyor kurulan bilayer konumunu işaretleyin.
  5. Kanal içine ilk enjeksiyon bir sıvı önce kanalın bir bağlantı noktası giriş bağlantı noktası diğer çıkış bağlantı noktası olarak atayın ve bu atama deneme boyunca korumak.
  6. Kabarcıklar oluşturan önlemek için doğrudan kanal giriş liman damlalıklı ucu ucunu bağlayın. Yavaş yavaş slayt kanalları sıcak 50 µL ile doldurun (en azından oda sıcaklığı) tahlil arabellek (bkz. Adım 1.5 arabellek oluşturma için).
  7. 0, 5 M nickel(II) klorür çözüm hazırlamak. 2 mL aliquot su banyosu için 30 dk 37 ° C'de çözümde kazein, çözülme ve bir nikel klorür çözüme 200 µM son bir konsantrasyon ile ek.
  8. Bilayers ilk kanal giriş limanında kazein çözeltinin 100 µL enjekte ve sonra hemen dışarı slayt çıkış noktasındaki 100 µL pipetting tarafından kaldırarak yıkayın. Aynı çözüm ile bilayers 100 µL kazein çözümün her kanal giriş portuna enjekte ve slayt için 45 dakika oda sıcaklığında kuluçka engelleyin.
  9. Aliquots Cy5-ICAM-1-O'nun6 ve streptavidin proteinlerin çözülme. 2 µg/mL her son konsantrasyonu, tahlil arabellekte proteinleri birleştirir. Belgili tanımlık eriyik için 20.000 x g ve herhangi bir toplamları kaldırmak için 4 ° C'de 30 dk santrifüj kapasitesi.
  10. Engelleme çözüm geri kalanı pipetting tarafından slayt kanal çıkış bağlantı noktasından çıkarın. 100 µL ICAM-1 ve streptavidin giriş portuna içeren çözüm enjekte.
  11. Slayt 45 dakika oda sıcaklığında için kuluçkaya. Herhangi bir aşırı protein çözüm çıkış bağlantı noktasından çıkarın. Bilayer 2 yıkama x ilk kanal giriş limanında tahlil tamponunun 100 µL enjekte ve sonra hemen çıkış bağlantı noktası dışında 100 µL kaldırarak.
  12. Alexa-Fluor-488-etiketli bir anti-CD3 antikor tahlil arabelleği için 2 µg/mL nihai bir konsantrasyon ile sulandırmak. Antikor çözeltinin 100 µL slayt giriş portuna enjekte ve oda sıcaklığında 45 dk için kuluçkaya. Herhangi bir aşırı protein çözüm çıkış bağlantı noktasından çıkarın. Bilayer 2 yıkama x 100 µL olduğu gibi adım 3.11 tahlil arabelleği ile.

4. düzlemsel Bilayer ile T hücreleri etkileşim görüntüleme

  1. Sahne ve confocal veya toplam iç yansıma (TIRF) Floresan mikroskop amacı sıcaklığı 37 ° C'de equilibrated kadar onceden Bilayer(s) slaytla ısıtmalı sahnede ayarlayın. Sahne mürekkep işaretleri göre uygun bir konuma taşımak ve floresan Cy etiketli ICAM-1 moleküllerin istihdam bilayer odaklan.
    1. 61 X amaç confocal mikroskop için veya 100 X amaç TIRF mikroskopla uygun filtre ayarlarını kullanın.
  2. Granül için görüntüleme TIRF mikroskobu tarafından serbest, Alexa-Fluor-568-etiketli anti-CD107a eklemek için 4 µg/mL giriş noktalarına hücreleri enjekte önce son bir konsantrasyon, hücre süspansiyon parçaları antikor Fab.
    1. Hazırlanan CD4 resuspend+ T hücreleri izole LN veya PB veya kordon kan ve hücre süspansiyon 50 µL bilayer içeren slayt kanalı giriş bağlantı noktası enjekte.
  3. Alanları istediğiniz sayıda ve kayıt görüntüleri her alanının 1 x 30 dk için her 2 dk sonra enjeksiyon seçin.
  4. Alan parlak, yansıyan ışık ve floresan kanal (Alexa 488 ve Cy5) görüntüleri elde etmek için confocal mikroskop yararlanmak. Alexa-Fluor-488 ve Alexa-Fluor-568 floresans ve widefield Cy5 floresan, hem de TIRF mikroskop üzerinde parlak alan görüntüleme için TIRF modunu kullanın.

