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Immunology and Infection

परिधीय रक्त और लसीकावत् ऊतक से प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं के Synaptic इंटरफेस का आकलन

Published: July 30, 2018 doi: 10.3791/58143
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 2, 4
1Department of Microbiology and Immunology, Thomas Jefferson University, 2Department of Microbiology and Institute for Immunology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Medicine Huddinge, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital Huddinge, 4Departments of Microbiology and Immunology and Medical Oncology, Sidney Kimmel Cancer Center, Thomas Jefferson University

Summary

प्रोटोकॉल planar लिपिड bilayers का उपयोग synaptic इंटरफेस फार्म करने के लिए प्राथमिक polyclonal मानव टी कोशिकाओं की क्षमता का अध्ययन करने के लिए एक तकनीक का वर्णन. हम मानव प्राथमिक टी लिम्फ नोड्स और परिधीय रक्त से व्युत्पंन कोशिकाओं के अंतर synapse गठन की क्षमता दिखाने के लिए इस तकनीक का उपयोग करें ।

Abstract

टी सेल synaptic इंटरफेस की गतिशीलता और संरचनात्मक सुविधाओं की वर्तमान समझ मोटे तौर पर कांच के उपयोग के माध्यम से निर्धारित किया गया है समर्थित planar bilayers और इन विट्रो-व्युत्पन्न टी सेल क्लोन या लाइनों1,2 ,3,4. कैसे इन निष्कर्षों प्राथमिक मानव टी रक्त या लसीकावत् ऊतकों से अलग कोशिकाओं को लागू करने के लिए जाना जाता है, आंशिक रूप से5विश्लेषण के लिए कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या प्राप्त करने में महत्वपूर्ण कठिनाइयों के कारण नहीं है । यहां हम एक मल्टीचैनल प्रवाह स्लाइड का दोहन planar लिपिड सक्रिय और आसंजन अणुओं युक्त bilayers का निर्माण करने के लिए एक तकनीक के विकास के माध्यम से पता । प्रवाह स्लाइड की कम ऊंचाई क्रम में तेजी से सेल अवसादन को बढ़ावा देने के लिए सेल सिंक्रनाइज़: bilayer लगाव है, जिससे शोधकर्ताओं synaptic इंटरफेस गठन और granules रिलीज के कैनेटीक्स के गतिशील अध्ययन करने की अनुमति । हम के रूप में कुछ के रूप में 104 से 105 प्राथमिक cryopreserved टी कोशिकाओं लिम्फ नोड्स (LN) और परिधीय रक्त (पंजाब) से पृथक की synaptic इंटरफेस का विश्लेषण करने के लिए इस दृष्टिकोण लागू होते हैं । परिणामों से पता चलता है कि उपन्यास planar लिपिड bilayer तकनीक स्वास्थ्य और रोग के संदर्भ में रक्त और ऊतकों से प्राप्त प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं के भौतिक गुणों के अध्ययन में सक्षम बनाता है ।

Introduction

टी सेल की संरचनात्मक सुविधाओं के वैज्ञानिक ज्ञान प्रतिरक्षा synapses और टी कोशिकाओं के कार्यात्मक गतिविधि के लिए उनके लिंक मुख्य रूप से सेल लाइनों और पंजाब से व्युत्पंन क्लोन के अध्ययन से उत्पंन किया गया है । किस हद तक इन निष्कर्षों प्राथमिक टी रक्त या मानव लसीकावत् ऊतकों से प्राप्त कोशिकाओं से संबंधित है अस्पष्ट बनी हुई है, टी लसीकावत् और अंय ऊतकों में रहने वाले कोशिकाओं के synaptic इंटरफेस के रूप में इस प्रकार अब तक विश्लेषण नहीं किया गया है । महत्वपूर्ण रूप से, उभरते आंकड़ों का सुझाव है कि ऊतक निवासी और लसीकावत्-अंग-व्युत्पन्न टी कोशिकाओं उनके phenotype और कार्यात्मक गतिविधि में महत्वपूर्ण अंतर हो सकता है उन की तुलना में पीबी6,7. इससे आगे प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं में टी-सेल synaptic इंटरफेस की सुविधाओं को बेहतर ढंग से समझने की जरूरत जम गई है.

इस अंत करने के लिए, हम एक उपंयास मिनी पैमाने पर विकसित किया है लिपिड bilayers का दोहन मल्टीचैनल प्रवाह स्लाइड में निर्मित हमें सक्षम करने के लिए टी के इमेजिंग-सेल/bilayer से कम 105 प्राथमिक टी कोशिकाओं के साथ इंटरफेस मानव पंजाब और LN से अलग । यह उपंयास तकनीक प्राथमिक मानव टी सेल synaptic इंटरफेस के भौतिक गुणों के अध्ययन के क्रम में बेहतर मॉडल और vivo सेल सेल बातचीत में समझने की अनुमति देता है ।

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Protocol

यह अध्ययन हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार आयोजित किया गया था. लिखित सूचित सहमति सभी सहभागियों से प्राप्त की गई थी, और रक्त और लिम्फ नोड नमूनों को पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय में संस्थागत समीक्षा बोर्ड की स्वीकृति के साथ अधिग्रहीत किया गया था (आईआरबी # 809316, आईआरबी # ८१५०५६). सभी मानव विषयों के वयस्क थे । गर्भनाल रक्त के नमूनों कृपया थॉमस जेफरसन विश्वविद्यालय में श्रम और प्रसूति एवं स्त्री रोग विभाग के वितरण द्वारा प्रदान की गई । सभी नमूनों को डी-पहचान मिली ।

