Livre de calibração em Vitro quantificação da proteína Homo-oligomerização usando instrumentação comercial e livre, Open Source Software de análise de brilho

Da proteína-proteína interações eu n Vitro

Tradicionalmente, cristalografia e experimentos de ressonância magnética nuclear combinados com microscopia cryo-elétron (cryoEM) são as tecnologias escolhidas para descrever com precisão a arquitetura tridimensional de proteínas e inferir sua função por examinando seus detalhes estruturais de alta resolução. Proteínas, no entanto, não são estruturas estáticas e podem se submeter a uma variedade de mudanças conformacionais e vibrações no tempo e no espaço. Eis porque estruturais informações cristalográficas ou CryoEM de dados precisa ser complementado com outras técnicas (por exemplo, simulações de dinâmica molecular e molécula técnicas): a função de uma proteína está relacionada com sua conformacional alterações e interações e esta informação não está presente em uma estrutura estática. A fim de sondar para dinâmica intra molecular, técnicas baseadas numa única molécula Forster ressonância transferência de energia (smFRET) são muito eficaz¹. Essas abordagens são capazes de avaliar diferentes subpopulações de moléculas em meios complexos. Isto é muito importante, como essas mudanças são rápidas e ocorrem durante a aquisição dos dados (ou seja, nanossegundos para segundo intervalo).

Duas abordagens principais são comumente empregadas para detectar e quantificar estas mudanças: proteínas em solução e superfície-imobilização. Para a deteção de interações inter moleculares e, em particular, o processo de dimerização induzida por ligantes, smFRET nem sempre é a melhor ferramenta. Com efeito, FRET depende não só a distância (≈10 nm), mas também na orientação dos dois dipolos (doador e aceptor, χ²) e a sobreposição das emissões doador com espectros de absorção^{2 do aceitador}, mas talvez esta última circunstância é menor importante desde que o experimentalista pode escolheu o casal certo de traste. Uma desvantagem particular do smFRET para sondar homo-dimerização provém da rotulagem da proteína de interesse: para smFRET hetero, dimerização só pode ser detectado até 50% (ou seja, hetero-FRET só será capaz de detectar o doador-aceitador e doador-aceitador homo-dímeros mas não doador-doador ou aceptor-aceitador, que é os outros 50% dos dímeros). O uso de espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) e derivados (FCCS, etc.³) para determinar as constantes de difusão de proteína e vinculação constantes em vitro é outra alternativa. Essas abordagens não são capazes de totalmente quantificar homo-dimerização ou, como no FCS um medidas concentração e difusão e o raio e a difusão coeficiente de uma partícula difusão dependem muito mal o peso molecular; por exemplo um aumento de 10 vezes o peso molecular apenas implicará uma mudança de 2,15 dobra na difusão coeficiente⁴. No caso de duas cores FCS ou FCCS, apenas 50% dos homo-dímeros será considerada pelo mesmo motivo acima. Abordagens mais práticas e quantitativas para detectar homo-dimerização in vitro e em vivo são homo-FRET⁵ e o número e o brilho (N & B)⁶. Dado o fato de que homo-FRET requer recuperação de instrumentação específica do anisotropy valor (ou seja, óptica elementos/analisadores para recuperar a polarização paralela e perpendicular), N & B é apresentado aqui como uma técnica favorável para detecta a proteína homo-dimerização e agregação. Pode ser empregado tanto in vitro e em vivo com uma armadilha comercial.

Número e brilho

N & B tem sido recentemente revistos⁷. Essa revisão focada sobre a aplicação da técnica em células vivas. Vale a pena reproduzir aqui o formalismo matemático como estas equações será aplicado aos dados coletados em vitro. Em primeiro lugar, é necessário definir alguns termos e quantidades matemáticas:

• Uma entidade é um conjunto de moléculas que são vinculados juntos.
• O brilho ε de uma entidade é o número de fótons que emite por unidade de tempo (por quadro).
• n é o número de entidades presentes.
• Para um determinado pixel ao longo de uma série de imagem, < i > é que sua média intensidade e σ² é a variância em sua intensidade.