5. görüntü analizi

  1. Uygun yazılımı kullanarak alınan görüntüleri analiz. Hücre morfolojisi iletilen ışık görüntü, kümelenmiş ve gözle görülür hasar dışlama veya analiz apoptotik hücreler içinde gözlemlemek. Analizde sadece üretken bilayer yüzey (Örneğin, Alexa-Fluor-488 Floresan (anti-CD3 antikor) arayüz biriken hücreler) ile etkileşim hücreler içerir.
  2. 20 dk hücre adezyon alanının boyutu hücre bilayer etkileşim başlandıktan sonra belirleyin.
    Not: Parazit yansıması mikroskobu (IRM) resim hücre bilayer arabirimde geliştirilen karanlık alan yapışma alandır.
  3. Cy5-ICAM-1 floresans herhangi bir birikimi ve yüzük kavşak bir oluşum tarafından ayrılmış Cy-ICAM-1 moleküller hücre bilayer arayüz gözlemlemek. Birikmiş ICAM-1 molekülleri bir yapışma halkası kavşak en az iki ardışık görüntülerde oluşan isterseniz bu tür hücrelerin periferik supramolecular aktive küme (pSMAC)12gelişmekte olan hücreler olarak belirleyin.
  4. Granül sürümü hücre yakın temas bölgesinin dışında arka plan floresans üzerinde T hücre bilayer arabirimi Alexa-Fluor-568 floresans yoğunlukta ölçerek değerlendirin. Alexa-Fluor-568 sinyal-için-arka plan en az 1,3 oranında hücreleri degranulating hücreler olarak belirleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İlk olarak, biz aktif kordon kanı türevi CD8 tarafından kurulan sinaptik arabirimi yapısını göre+ T hücre lipid bilayers maruz inşa ikisinden biri içinde geleneksel büyük ölçekli akışı (bkz: ayrıntılı bilgi için Malzemeler tablo ) hücre sistemleri1 ,2,3,4 veya çok kanallı akışı slaytlar. Bilayers floresan etiketli anti-CD3 ve ICAM-1 50 molekülleri/µm2 ve 300 molekülleri/µm2, sırasıyla içeriyordu. CD8+ T hücreleri insan kordon kanı türetilmiş bir stimülasyon ile plaka bağlı anti-CD3 ve anti-CD28 antikorlar13,14tarafından harekete geçirmek. CD8 arasında hiçbir fark+ T hücreleri kurulan bu klasik immünolojik sinapslarda üzerinde akış hücresini veya çok kanallı akışı slayt (Şekil 1) inşa lipid bilayers. Çok kanallı akışı slaytları yapılan lipid bilayers ile diğer deneyler yapıldı.

Sonra biz insan CD4 PB ve LN türetilmiş yeteneği muayene+ T hücreleri düzlemsel lipid bilayers ile sinaptik arabirimleri oluşturmak ve granül serbest bırakmak için. Biz TIRF mikroskobu görüntülenmeyecektir için hücreleri degranulating ve granül yayın kinetik değerlendirmek için T hücre bilayer arabirimi dikey çözünürlüğü en üst düzeye çıkarmak için kullandı. Biz her iki LN ve PBMC türetilen CD4 için 4 hücre grupları gözlenen+ T hücreleri: bazı T hücreler olgun bağışıklık sinapslarda kurulan ama mü ya da granül serbest değildi, granül olgun sinapslarda oluşumu olmadan diğer T hücreleri serbest ve hala diğer T hücreleri ne sinapslarda kurdu ne de tanecikler (Şekil 2)7serbest bırakmak. LN ve PBMC türetilen CD4 arasındaki fark+ T hücreleri granül yayın kinetik değerlendirildiğinde belirgin oldu. CD4 PBMC elde edilen+ T hücreleri granül neredeyse iki kat daha hızlı CD4 LN kaynaklı olarak serbest başlamak mümkün+ hücreleri (Şekil 3)7. Genel olarak, verileri CD4 LN ve PBMC türetilen bir heterojenite rağmen göstermek+ T hücreleri, yer alan İkincisi bir kısmını T hücreleri hızlı degranulation yeteneğine sahip.