1. एक छवि विश्लेषण के लिए CD4+ टी कोशिकाओं का अलगाव

  1. गल 1 मिलीलीटर aliquot जिसमें एकत्र नमूनों में से 107 जमे हुए परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) या लिम्फ नोड mononuclear कोशिकाओं (LNMCs) शामिल हैं । एक बाँझ डाकू में, RPMI की 9 मिलीलीटर के लिए गल कोशिकाओं को जोड़ने के लिए पेनिसिलिन/streptomycin और glutamine के साथ पूरक ।
    1. Centrifugate पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को ३०० x g पर 4 ° c, महाप्राण supernatant, और 10% FBS (पूर्ण माध्यम) युक्त पूरक RPMI के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend । ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक सह2 मशीन में रात भर कोशिकाओं गर्मी ।
  2. अगले दिन, CD4+ टी कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए निर्माता के निर्देश के अनुसार एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके नकारात्मक immunomagnetic छंटाई ।
  3. हौसले से शुद्ध CD4+ टी कोशिकाओं की संख्या को मापने के लिए, एक trypan नीले समाधान की एक बराबर मात्रा के साथ सेल निलंबन के 5 µ एल मिश्रण । एक सेल trypan नीले मिश्रण के साथ एक hemocytometer लोड और hemocytometer के 5 वर्गों के अंदर जीवित कोशिकाओं की गिनती ।
  4. कक्ष संख्या का औसत लें और मूल कक्ष निलंबन में कक्षों की संख्या निर्धारित करें: कक्षों की संख्या/1 mL = औसत गणना x 2 x 104. यदि पृथक कक्षों की कुल संख्या बहुत छोटी है, तो बिना गणना के कक्षों का उपयोग करें ।
  5. 10 मिनट के लिए ३०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक और उंहें एक परख बफर में resuspend (20 mM HEPES, पीएच ७.४, १३७ एमएम NaCl, 2 एमएम ना2HPO4, 5 एमएम डी-ग्लूकोज, 5 एमएम KCl, 1 एमएम MgCl2, 2 एमएम CaCl2, और 1% ह्यूमन सीरम एल्ब्युमिन) 105 < /c13 > cells/50 µ l या कम और कोशिकाओं को 4 ° c (1 – 2 h के लिए) जब तक प्रयोग में उपयोग करने के लिए तैयार रखें ।
  6. सभी जैविक अपशिष्ट का निपटान संबंधित संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार करें ।
  7. यदि एक नियंत्रण सेल जनसंख्या के रूप में वांछित, गर्भनाल रक्त PBMC से सक्रिय सीडी 8 टी कोशिकाओं को तैयार, एक T25 संस्कृति में पूर्ण माध्यम के 5 मिलीलीटर में 107 कोशिकाओं जगह विरोधी CD3 और विरोधी CD28 एंटीबॉडी के एक मिश्रण के साथ कवर 10 µ जी/एमएल और 1 µ जी/ क्रमशः.
  8. अगले दिन, कुप्पी से सक्रिय गर्भनाल रक्त कोशिकाओं को हटा दें, उन्हें ताजा पूरा माध्यम के साथ 1x धोने और 2 सप्ताह के लिए रिकॉमबिनेंट आईएल-2 (१०० यू/एमएल) की उपस्थिति में कोशिकाओं का विस्तार ।
  9. निर्माता के निर्देश के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके नकारात्मक immunomagnetic छँटाई करके गर्भनाल-रक्त सीडी 8+ टी कोशिकाओं को शुद्ध करें. कोशिकाओं गिनती और मीडिया परख बफर के लिए विनिमय के रूप में चरण 1.3-1.6 के लिए LN और पीबी सीडी 8+ टी कोशिकाओं में वर्णित है ।