Em seguida, com contagem de fótons detectores e assumindo entidades móveis e sem fundo,

onde N é o número aparente e B é o brilho aparente. Isso resulta em

Damasceno et al ⁸ mostrou que com equipamento analógico, um precisa de três termos de correção: o fator de S, o fundo em deslocamentoe o ruído de leitura σ₀². Então, novamente, supondo que entidades móveis,

dando

Observe que a equação acima é diferente que dado em Damasceno et al ⁸ e uma revisão posterior. ⁷ em Damasceno et al a S no denominador foi omitido devido a um erro de digitação, e esse erro foi reproduzido na revisão. A equação acima é a correta. Instruções para medição S, deslocamento e σ₀² - juntamente com uma explicação do seu significado - são dadas por Damasceno et al ⁸

Ε o brilho é proporcional ao estado oligoméricos das entidades difusão: ε será duas vezes tão grande por dímeros como para monômeros, três vezes maior para Trímeros como para monômeros, o dobro do tamanho para hexâmeros como para Trímeros e assim por diante. Desta forma, medindo o brilho ε, pode-se quantificar qualquer tipo de multimerization.

Se há uma mistura de Estados oligoméricas número de presente, e brilho não é capaz de recuperar os Estados individuais oligoméricos presentes. Esta é uma limitação da técnica.

Detrend software algoritmo e nandb

A importância de corrigir por fotobranqueamento tem sido salientada anteriormente⁹. Fotobranqueamento inevitavelmente ocorre durante experimentos de microscopia de luz no modo de lapso de tempo; tanto em células vivas e em vitro. Muitas abordagens têm sido descritas na literatura para corrigir para o branqueamento de⁷. A técnica de filtragem exponencial com escolha automática de detrending parâmetro T é o atual melhor. Ele é integrado com o livre, open source software nandb⁹. Com efeito, software que requer que o usuário escolher manualmente o parâmetro detrending pode levar a resultados incorretos porque esta escolha do parâmetro provavelmente será arbitrário e incorrecto. O algoritmo automático inspeciona os dados e determina o parâmetro apropriado para ele, sem a necessidade de intervenção do usuário⁹. Mesmo com a melhor escolha de parâmetro de suavização, detrending tem suas limitações e funciona bem apenas com fotobranqueamento porcentagens inferiores a 25%, como mostrado com simulações⁹. Curiosamente, quando usando a rotina detrending automática, sua precisão é tal que um pode trabalhar com valores de brilho baixo (mesmo B < 1.01) e, portanto, de baixa intensidade e ainda ser suficientemente precisas para quantificar homo-dimerização.

Fotobranqueamento também causa outro problema: a presença de fluorophores foto em um complexo de multimer. Assim, por exemplo, um trímero aparecem como um dímero quando uma das três unidades no trímero é não-fluorescente. Hur e Mueller¹⁰ mostraram como corrigir para isso e esta correção também salientou em uma posterior revisão⁷. O software de nandb inclui esta correção⁹.

A FKBP12 F36V sistema

FKBP12F36V é uma proteína que naturalmente não oligomerize, mas é conhecida por dimerizam após a adição da droga (coloquialmente conhecida como o BB dimerizing ligante)^11,AP20187¹². Isso torna um caso de teste ideal para número e brilho: com FKBP12F36V rotulados, uma duplicação de estado oligoméricos deve ser observada após a adição do BB.

1. FKBP12 F36V mVenus - purificação

1. Transforme (DE3) pLysS células com pET22b vetor contendo monomerized humana FKBP12F36V¹² e N-terminal His6 e mVenus tags (vetor disponível a pedido). Células de placa para LB ágar suplementado com 50 µ g/mL ampicilina e cloranfenicol de 34 µ g/mL.
2. Transferir colônias transformadas em cultura 100ml LB e crescer por 16-20 horas a 37 ° C, com agitação.
3. Diluir a cultura starter densa (OD600 > 1) a 1: 100 em meio LB (lotes de 2 x 500 mL) e crescer durante 2-3 horas para OD600 = 0.6 - 0.8 (37 ° C, 200 rpm).
4. Culturas fresca no gelo. Induzir com 250 µM IPTG e crescer por 16-20 horas a 21 ° C, 200 rpm.
5. Recolher as células por centrifugação a 2.000 x g por 20 minutos.
6. Resuspenda o pellet em 40 mL de tampão IMAC (20 mM de fosfato de sódio pH 7,5, 500 mM de NaCl, imidazol de 3 mM, 1 mM β-Mercaptoetanol) suplementado com EDTA livre de inibidores de protease (1 comprimido por centrifugado).
7. Proceda à sonicação células (amplitude de 500 Watts, 20kHz, 40%, 9 s em, 11 s fora por 15 min) em gelo e colheita de material solúvel por centrifugação a 20.000 g x.
8. Transferência solúvel lisado para um Erlenmeyer e adicionar 2 mL de resina (ver Tabela de materiais). Incubar durante 1 hora com rotação 105 rpm
   Nota: Níquel sepharose também pode ser utilizada para esta etapa do IMAC.
9. Resina da colheita e lave com 250 mL de tampão IMAC A seguido por 500 mL de tampão IMAC B (20 mM fosfato de sódio pH 7.5, 500 mM NaCl, imidazol 7 mM, 1mm β-Mercaptoetanol).
   Nota: Aumentar de imidazol 50mm se usando resina sepharose de níquel.
10. Eluir a proteína His6-tag usando IMAC buffer C (20 mM fosfato de sódio pH 7,5, 500 mM de NaCl, imidazol 300 mM, 1mm β-Mercaptoetanol).
11. Injetar em uma exclusão de tamanho coluna (ver Tabela de materiais) incubado no pH HEPES 10mm 7.5, 150 mM de NaCl, 1 milímetro DTT. FKBP12F36V tem sua eluição de pico no mL 87,71 na coluna que usamos.
12. Avaliar a pureza através de SDS-PAGE e piscina e concentrar-se conforme necessário.

