Artigo de método

Neurogênese usando células de Carcinoma embrionário P19

DOI:

10.3791/58225

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27 de abril de 2019

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1Department of Experimental Embryology, Institute of Genetics and Animal Breeding, Polish Academy of Sciences, 2Department of Regenerative Medicine, Maria Skłodowska-Curie Institute - Oncology Center, 3Department of Genomics and Biodiversities, Institute of Genetics and Animal Breeding, Polish Academy of Sciences

Neste artigo

Resumo

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A linha celular da carcinoma embrionária do rato P19 (linha celular P19) é amplamente utilizada estudando o mecanismo molecular da neurogênese com grande simplificação comparada à análise in vivo. Aqui, nós apresentamos um protocolo para o neurogênese ácido-induzido retinóico na linha celular P19.

Resumo

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A linha celular P19 derivada de um teratocarcinoma embrião-derivado do rato tem a habilidade de diferenciar-se nas três camadas do germe. Na presença de ácido retinóico (RA), a suspensão cultivada linha celular P19 é induzida para diferenciar em neurônios. Este fenômeno é extensivamente investigado como um modelo de neurogênese in vitro. Portanto, a linha celular P19 é muito útil para estudos moleculares e celulares associados à neurogênese. Entretanto, os protocolos para a diferenciação neuronal da linha celular de P19 descritos na literatura são muito complexos. O método desenvolvido neste estudo é simples e vai desempenhar um papel na elucidatação dos mecanismos moleculares em anormalidades NEURODESENVOLVIMENTAIS e doenças neurodegenerativas.

Introdução

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Durante o desenvolvimento embrionário, uma única camada de células é transformada em três camadas germinativas separadas1,2,3. Para aumentar as possibilidades de pesquisa de fenômenos ocorridos in vivo, a geração de agregados tridimensionais (corpos embrionários) tem sido desenvolvida como um modelo conveniente. Agregados celulares formados dessa forma podem ser expostos a várias condições que causam diferenciação celular, o que reflete o desenvolvimento do embrião4,5. A linha celular de Carcinoma embrionário P19 murino (linha celular P19) é comumente utilizada como modelo celular para estudos de neurogênese in vitro6,7,8. A linha celular P19 apresenta características de células-tronco pluripotentes típicas e pode diferenciar-se em neurônios na presença de ácido retinóico (RA) durante a agregação celular seguida de crescimento de neurite condições aderentes. Além disso, a linha celular P19 não diferenciada também é capaz de formar células do tipo músculo e cardiomiócitos a influência do dimetil sulfóxido (DMSO)9,10,11,12.

Muitos métodos13,14,15,16 foram relatados para a diferenciação neuronal, mas a metodologia é às vezes complicada e nao fácil de agarrar somente lendo as descrições. Por exemplo, os protocolos às vezes requerem uma combinação do meio modificado de águia de Dulbecco (DMEM) suplementado com uma mistura de soro de bezerro (CS) e soro fetal bovino (FBS)13. Além disso, os meios usados para o desenvolvimento neuronal são compor frequentemente de suplementos de neurobasal e de B2713,14,15,16. Como tal, os métodos existentes contêm complexidade em sua preparação e nosso objetivo aqui é simplificar os protocolos. Neste estudo, Nós demonstramos que DMEM com FBS pode ser utilizado para manter a linha celular P19 (DMEM + 10% FBS) assim como para o desenvolvimento neuronal (DMEM + 5% FBS + RA). Este método simplificado para a neurogênese usando a linha celular P19 nos permite estudar o mecanismo molecular de como os neurônios são desenvolvidos. Além disso, pesquisas sobre doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, também são conduzidas usando P19 celular linha17,18, e acreditamos que o método desenvolvido neste estudo vai desempenhar um papel na elucidatação da mecanismos moleculares em anormalidades NEURODESENVOLVIMENTAIS e doenças neurodegenerativas.

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Protocolo

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1. manutenção da cultura

  1. Cultura da linha celular P19 em meio de manutenção (Dulbecco ' s modificado meio Eagle ' s com 4.500 mg/L de glicose suplementada com 10% FBS, 100 unidades/mL de penicilina e 100 unidades/mL de estreptomicina). Incubar a 37 ° c e 5% CO2.