2. Planar लिपिड Bilayers की तैयारी के लिए अवयव

  1. 3 तरह के liposomes के रूप में तैयार कहीं और वर्णित5: (a) ०.४ mm DOPC (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) liposomes, (b) ०.४ mm DOPC liposomes युक्त ३३ मॉल% कुत्ते-ंत् (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5- एमिनो-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl] (अमोनियम सॉल्ट)) रक्तदाब, (ग) ०.४ एमएम DOPC liposomes युक्त 4 मॉल% Biotinyl-कैप-पे (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cap Biotinyl) (सोडियम साल्ट)) ।
  2. 5% कैसिइन समाधान तैयार के रूप में पहले वर्णित5।
    1. ultrapure पानी के १०० मिलीलीटर में कैसिइन पाउडर के 5 ग्राम भंग और 10 एम सोडियम हीड्राकसीड के ३५० µ एल जोड़ें । उपलब्ध पैमाने के अनुसार एक धीमी गति से एक नियमित चुंबकीय सरगर्मी पर सब कुछ हलचल, 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर । ७.३ के लिए पीएच समायोजित करें और 4 ° c पर १००,००० x g में 2 ज के लिए समाधान ultracentrifuge । एक ०.२२ µm बाँझ फिल्टर के साथ supernatant फ़िल्टर और aliquots में-८० डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान.
      चेतावनी: सोडियम हीड्राकसीड समाधान रासायनिक जलता पैदा कर सकता है और आंखों के साथ संपर्क पर स्थाई अंधापन पैदा कर सकता है । रबर के दस्ताने, सुरक्षा कपड़ों का उपयोग करें, और आंख संरक्षण जब इस रसायन या इसके समाधान से निपटने ।
  3. लेबल एंटी CD3 एंटीबॉडी बायोटिन के साथ मोनो-bionylated एंटीबॉडी अणुओं का उत्पादन करने के लिए एक पहले वर्णित8दृष्टिकोण के साथ.
    1. ०.१ मिलीग्राम/एमएल में dimethyl sulfoxide (DMSO) में बायोटिन-PEO4-एन एच एस का एक समाधान तैयार करें । जोड़ें ३.७ µ एल के बायोटिन-PEO4-एन एच एस समाधान 1 मिलीग्राम एंटीबॉडी के ०.५ मिलीलीटर में फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) १०० मिमी सोडियम बिकारबोनिट युक्त.
    2. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए मिश्रण की मशीन । DMSO में 10 मिलीग्राम/एमएल में Alexa Fluor ४८८ एन एच एस एस्टर का एक समाधान तैयार करें । एक 10 गुना दाढ़ अतिरिक्त पर बायोटिन-PEO4-एन एच एस द्वारा लेबल एंटीबॉडी के लिए Alexa Fluor ४८८ एन एस एस्टर समाधान जोड़ें ।
    3. एक नियमित चुंबकीय सरगर्मी पर धीमी सरगर्मी के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मिश्रण मशीन । असीमित आकार-अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर डाई अलग ।
    4. २८० एनएम (एक२८०) पर एंटीबॉडी समाधान के ऑप्टिकल घनत्व को मापने के द्वारा एंटीबॉडी एकाग्रता का निर्धारण । ५७७ एनएम (एक५७७) में लेबल एंटीबॉडी के ऑप्टिकल घनत्व को मापने ।
    5. डाई-टू-एंटीबॉडी अनुपात निम्न समीकरण का उपयोग कर निर्धारित करें:
      Equation
      नोट: निर्माता के प्रोटोकॉल में अतिरिक्त विवरण ढूंढें ।
  4. एक Drosophila अभिव्यक्ति प्रणाली में एक रिकॉमबिनेंट घुलनशील िकैम-1 प्रोटीन व्यक्त के रूप में पहले3,4,9,10वर्णित है ।
    1. क्लोन, सीडीएनए एंकोडिंग के साथ, िकैम के ectodomain- Drosophila अभिव्यक्ति वेक्टर पीएमटी में 1/V5-अपने एक inducible metallothionein प्रमोटर के साथ एक रिकॉमबिनेंट प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए सी पर एक अपने6 टैग के साथ संलग्न-टर्मिनल अंत ।
    2. परिणामी िकैम-1 युक्त प्लाज्मिड और एक G418 अभिव्यक्ति वेक्टर के साथ सह-transfect S2 कोशिकाओं । Schneider के Drosophila मीडिया का उपयोग करके स्थिर transfectants का चयन करें 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) और ०.५ मिलीग्राम/एमएल के साथ 3 सप्ताह के लिए G418 । सीरम मुक्त कीट मध्यम में कोशिकाओं का विस्तार और 3 डी के लिए ०.५ mM CuSO4 के साथ एक प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित ।
    3. एक स्पर्श प्रवाह संकेंद्रक के माध्यम से पंजाब के खिलाफ 10x और dialyze supernatant संस्कृति ध्यान केंद्रित के रूप में पहले11वर्णित है ।
    4. एक covalently मैटीरियल एंटी-िकैम-1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ Sepharose युक्त कॉलम में केंद्रित कल्चरल supernatant लागू करें और elute बाउंड िकैम-1 को ५० mM glycine बफ़र के साथ, पीएच ३.० । तुरंत एक 2 मीटर Tris बफर के साथ eluted िकैम-1 प्रोटीन बेअसर, पीएच ८.० ।
    5. Dialyze के खिलाफ eluted सामग्री, पीएच ८.० और Ni-ंत् agarose युक्त एक कॉलम में dialyzed सामग्री जोड़ें । Elute घुलनशील िकैम-1 के साथ २०० mM imidazole, pH ८.०. Dialyze एक पंजाबियों बफर के खिलाफ eluted सामग्री, पीएच ८.० ।
    6. निर्माता के निर्देश के अनुसार Cy5 एन एच एस एस्टर के साथ शुद्ध िकैम-1 लेबल ।
      नोट: सबसे अच्छा अंतिम डाई-टू-प्रोटीन अनुपात 1:1 है ।
  5. papain पाचन द्वारा एक विरोधी CD107a एंटीबॉडी से फैब टुकड़े का उत्पादन और आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी द्वारा फैब टुकड़े शुद्ध के रूप में पहले वर्णित3। निर्माता के निर्देश के अनुसार Alexa Fluor ५६८ एन एस एस्टर के साथ फैब टुकड़े लेबल ।