Figure 1
Şekil 1: akış slayt sistemi ve geleneksel akışı odası karşılaştırılması. Çok kanallı akışı slayt 6 cam destekli düzlemsel lipid bilayers bir derleme izin (A) Bu panel gösterir. Her bilayer teslim ve çıkış bağlantı noktaları için bağlı. 1 x 10 daha az5 analiz için yeterli hücrelerdir. (B) Bu panel 1 düzlemsel lipid Cam destekli bilayer bir derleme izin geleneksel akış odası sistemi gösterir. 2 x 106 hücre analizi için gereklidir. Diğer paneller (C ve D) temsilcisi TIRF mikroskobu ve (E ve F) göstermek parazit yansıma mikroskobu ile confocal (IRM) tarafından geliştirilen arabirimi görüntülerini kordon kanı türevi CD8 T hücreleri harekete geçirmek. Hücreleri ICAM-1 (300 molekülleri/µm2) ve anti-CD3 antikor (50 molekülleri/µm2) satın içeren bir lipid bilayer (C ve E) akış slaytlar veya (D ve F) bir geleneksel sinin benzer koşullar altında akış sistemi. TIRF mikroskobu ve IRM ile confocal görüntüleri 100 X ve 60 X büyütme hedefleri, sırasıyla kullanarak alınır. Form olgun bilayers synapses T hücre yüzdesi ya akışı slayt inşa veya geleneksel akışı odası çok benzer ama % 90'dan % 75 deneyler arasında değişir. Tüm görüntüleri, Cy 5 etiketli ICAM-1 molekülleri mavi renkle gösterilir; Alexa-Fluor-488-etiketli anti-CD3 antikor yeşille gösterilir; Alexa-Fluor-568-etiketli anti-CD107a antikorlar CD107a için bağlı kırmızıyla gösterilir; IRM görüntüleri Camgöbeği içinde gösterilir; ve ölçek çubukları uzunluğu 10 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Bir T hücre – bilayer arabirimin yapısı ve degranulation lenf nodu ve periferik desen kan mononükleer CD4+ T hücreleri. LNMC veya PBMC türetilen hücreler sıralı+ T bu hücreleri CD4 ayırmak için 50 molekülleri/µm2 anti-CD3 antikor ve 300 molekülleri/µm2 ICAM-1 protein içeren bilayers maruz kaldılar. Hücreleri ve bilayers arasında arayüz tarafından TIRF mikroskobu görüntüsü. Ölçek çubukları 5 µm.(a)olan bir T hücre - bilayer arabirim temsilcisi bu görüntülerin T hücre – bilayer arabirimleri ve degranulation desen yapısını göstermektedir. (B) aşağıdaki diyagramları gösterir LNMC ve PBMC türetilen CD4 gösterimi+ T hücre sinaptik Arayüzlerin farklı yapısı ve desen granül sürümü ile. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Mononükleer CD4 T hücre – bilayer arabirimi yapısını ve degranulation lenf nodu ve periferik kinetik dinamik değişiklikleri kan+ T hücreleri. (A) Bu panel gösterir saat-bağımlı değişiklikleri T hücre – bilayer arabirimi ve yayımlanan granül görünümünü. 5 µm. (B) Bu panel gösterir LN kaynaklı CD4 tarafından bir granül açıklaması kinetik Nefelometri ölçek çubukları vardır+ T hücreleri (kapalı daireler) ve PBMC elde edilen CD4+ T hücreleri (açık dairelerden). Her bireysel daire tek tek hücreler tarafından algılanabilir granül açıklaması ilk görünümünü zaman gösterir. Medyan ve IQR (interquartile Aralık) tüm scatter araziler için gösterilir. Mann-Whitney testleri T hücre belirtilen grupları arasındaki farkları karşılaştırmak için yapıldı. P < 0,05, ** P < 0,01. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada açıklanan roman tekniği konvansiyonel akışı hücre5 düzlemsel bilayers oluşturmak için gerekli benzer reaktifler kullanır ve başarıyla birincil insan T hücre – bilayer arabirimleri3,4 görüntüleme gerçekleştirmek için uygulanabilir ,15. Teknik floresan molekülleri kullanımı önemli bir azalma sunmaktadır ve 10-20 daha az T hücreleri ile karşılaştırıldığında birincil insan T hücreleri kan ve diğer doku analiz etmek için fırsat oluşturma bir akış hücre sistemi5, x gerektirir.