2. sub-culturas de células

  1. Quando as células atingem aproximadamente 80% de confluência, retire o meio gasto das garrafas de cultura celular (área de superfície 25 cm2).
  2. Lave as células com 2 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) livre de cálcio e magnésio.
  3. Adicione 1 mL de 0,25% de tripsina-EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) na monocamada celular.
  4. Coloque o balão na incubadora CO2 (37 ° c e 5% co2) por 2-3 min.
  5. Avalie o acessório da célula na superfície do balão. Certifique-se de que todas as células são desanexadas e flutuantes no meio.
  6. Adicione 9 mL de meio de manutenção para interromper a atividade enzimática da tripsina.
  7. Ressuscitem as células em meio de manutenção.
  8. Transfira as células para um tubo de 15 mL e centrifugue por 5 min a 200 x g e temperatura ambiente (RT).
  9. Descarte o sobrenadante e adicione 10 mL de meio de manutenção fresco no tubo de 15 mL.
  10. Use a suspensão da célula para determinar o número da célula usando um contador de células de acordo com as instruções do fabricante.
  11. Células de semente a 2 x 104 células/cm2 em um novo balão de 25 cm2 .
  12. Adicione o meio de manutenção até 10 mL.
  13. Coloque o balão com células na incubadora CO2 (37 ° c e 5% co2) por 2-3 dias.

3. digestão de tripsina

  1. Aspirar o meio de manutenção do balão celular. Lave as células uma vez com 2 mL de PBS de cálcio e livre de magnésio.
  2. Adicionar 1 mL de 0,25% de tripsina-EDTA.
  3. Coloque o balão com células na incubadora CO2 a 37 ° c por 2-3 min.
  4. Utilize uma pipeta de 1 mL para dissociar as células com pipetagem dez vezes.
  5. Neutralize a tripsina adicionando 9 mL de meio de diferenciação (o meio de Eagle modificado de Dulbecco com 4500 mg/L de glicose suplementado com 5% FBS, 100 unidades/mL de penicilina e 100 unidades/mL de estreptomicina) sem RA para as células.
  6. Transfira as células para um tubo de 15 mL e centrifugue por 5 min a 200 x g e RT.
  7. Descarte o sobrenadante e adicione 1 mL de meio de diferenciação sem ácido retinóico (RA). Ressuscitem o pellet celular.
  8. Use a suspensão celular para determinar o número da célula usando um contador de células de acordo com a instrução do fabricante.

4. geração agregada

  1. Adicionar 5 μL de ar (1 mM de estoque dissolvido em 99,8% etanol, armazenado a-20 ° c) para o 10 mL de meio de diferenciação e misture bem (concentração final de 0,5 μM RA).
    Nota: RA é sensível à luz. A baixa concentração de EtOH não afeta a diferenciação celular19,20,21.
  2. Adicionar 10 mL de meio de diferenciação (com RA) ao prato de cultura não tratada de 100 mm (dedicado à cultura de suspensão).
  3. Semeie as 1 x 106 células no prato de 100 mm (prato área de superfície 56,5 cm2).
  4. Coloque o balão com células na incubadora a 37 ° c e 5% CO2 por 2 dias, a fim de promover a formação de agregados.
  5. Após 2 dias, troque o meio de diferenciação. Meio aspirado contendo agregados usando uma pipeta de 10 mL e transferência para um tubo de 15 mL em RT.
  6. Permitir que os agregados para resolver por gravidade para 1,5 min em RT.
  7. Descarte o sobrenadante.
  8. Adicionar um novo 10 mL de meio de diferenciação com 0,5 μM de RA utilizando uma pipeta serológica de 10 mL.
    Atenção: Não pipete os agregados celulares para cima e para baixo.
  9. Semeie os agregados em um novo prato de cultura não tratado de 100 mm (dedicado à cultura de suspensão).
  10. Coloque a placa na incubadora (a 37 ° c e 5% CO2) durante 2 dias.

5. dissociação de agregados

  1. Aspirar os agregados celulares usando uma pipeta de 10 mL.
  2. Transfira os agregados para um tubo de 15 mL. Permitir que a célula agregados para resolver por gravidade para 1,5 min.
  3. Retire o sobrenadante.
  4. Lave os agregados com DMEM isoladamente (sem soro e antibiótico).
  5. Permita que os agregados da pilha estabelecam-se pela sedimentação da gravidade para 1,5 minutos no RT.
  6. Aspirar o sobrenadante e adicionar 2 mL de tripsina-EDTA (0,25%).
  7. Coloque os agregados celulares em um banho de água (37 ° c) por 10 min. agitar os agregados suavemente a cada 2 min tocando com uma mão.
  8. Interrompa o processo de tripsinização adicionando 4 ml de meio de manutenção.
  9. A pipeta agrega para cima e para baixo 20 vezes usando a pipeta de 1 mL.
  10. Células centrífugas por 5 min a 200 x g e RT.
  11. Retire o sobrenadante e ressuscitem o pellet celular em 5 mL de meio de manutenção.
  12. Determine o número da célula com um contador de células.