3. कांच समर्थित Planar लिपिड Bilayers का गठन

  1. केंद्रित सल्फर एसिड की १४० मिलीलीटर और 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के ६० मिलीलीटर मिश्रण से एक ताजा अंलीय पिरांहा समाधान तैयार करें । फ्लो स्लाइड्स के लिए ग् coverslips को धो कर उन् हें एसिड पिरांहा सॉल्यूशन में भिगोकर 30 min. के लिए कांच coverslip के साथ पकड़ लो कैंची-प्रकार संदंश ।
    चेतावनी: पिरांहा समाधान एक अत्यंत मजबूत ऑक्सीकरणकर्ता है । समाधान संभालते समय हर समय मोटी रबर के दस्ताने के साथ सुरक्षा चश्मे या काले चश्मे या एक पूर्ण चेहरा ढाल पहनना याद रखें । केवल एक धुएं हुड के तहत पिरांहा समाधान के साथ काम करते हैं । हीटिंग से बचें, परिवहन, या यह विस्फोट हो सकता है, के रूप में उपयोग के दौरान किसी भी समय मिलाते । एक कांच की बोतल में एक सीसा युक्त छेद के साथ पिरांहा अपशिष्ट इकट्ठा । उचित अपशिष्ट उपयोग के बारे में संस्थागत सुरक्षा समिति से संपर्क करें ।
  2. धो coverslips 7x ultrapure पानी के साथ उंहें क्रमिक रूप से ताजा पानी युक्त यूरिन में स्थानांतरित करके कुल्ला । गीला coverslips एक तरफ सेट करने के लिए शेष पानी साफ गिलास बंद रोल, पीछे शुष्क गिलास छोड़ने ।
    1. वैकल्पिक रूप से, ध्यान से coverslips से शेष पानी की बूंदों को हटाने के लिए एक वैक्यूम पंप से जुड़ी एक पिपेट टिप का उपयोग करें ।
  3. बाँझ डाकू में, bilayers बनाने के लिए liposome मिश्रण का उत्पादन करने के लिए विभिन्न लिपिड के कमजोर पड़ने प्रदर्शन करते हैं । पहला, DOPC liposomes के ३७ µ l का मिश्रण और Biotinyl के 3 µ l-कैप-पे liposomes. दूसरा, DOPC liposomes के 14 µ l को मिलाएं और कुत्तों के 15 µ l को-ंत् liposomes. तीसरे, पहले मिश्रण के 1 µ एल जोड़ने के लिए 29 µ एल के लिए दूसरा मिश्रण के अंतिम liposome मिश्रण बनाना.
  4. बाँझ हुड में, शुष्क coverslips के साथ एक कार्यक्षेत्र की स्थापना की । Aliquot 2 अंतिम liposome मिश्रण के µ एल (३.३ कदम देखें) ठीक एक स्वयं चिपकने वाला स्लाइड चैनल के केंद्र में । तुरंत और बहुत ठीक स्लाइड के साथ एक साफ और शुष्क coverslip संरेखित करें और धीरे स्लाइड के चिपचिपा पक्ष पर coverslip कम ।
    1. यदि एक से अधिक स्लाइड तैयार कर रहा है, एक समय में एक स्लाइड पर काम के बाद से liposome मिश्रण तेजी से लुप्त हो जाता है । स्लाइड पर बारी और स्लाइड के साथ coverslip के परिधीय संपर्क करने के लिए एक कोमल दबाव लागू करने के लिए संदंश कैंची प्रकार के बाहरी रिंग का उपयोग करें, सुनिश्चित करें कि स्लिप बाधा रिसाव करने के लिए स्लाइड करने के लिए कसकर संलग्न है.
      नोट: coverslip को तोड़ने या खुर से बचने के लिए स्लाइड के चैनलों के विरुद्ध न दबाएँ.
    2. स्लाइड को फिर से चालू करें और बनाई गई bilayer की स्थिति को चिह्नित करें, जो coverslip और चैनल स्लाइड के बीच एक ड्रॉप की तरह दिखती है, असेंबली के बाहरी स्लाइड पर bilayer के आस-पास स्थाई मार्कर के साथ 4 डॉट्स आरेखित करके ।
  5. चैनल में एक तरल का पहला इंजेक्शन से पहले, चैनल के एक बंदरगाह के रूप में प्रवेश बंदरगाह और अन्य बाहर निकलें बंदरगाह के रूप में निर्दिष्ट और प्रयोग भर में इस पद को बनाए रखने.
  6. बुलबुले बनाने से बचने के लिए, प्लास्टिक टिप के अंत चैनल के प्रवेश बंदरगाह में सीधे डालें । धीरे गर्म के ५० µ एल के साथ स्लाइड के चैनलों को भरने (कम कमरे के तापमान) परख बफर (बफर संरचना के लिए कदम १.५ देखें) ।
  7. एक ०.५ एम निकेल (द्वितीय) क्लोराइड समाधान तैयार करें । गल एक जल स्नान में कैसिइन समाधान के एक 2 मिलीलीटर aliquot 30 मिनट के लिए ३७ ° c में और यह २०० µ मीटर की एक अंतिम एकाग्रता पर एक निकेल क्लोराइड समाधान के साथ पूरक ।
  8. चैनल के एंट्री पोर्ट में कैसिइन सॉल्यूशन के १०० µ l को पहले इंजेक्ट करके bilayers को धो लें और फिर तुरंत pipetting द्वारा स्लाइड पर निकले पोर्ट से १०० µ l को बाहर निकाल दें । प्रत्येक चैनल के प्रवेश बंदरगाह में कैसिइन समाधान के १०० µ एल इंजेक्शन द्वारा एक ही समाधान के साथ bilayers ब्लॉक और कमरे के तापमान पर ४५ मिनट के लिए स्लाइड मशीन ।
  9. गल aliquots ऑफ Cy5-िकैम-१-झी६ आणि streptavidin प्रोटीन. 2 µ g/एमएल प्रत्येक के अंतिम एकाग्रता में परख बफर में प्रोटीन का मिश्रण । २०,००० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए समाधान केंद्रापसारक किसी भी समुच्चय को दूर करने के लिए ।
  10. pipetting द्वारा स्लाइड चैनल के निकास पोर्ट से शेष ब्लॉकिंग समाधान निकालें । िकैम-1 युक्त समाधान के १०० µ एल इंजेक्षन और प्रविष्टि बंदरगाह में streptavidin.
  11. कमरे के तापमान पर ४५ मिनट के लिए स्लाइड मशीन । बाहर निकलें बंदरगाह से प्रोटीन समाधान के किसी भी अतिरिक्त निकालें । bilayer पहले इंजेक्शन के द्वारा 2x १०० µ एल की परख बफर चैनल के प्रवेश बंदरगाह में और फिर तुरंत बाहर निकलें बंदरगाह से बाहर १०० µ l को हटाने ।
  12. एक Alexa-Fluor-४८८-लेबल विरोधी CD3 एंटीबॉडी परख बफर के साथ 2 µ जी के अंतिम एकाग्रता को पतला/ स्लाइड के प्रवेश बंदरगाह में एंटीबॉडी समाधान के १०० µ एल इंजेक्षन और कमरे के तापमान पर ४५ मिनट के लिए यह मशीन । बाहर निकलें बंदरगाह से प्रोटीन समाधान के किसी भी अतिरिक्त निकालें । धो १०० µ एल के साथ bilayer 2x परख के रूप में ३.११ चरण में बफर ।