Bu çalışmada kullanılan enjekte hücre sayısı 60 X amaç alanıyla Imaging başına yaklaşık 50 hücreleri görüntü izin verdi. Daha büyük bir konsantrasyon hücre toplama, analiz için uygun hücre sayısını azaltarak sonuçlandı. Daha fazla enjekte hücre sayısı 10-50 x azaltabilir, ancak hücre sayısı alt sınırı hücre heterojenite, görüntü alanlarının sayısı ve deneysel tasarım bağlıdır. Bazı araştırmacılar daha önce benzer bir hücre sayısı analiz16için gerekli bir cam alt ile bir açık odası inşa bilayers kullandık. Ancak, burada, 0.1 - 0.4 mm, kanal yüksekliği ile açıklanan kapalı sistem hücre eki ve analiz sıvı buharlaşma riski olmadan T hücreli yanıtının eşitlemek hızlı hücre sedimantasyon sağlar. Yapışkan slayt sistemi daha fazla kanal başına en fazla üç bilayers oluşumuna izin verir. Böylece, aynı hücre örnek farklı bilayers hücre davranış analizi ile uyarıcı bir farklı bileşimi, yapışma ve costimulatory moleküller için kullanılabilir.

Yapışkan slaytlar ve coverslips başarılı bilayer oluşumu için derleme sırasında bazı önlemler alınmalıdır. Özellikle, coverslips-meli var olmak tamamen kuru, üzerinde bile az miktarda sıvı sol olarak cam yüzey sızıntı yordamı yıkama bilayer sırasında neden olabilir. Önemlisi, Polipropilen makas tipi forseps (3.4.1 adımda anlatıldığı gibi) kaçağı önlemek için dış halkasındaki ile ilgili kişinin kenarlardaki ekli coverslip bile önemlidir. Herhangi bir kanal giriş bağlantı noktalarını köpüren önlemek önemlidir. Herhangi bir kabarcık bir kanal girerseniz, onlar kaldırmak ve bilayer kanal içinde berbat etmek imkansız. Benzer şekilde, türbülanslı akış sıvı kabarcıkları kanal tanıtmak ve bilayer zarar beri herhangi bir hızlı, pipetting önlemek önemlidir.