6. células de chapeamento

  1. Adicionar 3 mL por poço de meio de manutenção a uma placa de 6 poços.
  2. Células de semente na placa de cultura de 6 poços em uma densidade de 0,5 x 106/well.
  3. Incubar a 37 ° c com concentração de 5% de CO2 .
  4. Semente as pilhas no vidro da tampa na placa da cultura de 6 poços e executam a imunomarcação com anticorpo MAP2 (confluência de 20%). Use a placa 6-well para isolar o RNA e para executar RT-PCR para map2, Neun, Oct4, NANOG, e GAPDH (confluência de 20%).

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Resultados

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O esquema simplificado de protocolo para indução de neurogênese em linha celular P19 é apresentado na Figura 1. Para definir o caráter da linhagem celular P19 em um estado indiferenciado e durante a neurogênese, utilizou-se o método RT-PCR (reação em cadeia da transcrição-polimerase reversa). A linha celular P19 não diferenciada expressou os genes de pluripotência como cátion orgânico/carnitina transporter4 (Oct4) e NANOG homeobox (NANOG). A...

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Discussão

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Aqui, nós descrevemos um protocolo simples para a neurogênese usando a linha celular P19. Embora muitos relatórios tenham sido publicados a este respeito, uma metodologia detalhada para a indução da neurogênese usando a linha celular P19 permanece obscura. Além disso, utilizou-se um meio DMEM de glicose (4.500 mg/L) de alta simples com 10% de FBS para todo o experimento. Isso nos permitiu realizar o experimento neurogênico de forma amigável e ampliar o uso desse método para o futuro.

Os pontos...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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O estudo foi apoiado financeiramente pelo National Science Centre, Polónia (n º de subvenção. UMO-2017/25/N/NZ3/01886) e KNOW (Centro Nacional de pesquisa líder) consórcio científico "alimentos saudáveis para animais seguros", decisão do Ministério da ciência e do ensino superior n º 05-1/KNOW2/2015

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
6x Corante de Carregamento de DNAEURxE0260-01
AgaroseSigma- AldrichA9539
kit de síntese de cDNAEURxE0801-02
DAPI (4′,6-Diamidine-2′-fenilindol dicloridrato)Sigma- Aldrich10236276001Concentração de trabalho: 1 μ g/mL
DMEM glicose alta (4,5 g/L) com L-glutaminaLonzaBE12-604Q
Etanol 99,8%ChempurCHEM*613964202
Soro Fetal Bovino (FBS)EURxE5050-03
MAP2 anticorpoThermo Fisher ScientificPA517646Diluição 1:100
Kit de reação PCREURxE0411-03
Penicilina/Estreptomicina 10K/10KLonzaDE17-602E
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrado sem Ca2+, Mg2+LonzaBE17- 517Q
Ácido retinóicoSigma- AldrichR2625-50MG  dissolvido em etanol a 99,8%; armazenar em -20 ° C até 6 meses
Anticorpo Secundário (Alexa Fluor 488)Thermo Fisher ScientificA11034Diluição 1:500
Leite desnatadoSigma- Aldrich1153630500
TBE BufferThermo Fisher ScientificB52
Triton-X 100Sigma- AldrichT8787-100ML
Tripsina 0,25% - EDTA em HBSS, sem  Ca2+, Mg2+, combiossoroLM-T1720/500
cultura de células
1 mL Pipetas sorológicasProfilab515.01
Pipetas sorológicas de 10 mLProfilab515.10
Prato de 100 mm dedicado à cultura em suspensãoCorningC351029
Tubos de centrífuga de 15 mLSigma- AldrichCLS430791-500EA
Pipetas sorológicas de 5 mLProfilab515.05
Placa de 6 poçosCorningCLS3516
Frascos de cultura de células, área de superfície 25 cm2Sigma- AldrichCLS430639-200EA
vermelho de fenol Plásticos de

Referências

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