4. टी कोशिकाओं की इमेजिंग Planar Bilayer के साथ बातचीत

  1. चरण कचौरी और एक फोकल या कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोप का उद्देश्य जब तक तापमान ३७ डिग्री सेल्सियस पर equilibrated है । bilayer (s) के साथ स्लाइड को गरम अवस्था में सेट करें । स्याही के निशान के अनुसार एक उचित स्थिति के लिए मंच ले जाएं और Cy-बला िकैम-1 अणुओं के प्रतिदीप्ति को रोजगार bilayer पर ध्यान केंद्रित ।
    1. फोकल माइक्रोस्कोप के लिए एक 61X उद्देश्य, या TIRF माइक्रोस्कोप के लिए एक 100X उद्देश्य के लिए उपयुक्त फिल्टर सेटिंग्स के साथ, का उपयोग करें ।
  2. दाना रिलीज इमेजिंग के लिए TIRF माइक्रोस्कोपी द्वारा, एलेक्सा जोड़ें-Fluor-५६८-लेबल विरोधी CD107a एंटीबॉडी फैब टुकड़े सेल निलंबन करने के लिए 4 µ g/एमएल के अंतिम एकाग्रता में कोशिकाओं को प्रवेश बंदरगाहों में इंजेक्शन से पहले ।
    1. LN या पंजाब या गर्भनाल रक्त से अलग तैयार CD4+ टी कोशिकाओं resuspend और bilayer युक्त स्लाइड चैनल के प्रवेश बंदरगाह में सेल निलंबन के ५० µ एल सुई ।
  3. खेतों और प्रत्येक क्षेत्र के रिकॉर्ड छवियों की वांछित संख्या का चयन करने के लिए हर 2 मिनट 1x इंजेक्शन के बाद 30 मिनट के लिए ।
  4. शोषण उज्ज्वल क्षेत्र, प्रकाश परिलक्षित, और फ्लोरोसेंट चैनल (Alexa ४८८ और फोकल माइक्रोस्कोप के Cy5) के लिए छवियों का अधिग्रहण । alexa-Fluor-४८८ और alexa-Fluor-५६८ प्रतिदीप्ति और widefield Cy5, साथ ही उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर के लिए TIRF मोड का उपयोग करें ।

5. छवि विश्लेषण

  1. उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अधिग्रहीत छवियों का विश्लेषण. संचारित प्रकाश छवियों में कक्ष आकृति विज्ञान का निरीक्षण करें और विश्लेषण से संकुल और अदृश्य क्षतिग्रस्त या अपोप्तोटिक कोशिकाओं को बाहर निकालें । विश्लेषण में शामिल केवल उन कोशिकाओं है कि उत्पादक bilayer सतह के साथ बातचीत (यानी, कोशिकाओं Alexa-Fluor-४८८ प्रतिदीप्ति (एंटी CD3 एंटीबॉडी) इंटरफेस पर जमते) ।
  2. सेल-bilayer बातचीत की दीक्षा के बाद 20 मिनट में सेल आसंजन क्षेत्र के आकार का निर्धारण ।
    नोट: आसंजन क्षेत्र अंधेरे हस्तक्षेप प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी (IRM) छवियों पर सेल-bilayer इंटरफेस पर विकसित क्षेत्र है ।
  3. सेल-िकैम अंतरफलक पर Cy5-िकैम-1 प्रतिदीप्ति और अलग Cy-bilayer-1 अणुओं द्वारा रिंग जंक्शन के एक गठन के किसी भी संचय का निरीक्षण करें । यदि संचित िकैम-1 अणुओं पर एक आसंजन अंगूठी जंक्शन का गठन कम से लगातार दो छवियों, एक परिधीय supramolecular सक्रिय क्लस्टर (pSMAC) के विकास की कोशिकाओं के रूप में ऐसी कोशिकाओं को नामित12.
  4. सेल के करीब निकटता में संपर्क क्षेत्र के बाहर पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति पर टी सेल-bilayer इंटरफेस पर Alexa-Fluor-५६८ प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के द्वारा दाना रिहाई का मूल्यांकन करें । के अनुपात के साथ कोशिकाओं को निर्दिष्ट Alexa-Fluor-५६८ संकेत करने वाली की पृष्ठभूमि में कम से १.३ के रूप में कोशिकाओं को दानेदार बनाना ।

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Representative Results

सबसे पहले, हम synaptic सक्रिय गर्भनाल द्वारा गठित इंटरफेस की संरचना की तुलना में रक्त व्युत्पंन सीडी 8+ टी कोशिकाओं लिपिड bilayers को उजागर पारंपरिक बड़े पैमाने पर प्रवाह सेल सिस्टम में या तो बनाया (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)1 ,2,3,4 या मल्टीचैनल प्रवाह स्लाइड में । bilayers फ्लोरोसेंट समाहित-विरोधी CD3 और िकैम-1 पर ५० अणुओं/µm2 और ३०० अणु/µm2, क्रमशः । सीडी 8+ टी मानव गर्भनाल रक्त से व्युत्पंन कोशिकाओं प्लेट बाध्य विरोधी CD3 और विरोधी CD28 एंटीबॉडी13,14के साथ एक उत्तेजना से सक्रिय थे । सीडी 8+ टी कोशिकाओं के बीच कोई अंतर नहीं था जो कि या तो फ्लो सेल या मल्टीचैनल फ्लो स्लाइड (चित्रा 1) में निर्मित लिपिड bilayers पर शास्त्रीय प्रतिरक्षा synapses का गठन किया । मल्टीचैनल फ्लो स्लाइड में बने लिपिड bilayers के साथ अन्य सभी प्रयोगों का प्रदर्शन किया गया ।

अगले, हम पंजाब की क्षमता की जांच की और LN-व्युत्पंन मानव CD4+ टी कोशिकाओं को planar लिपिड bilayers और रिलीज granules के साथ synaptic इंटरफेस फार्म । हम TIRF माइक्रोस्कोपी का दोहन करने के लिए टी सेल में ऊर्ध्वाधर संकल्प को अधिकतम करने के लिए visualized दानेदार कोशिकाओं को इंटरफेस bilayer और दाना रिहाई के कैनेटीक्स का मूल्यांकन करने के लिए । हम दोनों के लिए कोशिकाओं के 4 समूहों मनाया LN-और PBMC-CD4+ टी कोशिकाओं: कुछ टी कोशिकाओं परिपक्व प्रतिरक्षा synapses की स्थापना की, लेकिन या तो था या नहीं जारी granules, अंय टी कोशिकाओं परिपक्व synapses के गठन के बिना granules जारी, और अभी भी अंय टी कोशिकाओं न तो synapses का गठन किया और न ही granules (चित्रा 2)7जारी की । LN-और PBMC-व्युत्पंन CD4+ टी कोशिकाओं के बीच अंतर स्पष्ट हो गया जब दाना रिलीज के कैनेटीक्स मूल्यांकन किया गया था । PBMC-व्युत्पन्न CD4+ टी कोशिकाओं के रूप में तेजी से LN-व्युत्पंन CD4+ कोशिकाओं (चित्रा 3)7के रूप में लगभग दो बार granules रिलीज शुरू करने में सक्षम थे । कुल मिलाकर, डेटा प्रदर्शित करता है कि LN के एक विविधता के बावजूद-और PBMC-व्युत्पंन CD4+ टी कोशिकाओं, बाद टी तेजी से दानेदार बनाना कोशिकाओं के एक अंश निहित ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रवाह स्लाइड प्रणाली और पारंपरिक प्रवाह चैंबर की तुलना । (क) इस पैनल मल्टीचैनल प्रवाह 6 ग्लास समर्थित planar लिपिड bilayers के एक विधानसभा की अनुमति स्लाइड से पता चलता है । प्रत्येक bilayer वितरण और निकास बंदरगाहों से जुड़ा हुआ है । से कम 1 x 105 कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए पर्याप्त हैं । (ख) इस पैनल के पारंपरिक प्रवाह चैंबर 1 ग्लास-समर्थित planar लिपिड bilayer के एक विधानसभा की अनुमति प्रणाली से पता चलता है । 2 x 106 कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं । अंय पैनलों शो (सी और डी) प्रतिनिधि TIRF माइक्रोस्कोपी और (ई और एफ) हस्तक्षेप प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी (IRM) सक्रिय गर्भनाल-रक्त व्युत्पंन सीडी 8 टी कोशिकाओं द्वारा विकसित अंतरफलक के चित्र के साथ फोकल । कोशिकाओं को एक लिपिड bilayer युक्त िकैम-1 (३०० अणुओं/µm2) और विरोधी CD3 एंटीबॉडी (५० अणुओं/µm2) का अधिग्रहण (सी और ई) प्रवाह स्लाइड में या (डी और एफ) एक पारंपरिक में उजागर किया गया इसी तरह की स्थितियों के तहत प्रवाह प्रणाली । IRM छवियों के साथ TIRF माइक्रोस्कोपी और फोकल क्रमशः 100X और 60X आवर्धन उद्देश्यों का उपयोग कर लिया जाता है । टी कोशिकाओं का प्रतिशत है कि फार्म का या तो प्रवाह स्लाइड या पारंपरिक प्रवाह कक्ष में बनाया bilayers पर परिपक्व synapses बहुत समान था लेकिन ७५% से ९०% से प्रयोगों के बीच बदलता रहता है । सभी छवियों में, Cy-5-बला िकैम-1 अणु नीले रंग में दिखाया गया है; Alexa-Fluor-४८८-लेबल विरोधी CD3 एंटीबॉडी हरे रंग में दिखाया गया है; Alexa-Fluor-५६८-लेबल विरोधी CD107a एंटीबॉडी CD107a करने के लिए बाध्य लाल रंग में दिखाए जाते हैं; IRM छवियां सियान में दिखाई जाती हैं; और स्केल बार्स लंबाई में 10 µm हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: एक टी कोशिका की संरचना – bilayer इंटरफेस और लिम्फ नोड और परिधीय रक्त mononuclear CD4+ टी कोशिकाओं द्वारा दानेदार बनाना के पैटर्न. LNMC-या PBMC-व्युत्पन्न कोशिकाओं को अलग CD4+ टी कोशिकाओं है कि bilayers के ५० अणुओं/µm2 विरोधी CD3 एंटीबॉडी और ३०० अणुओं/µm2 के िकैम-1 प्रोटीन से युक्त करने के लिए हल किया गया था । कोशिकाओं और bilayers के बीच इंटरफेस TIRF माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged था । पैमाने सलाखों के 5 µm हैं । (क) एक टी सेल के इन प्रतिनिधि छवियों-bilayer अंतरफलक टी कोशिका की संरचना-bilayer इंटरफेस और दानेदार बनाना पैटर्न प्रदर्शित करता है । (ख) इन आरेखों LNMC-और PBMC-व्युत्पन्न CD4+ टी कोशिकाओं synaptic इंटरफेस और दाना रिहाई के पैटर्न के एक अलग संरचना के साथ का प्रतिनिधित्व दिखाने. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एक टी कोशिका की संरचना के गतिशील परिवर्तन – bilayer इंटरफेस और लिम्फ नोड और परिधीय रक्त mononuclear CD4+ टी कोशिकाओं के एक दानेदार के कैनेटीक्स. (क) यह पैनल एक टी सेल के समय पर निर्भर परिवर्तन-bilayer इंटरफेस और जारी granules की उपस्थिति से पता चलता है । पैमाने सलाखों के 5 µm हैं । (ख) यह पैनल LN-व्युत्पन्न CD4+ टी कोशिकाओं (बंद हलकों) और PBMC-व्युत्पन्न CD4+ टी कोशिकाओं (खुला हलकों) द्वारा एक दाना रिहाई के कैनेटीक्स की एक quantitation से पता चलता है. प्रत्येक व्यक्ति सर्कल व्यक्तिगत कोशिकाओं द्वारा एक detectable दाना जारी की पहली उपस्थिति के समय को इंगित करता है । औसत और IQR (interquartile रेंज) सभी तितर बितर भूखंडों के लिए दिखाए जाते हैं । मान-Whitney परीक्षण T कोशिकाओं के संकेत समूहों के बीच अंतर की तुलना करने के लिए किया गया था । * p < 0.05, * * p < 0.01 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

उपंयास तकनीक यहां वर्णित इसी तरह का उपयोग करने के लिए पारंपरिक प्रवाह सेल5 में planar bilayers बनाने और सफलतापूर्वक प्राथमिक मानव टी सेल के इमेजिंग-bilayer इंटरफेस3,4 प्रदर्शन के लिए लागू किया जा सकता है आवश्यक एजेंट ,15. तकनीक फ्लोरोसेंट अणुओं के उपयोग में एक महत्वपूर्ण कमी प्रदान करता है और 10 की आवश्यकता है-20x कम टी कोशिकाओं के रूप में एक प्रवाह सेल सिस्टम5की तुलना में, के लिए रक्त और अंय ऊतकों से प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं का विश्लेषण करने का अवसर पैदा ।

इस अध्ययन में प्रयुक्त इंजेक्शन कोशिकाओं की संख्या हमें एक 60X उद्देश्य के साथ इमेजिंग क्षेत्र प्रति ५० कोशिकाओं के बारे में छवि के लिए अनुमति दी । एक बड़ा एकाग्रता कोशिका एकत्रीकरण के परिणामस्वरूप, विश्लेषण के लिए उपयुक्त कोशिकाओं की संख्या को कम करने. हम आगे 10 इंजेक्शन कोशिकाओं की संख्या को कम करने सकता है-50x, लेकिन सेल संख्या की कम सीमा सेल विविधता पर निर्भर करता है, इमेजिंग क्षेत्रों की संख्या पर, और प्रयोगात्मक डिजाइन पर. कुछ जांचकर्ताओं पहले एक ग्लास नीचे है कि16विश्लेषण के लिए कक्षों की एक समान संख्या की आवश्यकता के साथ एक खुले चैंबर में बनाया bilayers इस्तेमाल किया है । हालांकि, बंद प्रणाली यहां वर्णित है, के साथ एक चैनल की ऊंचाई ०.१-०.४ mm, तेजी से सेल अवसादन के लिए अनुमति देता है कोशिका लगाव और विश्लेषण के लिए टी सेल प्रतिक्रिया के तरल वाष्पीकरण के जोखिम के बिना सिंक्रनाइज़ । स्टिकी स्लाइड सिस्टम और प्रति चैनल तीन bilayers के गठन की अनुमति देता है । इस प्रकार, एक ही सेल नमूना stimulatory, आसंजन, और costimulatory अणुओं की एक अलग संरचना के साथ विशिष्ट bilayers पर सेल व्यवहार के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

एक सफल bilayer गठन के लिए चिपचिपा स्लाइड और coverslips के विधानसभा के दौरान कुछ सावधानियों लिया जाना चाहिए । विशेष रूप से, coverslips पूरी तरह से शुष्क होना चाहिए, तरल की एक छोटी राशि के रूप में भी कांच की सतह पर छोड़ दिया bilayer धोने की प्रक्रिया के दौरान रिसाव में परिणाम सकता है । महत्वपूर्ण बात, यह भी coverslip के बाहरी अंगूठी के साथ संपर्क के किनारों पर संलग्न के लिए आवश्यक है कैंची-प्रकार संदंश रिसाव से बचने के लिए (जैसा कि चरण 3.4.1 में वर्णित है) । यह भी चैनलों के प्रवेश बंदरगाहों में किसी भी bubbling से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । यदि कोई बुलबुले एक चैनल में प्रवेश, वे लगभग असंभव को हटाने और चैनल में bilayer बर्बाद कर रहे हैं । इसी तरह, यह किसी भी तेजी से बचने के लिए महत्वपूर्ण है pipetting, तरल के अशांत प्रवाह के बाद से चैनल में बुलबुले परिचय और bilayer नुकसान हो सकता है ।

cytolytic granules की एक रिलीज टी सेल-bilayer इंटरफेस में CD107a की उपस्थिति से पता चला है । Alexa-Fluor-५६८ के फैब क्षेत्रों-लेबल विरोधी CD107a एंटीबॉडी bilayers पर लोड करने से पहले सीडी 8 टी कोशिकाओं के लिए जोड़ रहे हैं । TIRF माइक्रोस्कोपी एक evanescent लहर evanescent मात्रा के रूप में परिभाषित मात्रा में bilayer से ऊपर के बारे में १०० एनएम क्षेत्र रोशन करने के लिए, इमेजिंग के ऊर्ध्वाधर संकल्प को बढ़ाने के लिए अनुमति का कारनामे । लेबल एंटीबॉडी Fabs, जो ३७ डिग्री सेल्सियस पर evanescent मात्रा के भीतर बहुत तेजी से फैलाना, एक जासूस फ्लोरोसेंट संकेत उत्पन्न नहीं करते. विशेष lysosomes के झिल्ली संलयन कोशिका झिल्ली के साथ lytic अणुओं युक्त के दौरान, CD107a झिल्ली प्रोटीन अलग स्थानों में टी कोशिकाओं संपर्क सतह पर प्रकट होता है । Fabs उस समय CD107s प्रोटीन के लिए बाध्य हो जाते हैं । CD107a प्रोटीन से जुड़ी, फ्लोरोसेंट लेबल फैब (एस) के रूप में मोबाइल समूहों है कि TIRF माइक्रोस्कोपी, टी सेल दानेदार बनाने का संकेत द्वारा एक उज्ज्वल प्रतिदीप्ति detectable उत्पंन ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम माइकल आर Betts को R01AI118694 NIH अनुदान द्वारा समर्थित था, जिसमें यूरी Sykulev को उप-पुरस्कार ५६६९५० शामिल है । हम उनके उत्कृष्ट समर्थन के लिए सिडनी Kimmel कैंसर केंद्र को साझा संसाधन का धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CD4 T cell isolation kit, human Miltenyl Biotec 130-096-533
CD8 T cells Isolation Kit, human Miltenyl Biotec 130-096-495
DOPC Avanti Polar Lipids 850375C
DOGS NTA Avanti Polar Lipids 790528C
Biotinyl Cap PE Avanti Polar Lipids 870273C
Human Serum Albumin Octapharma USA NDC 68982-643-01
sticky-Slide VI 0.4 ibidi 80608
Coverslips for sticky-Slides ibidi 10812
Bioptech FCS2 Chamber Bioptech 060319-2-03
anti-CD3 antibody Thermo Fisher Scientific 16-0037-81 OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC
anti- CD28 antibody Genetex GTX14664 9.3 clone
Casein Sigma C5890
Biotin-PEO4-NHS Thermo Fisher Scientific 21329
DMSO Sigma D2650-5
Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification Thermo Fisher Scientific A10235
Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification Thermo Fisher Scientific A10238
Amersham Cy5 NHS Ester GE Life Science PA15101
pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors Thermo Fisher Scientific V412020
pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection ATCC 37409
Serum free Drosophial media Insect-XPRESS Lonza 12-730Q
Hybridoma YN1/1.7.4 ATCC CRL1878 The hybridoma secrets antibody against ICAM-1.
Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B Sigma-Aldrich C9142 Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody.
MasterFlex tangential flow concentrator Cole-Parmer 77601-60 7592-40 Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant
Centramate Lab Tangential Flow Systems Pall Laboratory FS002K10 OS010T12 FS005K10 Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant
Ni-NTA Agarose QIAGEN 30210
Dialysis tubing Spectra/Por 131384
Papain from papaya latex Sigma P3125
mouse anti-human antibody against CD107a BD Bioscences 555798 Clone H4A3
Ansell Natural Blue Gloves Fisher Scientific 19-014-539
Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps Thermo Fisher Scientific 6320-0010
Streptavidin ProZyme SA10
Confocal microscope Nikon Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60X oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table
TIRF microscope Andor Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS)
MetaMorph Premier Image Analysis Software Molecular devices

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References

  1. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
  2. Somersalo, K., et al. Cytotoxic T lymphocytes form an antigen-independent ring junction. Journal of Clinical Investigation. 113, 49-57 (2004).
  3. Beal, A. M., et al. Protein kinase C theta regulates stability of the peripheral adhesion ring junction and contributes to the sensitivity of target cell lysis by CTL. The Journal of Immunology. 181, 4815-4824 (2008).
  4. Beal, A. M., et al. Kinetics of early T cell receptor signaling regulate the pathway of lytic granule delivery to the secretory domain. Immunity. 31, 632-642 (2009).
  5. Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 18, Unit 18 13 (2007).
  6. Reuter, M. A., et al. HIV-Specific CD8(+) T Cells Exhibit Reduced and Differentially Regulated Cytolytic Activity in Lymphoid Tissue. Cell Reports. 21, 3458-3470 (2017).
  7. Buggert, M., et al. Limited immune surveillance in lymphoid tissue by cytolytic CD4+ T cells during health and HIV disease. PLoS Pathogens. 14, e1006973 (2018).
  8. Carrasco, Y. R., Fleire, S. J., Cameron, T., Dustin, M. L., Batista, F. D. LFA-1/ICAM-1 interaction lowers the threshold of B cell activation by facilitating B cell adhesion and synapse formation. Immunity. 20, 589-599 (2004).
  9. Anikeeva, N., et al. Distinct role of lymphocyte function-associated antigen-1 in mediating effective cytolytic activity by cytotoxic T lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 6437-6442 (2005).
  10. Steblyanko, M., Anikeeva, N., Campbell, K. S., Keen, J. H., Sykulev, Y. Integrins Influence the Size and Dynamics of Signaling Microclusters in a Pyk2-dependent Manner. The Journal of Biological Chemistry. 290, 11833-11842 (2015).
  11. Anikeeva, N., Lebedeva, T., Sumaroka, M., Kalams, S. A., Sykulev, Y. Soluble HIV-specific T-cell receptor: expression, purification and analysis of the specificity. Journal of Immunological Methods. 277, 75-86 (2003).
  12. Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
  13. Riddell, S. R., Greenberg, P. D. The use of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to clone and expand human antigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 128, 189-201 (1990).
  14. Lin, S. J., Yu, J. C., Cheng, P. J., Hsiao, S. S., Kuo, M. L. Effect of interleukin-15 on anti-CD3/anti-CD28 induced apoptosis of umbilical cord blood CD4+ T cells. European Journal of Haematology. 71, 425-432 (2003).
  15. Anikeeva, N., Sykulev, Y. Mechanisms controlling granule-mediated cytolytic activity of cytotoxic T lymphocytes. Immunologic Research. 51, 183-194 (2011).
  16. Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463, 963-967 (2010).

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १३७ प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं परिधीय रक्त लिम्फ नोड्स planar लिपिड bilayers संरचना synaptic इंटरफेस
परिधीय रक्त और लसीकावत् ऊतक से प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं के Synaptic इंटरफेस का आकलन
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Steblyanko, M., Anikeeva, N., Buggert, M., Betts, M. R., Sykulev, Y. Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue. J. Vis. Exp. (137), e58143, doi:10.3791/58143 (2018).

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