2. preparação da chapa do Multiwell matriz

1. Descongelar o FKBP12F36V purificado (ou rotulado da proteína de interesse) de-80 ° C.
2. Preparar uma solução de 100 nM purificado FKBP12F36V (média, 10 mM HEPES pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1 milímetro DTT). Proceda à sonicação e centrifugar (volta rápida de 13.000 rpm) para evitar a formação de agregados.
3. Pipete 100-200 µ l para uma câmara de observação bem 8 com um fundo de vidro.
4. Adicione o dimerizer BB para concentrações finais de 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 e 500 nM^12,13.
5. Como referência, preparar uma solução de 100 nM de mVenus sozinho para avaliar os potenciais efeitos de agregação e precipitação e recuperar um valor de brilho para o monômero com as mesmas configurações de aquisição.

3. calibração livre Confocal aquisição

1. Inicie o sistema confocal (Figura 1). Qualquer luz de microscópio confocal sistema de digitalização equipados com detectores digitais ou bem caracterizadas detectores analógicos⁸e capaz de manter um tempo de interrupção constante para cada pixel adquirida funcionaria.
2. Defina o caminho do feixe de excitação:
   1. Ligue o 514 nm laser e conjunto no nW 20-100 de potência na saída do objectivo (para FKBP12F36V-mVenus).
   2. Selecione o objetivo 63X1.4NA ou o objectivo de imersão de água um colarinho correção projetado para o FCS.
   3. Ligue um HyD, APD ou detector de PGTO calibrado. Detectores de capazes de contagem de fótons são preferíveis, como neste caso, o cálculo de S, deslocamento e σ₀² são desnecessários.
   4. Selecione a janela de emissão de 520-560 nm
   5. Defina o pinhole 1 unidade arejado para o correspondente de emissão ~ 545 nm.
   6. Definir o modo de aquisição de 16 x 16 pixels
   7. Defina o tde tempo de permanência na pixel que_habitam tais que satisfaz t_quadro >> T_D >> t_habitam, onde _D é o tempo de permanência da difusão da proteína e t _frame é a taxa de quadros. Isto correspondia a definir o tempo de interrupção para ~ 13 µs.
      Nota: Alguns fabricantes comerciais tem scanners que não estavam mantendo o tempo de interrupção por pixel constante. Esta constância é fundamental para o método de trabalho.
   8. Definir o tamanho do pixel em ~ 120 nm.
   9. Selecione o modo de aquisição xyt e o número de quadros a serem adquiridos por aquisição e bem (por exemplo 5.000).
   10. Se o sistema é equipado com o modo de alta produtividade, introduza as coordenadas de cada poço e o número de aquisições por alvéolo para automatizar o processo.
       Nota: Tenha cuidado para assegurar a presença de um dispensador de água para se utilizar um objectivo de imersão.
   11. Se o sistema é equipado com um sistema de perfusão, carregar a solução do BB e programar a perfusão para começar a direita-após o quadro do^th de 5000 para avaliar a cinética de dimerização durante a aquisição , por exemplo, de 10.000 imagens.
3. Adicionar uma gota de óleo para o objectivo de imersão de óleo / água se utilizando o objectivo de imersão de água um colarinho correção projetado para o FCS.
4. Monte a câmara 8 observação bem no palco.
5. Selecione o bem correto e concentrar a solução.
   Nota: Importante: evitar focando perto do copo inferior para evitar a reflexão e a dispersão. Quando o foco mais profundo na solução, desligue a opção de foco automático.
6. Iniciar a aquisição e salvar a pilha resultante de imagens no formato TIFF.

4. detrend e análise de brilho usando o pacote de R nandb

1. Como uma verificação de qualidade pré-processamento, use ImageJ¹⁴ para dar uma olhada nas imagens e recuperar o perfil de intensidade, como mostrado na Figura 2um. Isso é útil para determinar se ou não demasiado fotobranqueamento ocorreu. Se houver demasiada branqueamento, os dados não são apropriados para uma análise mais aprofundada.
   Nota: ImageJ também pode ser útil para converter imagens em TIFF de formatos comerciais. O software de nandb descrito abaixo só pode trabalhar com arquivos TIFF.
2. Baixe e instale o R e RStudio^15,16. É melhor fazer o download e instalar R primeiro e, em seguida, RStudio.
   Nota: O que se segue é uma descrição de como usar o pacote de nandb R. Conhecimento da língua R não é necessário para usar nandb, no entanto, isso irá facilitar a vida.
3. Instale o pacote nandb.
   1. Abra RStudio e no console, digite install.packages("nandb") e aguarde a instalação.
4. Conheça nandb
   1. Revise o manual¹⁷.
   2. Rever a ajuda interna do RStudio para várias funções. A função mais provável a ser usado será usando será brightness(). Exibir o arquivo de ajuda para essa função, digite? Brightness() no console.
5. Calcular o brilho
   1. Dizem que um tem um arquivo de imagem na área de trabalho chamado img001.tif (nota que 'nandb' só funciona com arquivos TIFF). Se pode calcular o brilho da imagem:
      b <-brilho ("~/Desktop/img001.tif", tau = "auto")
      1. Ela atribui o brilho da imagem com a variável b em R. O tau = "auto" garante que a imagem é detrended corretamente antes do cálculo do brilho. A coisa mais comum para fazer a partir daqui é calcular a média ou mediano brilho da imagem. Pode fazer isso digitando mean(b) ou median(b). Um pode também gravar a imagem de brilho para a área de trabalho usando
         ijtiff::write_tif (b, "~/Desktop/whatever_img_name")
   2. Dizem que um tem pasta cheia de imagens images_folder na área de trabalho e é necessário calcular os brilhos destas imagens e gravar as imagens de brilho como arquivos TIFF. Então vê? brightness_folder(). Esta função processa uma pasta inteira de uma vez:
      brightness_folder ("~/Desktop/images_folder", tau = "auto")
      Isto é particularmente bom para aqueles que têm um software que eles preferem R, porque todos os arquivos são processados em um único comando, e então um pode continuar a trabalhar com as imagens TIFF do brilho de saída em seu software escolhido, seja ImageJ¹⁴ , Python ou outra coisa.

Brilho detrending e monomérico

Uma vez que os dados foi adquiridos, um pode começar os cálculos de brilho para determinar o estado oligoméricos da proteína de interesse na solução. Mesmo se o efeito de clareamento em solução pode não ser tão drástico como isso pode ser na vivo, o rastreamento de intensidade ainda terá provavelmente não significa estacionária, possivelmente devido a efeitos de photophysical relacionadas com o fluoróforo,18 , mas as razões por trás disso Não são totalmente compreendidos. Isto tem um impacto, ao calcular o brilho; ao tentar determinar as transições de monômero dímero, este aspecto é crucial. Aplicando o automático detrend algoritmo para os dados mostrados na Figura 2um, o rastreamento de intensidade é devidamente corrigido, fornecendo um valor mais preciso para o brilho de FKBP12F36V-mVenus em solução. Antes da adição do BB, sem detrending, B = 1,026, Considerando que depois de detrending, B = 1.005 (Figura 2b).

Determinação de FKBP12 F36V transições de monômero dímero-mVenus em vitro

Sequências de 20.000 imagens de purificado FKBP12F36V - mVenus em solução de 100 nM foram adquiridos como especificado na seção de protocolo. Depois de 10.000 quadros foram adquiridos, a droga homodimerizer BB foi adicionada à solução durante a aquisição. Cada série consecutiva de 5.000 quadros foi analisada (Figura 3). O brilho médio 5 minutos após adição do BB foi B = 1.010, que é um aumento de 2 vezes, indicando um dímero de FKBP12F36V. A cinética do processo é mostrada na Figura 3b; o atraso entre a adição de BB para completo FKBP12F36V dimerização era aproximadamente 2 minutos.

Identificação dos agregados de proteína

Um número de agregados da proteína foram detectado em um número limitado de quadros e também no rastreamento de intensidade (Figura 4). Estes agregados ocorrem naturalmente em solução quando se trabalha com proteínas e podem ser eliminados por sonicating e/ou aumentar a diluição da proteína. No entanto, em alguns problemas biológicos, é preciso detectar transições entre monômeros e grandes agregados. A Figura 4 mostra um exemplo onde uma proteína FKBP12F36V agregada difundida através do volume de observação (imagens 16x16); para nossos cálculos anteriores, que estes dados foram descartados, no entanto, um exemplo é mostrado na Figura 4 para mostrar que esses agregados podem ser detectados e caracterizam usando as mesmas configurações e abordagem. À primeira vista, ao avaliar as 5000 imagens, um pode recuperar o brilho médio de FKBP12F36V-mVenus tratados com BB (B = 1.010). Visualização da imagem crua de brilho, um pode ver claramente, porém, uma região de interesse de aproximadamente 8 pixels com um valor alto de B ≈ 1,080. Esta região de interesse coincide com alguns quadros em t = s 34-37, onde um agregado de FKBP12F36V difundido em torno da área de observação. O agregado não permaneceram no volume observação por muito tempo suficiente para determinar com precisão o seu tamanho.

Figura 1 . Aplicação de N & B para detectar transições de monômero dímero de proteínas em solução. (a) simplificado de percurso óptico de um microscópio (LSM) equipado com uma fonte de laser de exploração do laser (fixado em 514 nm no caso mVenus rotulado proteínas) dirigido (setas azuis) em direção a um objetivo de imersão (no nosso caso, um óleo 63X1.4NA) iluminando uma solução de 100 nM de FKBP12F36V-mVenus solução. A fluorescência de emissão (setas verdes) passa através de um espelho dicroico e é direcionada para um filtro passa-banda que limpa a luz de emissão, e uma pinhole fixado em 1 unidade arejada, situada bem antes de um ponto do detector digital capaz de contagem de fótons. (b) um volume confocal de iluminação é verificado através de 16 x 16 pixels iluminando a única FKBP12F36V-mVenus moléculas que entram e saem o volume confocal de forma gaussiana, produzindo uma matriz de flutuações de intensidade de fluorescência. (c) imagem série adquirida ao longo do tempo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 . Detrending automática é necessário para medir com precisão uma população de monômeros na solução. (a) uma pilha de imagens de 16 x 16 pixels de 5000 foi adquirida conforme descrito na seção de protocolo. A intensidade do primeiro quadro é mostrada juntamente com o perfil de intensidade média de tempo determinado, que mostra o tempo flutuações de termo que podem estar relacionadas ao branqueamento e outros solventes e/ou efeitos de photophysic. Seja qual for a causa para estas flutuações a longo prazo, eles os cálculos de brilho de impacto e, portanto, requerem detrending. Sem automático detrend, fica-se B = 1,026, Considerando que depois automático detrending, B = 1.005. Além disso, o brilho sem (deixou painéis, segunda fileira) e com (neste painéis, segunda fileira) suave de filtragem é mostrada. (b) os mesmos dados apresentaram em (a) foi detrended e os resultados em termos de intensidade e brilho mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 . In vitro N & B são capaz de resolver a transição entre FKBP12F36V monómeros e dímeros em tempo real. a adição da droga dimerizer BB resultou em um aumento de duas vezes no brilho verdadeiro bem depois de 2 min (de 0,005 a 0,010 no verdadeiro brilho molecular). (a) a intensidade do primeiro quadro é mostrada juntamente com o perfil de intensidade média da imagem detrended. O brilho sem (deixou painéis, segunda fileira) e com (neste painéis, segunda fileira) suave de filtragem é mostrada. (b) quer dizer brilho é plotado (cada 5000 quadros) usando o verdadeiro brilho molecular ε. A dimerização ocorre 2 minutos após adição do BB (t = 1 min) em t = 4 min. A curva equipada é uma função sigmoidal de salientar a tendência para a dimerização após a adição da droga dimerizer (BB). Barras de erro representam o erro padrão da distribuição do brilho em cada ponto de tempo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 . In vitro N & B para resolver o tamanho de agregados de proteínas em solução. (a) rastreamento de tempo-resolvido intensidade detrended para a aquisição de FKBP12F36V-mVenus são mostrados juntamente com imagens de brilho (segunda linha). (b) o rastreamento de tempo-resolvido detrended intensidade mostra um máximo na intensidade que é destacada com um círculo pontilhado vermelho (painel esquerdo superior). O primeiro quadro de intensidade que corresponde a esse momento em particular (t = 34 segundos) é mostrado e uma seta vermelha mostra um agregado de FKBP12F36V-mVenus entrando na área de iluminação. Um olhar mais atento na imagem suavizada brilho mostra uma região de interesse que contém altos Estados oligoméricos e o resto da imagem contém uma mistura entre monômeros e dímeros com uma média de B = 1,008. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada para divulgar.