Cytolytic granül sürümü CD107a T hücre bilayer arayüzü görünümünü tarafından algılanır. Alexa-Fluor-568-etiketli anti-CD107a antikorların fab bölgeleri CD8 T hücreleri bilayers üzerinde yükleme önce eklenir. TIRF mikroskobu yararlanan alan yaklaşık 100 aydınlatmak için fani bir dalga nm görüntüleme dikey çözünürlüğünü artırmak için izin fani birim tanımlı birimindeki bilayer yukarıda. Çok hızlı bir şekilde 37 ° C'de fani birimi içindeki diffüz, antikor Fabs etiketli algılanabilir bir floresan sinyal üretemeyen. Litik moleküller hücre zarının CD107a membran protein üzerinde T görüntülenir içeren özel organellerin membran füzyonu sırasında farklı yerlerde yüzey hücreleri başvurun. Fabs CD107s protein o zaman bağlı. CD107a protein bağlı, floresan etiketli Fab(s) parlak floresans tespit TIRF mikroskobu, T hücre degranulation gösterge tarafından oluşturmak hareketsiz kümeleri oluşturur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser desteklenmiştir Michael R. Betts için R01AI118694 NIH grant tarafından alt Ödülü 566950 Yuri Sykulev içerir. Sidney Kimmel Kanser Merkezi Bioimaging paylaşılan kaynak mükemmel desteklerinden dolayı teşekkür ediyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CD4 T cell isolation kit, human Miltenyl Biotec 130-096-533
CD8 T cells Isolation Kit, human Miltenyl Biotec 130-096-495
DOPC Avanti Polar Lipids 850375C
DOGS NTA Avanti Polar Lipids 790528C
Biotinyl Cap PE Avanti Polar Lipids 870273C
Human Serum Albumin Octapharma USA NDC 68982-643-01
sticky-Slide VI 0.4 ibidi 80608
Coverslips for sticky-Slides ibidi 10812
Bioptech FCS2 Chamber Bioptech 060319-2-03
anti-CD3 antibody Thermo Fisher Scientific 16-0037-81 OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC
anti- CD28 antibody Genetex GTX14664 9.3 clone
Casein Sigma C5890
Biotin-PEO4-NHS Thermo Fisher Scientific 21329
DMSO Sigma D2650-5
Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification Thermo Fisher Scientific A10235
Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification Thermo Fisher Scientific A10238
Amersham Cy5 NHS Ester GE Life Science PA15101
pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors Thermo Fisher Scientific V412020
pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection ATCC 37409
Serum free Drosophial media Insect-XPRESS Lonza 12-730Q
Hybridoma YN1/1.7.4 ATCC CRL1878 The hybridoma secrets antibody against ICAM-1.
Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B Sigma-Aldrich C9142 Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody.
MasterFlex tangential flow concentrator Cole-Parmer 77601-60 7592-40 Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant
Centramate Lab Tangential Flow Systems Pall Laboratory FS002K10 OS010T12 FS005K10 Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant
Ni-NTA Agarose QIAGEN 30210
Dialysis tubing Spectra/Por 131384
Papain from papaya latex Sigma P3125
mouse anti-human antibody against CD107a BD Bioscences 555798 Clone H4A3
Ansell Natural Blue Gloves Fisher Scientific 19-014-539
Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps Thermo Fisher Scientific 6320-0010
Streptavidin ProZyme SA10
Confocal microscope Nikon Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60X oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table
TIRF microscope Andor Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS)
MetaMorph Premier Image Analysis Software Molecular devices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
  2. Somersalo, K., et al. Cytotoxic T lymphocytes form an antigen-independent ring junction. Journal of Clinical Investigation. 113, 49-57 (2004).
  3. Beal, A. M., et al. Protein kinase C theta regulates stability of the peripheral adhesion ring junction and contributes to the sensitivity of target cell lysis by CTL. The Journal of Immunology. 181, 4815-4824 (2008).
  4. Beal, A. M., et al. Kinetics of early T cell receptor signaling regulate the pathway of lytic granule delivery to the secretory domain. Immunity. 31, 632-642 (2009).
  5. Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 18, Unit 18 13 (2007).
  6. Reuter, M. A., et al. HIV-Specific CD8(+) T Cells Exhibit Reduced and Differentially Regulated Cytolytic Activity in Lymphoid Tissue. Cell Reports. 21, 3458-3470 (2017).
  7. Buggert, M., et al. Limited immune surveillance in lymphoid tissue by cytolytic CD4+ T cells during health and HIV disease. PLoS Pathogens. 14, e1006973 (2018).
  8. Carrasco, Y. R., Fleire, S. J., Cameron, T., Dustin, M. L., Batista, F. D. LFA-1/ICAM-1 interaction lowers the threshold of B cell activation by facilitating B cell adhesion and synapse formation. Immunity. 20, 589-599 (2004).
  9. Anikeeva, N., et al. Distinct role of lymphocyte function-associated antigen-1 in mediating effective cytolytic activity by cytotoxic T lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 6437-6442 (2005).
  10. Steblyanko, M., Anikeeva, N., Campbell, K. S., Keen, J. H., Sykulev, Y. Integrins Influence the Size and Dynamics of Signaling Microclusters in a Pyk2-dependent Manner. The Journal of Biological Chemistry. 290, 11833-11842 (2015).
  11. Anikeeva, N., Lebedeva, T., Sumaroka, M., Kalams, S. A., Sykulev, Y. Soluble HIV-specific T-cell receptor: expression, purification and analysis of the specificity. Journal of Immunological Methods. 277, 75-86 (2003).
  12. Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
  13. Riddell, S. R., Greenberg, P. D. The use of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to clone and expand human antigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 128, 189-201 (1990).
  14. Lin, S. J., Yu, J. C., Cheng, P. J., Hsiao, S. S., Kuo, M. L. Effect of interleukin-15 on anti-CD3/anti-CD28 induced apoptosis of umbilical cord blood CD4+ T cells. European Journal of Haematology. 71, 425-432 (2003).
  15. Anikeeva, N., Sykulev, Y. Mechanisms controlling granule-mediated cytolytic activity of cytotoxic T lymphocytes. Immunologic Research. 51, 183-194 (2011).
  16. Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463, 963-967 (2010).

Tags

İmmünoloji ve enfeksiyon sayı: 137 birincil insan T hücreleri periferik kan lenf düğümleri düzlemsel lipid bilayers yapısı sinaptik arabirimi
Periferik kan ve lenf dokusu birincil insan T hücre sinaptik arabirimi değerlendirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Steblyanko, M., Anikeeva, N.,… More

Steblyanko, M., Anikeeva, N., Buggert, M., Betts, M. R., Sykulev, Y. Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue. J. Vis. Exp. (137), e58143, doi:10.3791/58143 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter