Artigo de método

Indução de ateroma através da ativação de receptores de mineralocorticoide em camundongos deficientes em Apolipoprotein E

DOI:

10.3791/58303

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26 de setembro de 2018

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1Laboratory of Cardiovascular Endocrinology, IRCCS San Raffaele Pisana, Rome, Italy, 2Department of Human Sciences and Promotion of the Quality of Life, San Raffaele Roma Open University, Rome, Italy

Neste artigo

Resumo

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Descreveremos um protocolo para induzir a aterosclerose na raiz da aorta de ApoE- / - ratos alimentados com uma dieta aterogênico, através de uma contínua liberação de aldosterona. Também são descritos métodos para caracterizar a composição da placa bacteriana.

Resumo

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Aterosclerose é devido a uma resposta inflamatória crônica, afetando o endotélio vascular e é promovido por vários fatores, tais como hipertensão arterial, dislipidemia e diabetes. Até à data, não há evidência para apoiar um papel para circulantes de aldosterona como um fator de risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares. Modelos de rato transgénico foram gerados para estudar processos celulares e moleculares que conduzem à aterosclerose. Este manuscrito, descrevemos um protocolo que tira proveito da infusão contínua de aldosterona em ApoE- / - ratos e gera ateroma na raiz aórtica após 4 semanas de tratamento. Estamos, portanto, ilustrar um método para a quantificação e caracterização de lesões ateroscleróticas no nível da raiz da aorta. O valor acrescentado da infusão de aldosterona é representado pela geração de lesões ateroscleróticas ricas em lipídios e células inflamatórias após 4 semanas de tratamento. Descrevemos em detalhes os procedimentos de coloração para quantificar o conteúdo lipídico e macrófagos dentro da placa. Notavelmente, neste protocolo, realizamos coração tecido-incorporação na OCT para preservar a antigenicidade do tecido cardíaco e facilitar a detecção de antígenos de interesse. Análise do fenótipo placa representa uma abordagem válida para estudar a fisiopatologia do desenvolvimento de aterosclerose e identificar novos alvos farmacológicos para o desenvolvimento de drogas anti aterogênico.

Introdução

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A aterosclerose é uma das principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo1. É caracterizada por um estado inflamatório crônico, onde os vasos sanguíneos estão infiltrados por lipídios e leucócitos que determinam a formação de ateroma. A maioria dos eventos cardíacos agudos está associada com eventos trombóticos, devido à ruptura da placa. Propenso a ruptura de placas são definidas como "vulneráveis" e caracterizam-se pela maior infiltração de leucócitos pró-inflamatórios, um núcleo necrótico e um fino fibroso cap2. Nas últimas décadas, estudos clínicos e experimentais clarificaram a complexa fisiopatologia d....

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Protocolo

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O estudo foi aprovado pelo italiano institutos nacionais de cuidados de saúde e comissões de uso, autorização número 493/2016-PR. Todos os procedimentos foram realizados pelas directrizes da Comunidade Europeia para o uso de animais experimentais (Directiva Europeia, 63/2010/UE).

Nota: Implantação subcutânea de minipump osmótica contendo veículo (etanol em solução salina) ou aldosterona (240 µ g · kg-1 · d-1) na semana de 8-10-velhos machos camundongos deficientes para o gene ApoE . Em geral, semana de 8-10-velhos ratos masculinos de ApoE−/− pesam cerca de 25-26 g.

1. disso....

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Resultados

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Em 8-10 semanas ratos de Apo- / - , minipumps foram implantados para infundir com veículo ou aldosterona (Figura 1E-1I) e alimentados com uma dieta aterogênico (42% de gordura da dieta calorias ajustadas) durante 4 semanas. No final do tratamento, os ratos foram sacrificados e perfundidos com PBS e formol a 10% conforme descrito acima. A raiz da aorta foi separada da porção apical do coração e foi incorporada na OCT (

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Discussão

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Aterosclerose é uma doença inflamatória crônica associada com navios grandes e médios envolvendo interações entre vários tipos de células, como macrófagos, linfócitos T, células endoteliais e células de músculo liso1. Apesar das limitações dos modelos aterogênico murino, um vasto corpo de evidências sobre o processo aterosclerótico está disponível. Estes modelos têm a vantagem de gerar rapidamente coortes experimentais de uma idade específica e gênero. Ratos também mostram um fundo genético defini.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado por subsídios do Ministério italiano da saúde (Ricerca Corrente, GR-2009-1594563 e PE-2011-02347070 de M.C.)

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Dieta de calorias ajustadas (42% de gordura)EnvigoTD.88137dieta aterogênica
Minibomba osmótica com tubo de enchimentoAlzetmodelo 1004para realase contínua
AldosteronaSIGMAA9477hormônio
EtanolSIGMA34852-Msolvente
Alchol Preps saturado com álcool isopropílico 70%Kendal Webcol6818de cirurgia desinfetante
(Vicryl 6.0)Demas500004cirurgia
10% Povidona / pomada de iodoAplicare-Meriden52380-0026-1Formalina anti-séptica
10%SIGMAHT5012para fixar vascolatura
CryomoldBio-Optica07-MP1515para incorporação
OCT CompostoSakura Finetek4583para embutir
o criostato InstrumentoLeicaCM1900para seccionar
solução tampãode fosfato de DulbeccoAurogeneAU-L0615-500
Lâminas de adesão PolisinaVWR631-0107óculos de microscópio
Óculos de coberturaBio-Optica72015
Óculos de cobertura Formaldeído 37%SIGMA252549
solvente Oil Red O solução (0,5 % em isopropanol)SIGMAO1391solução de coloração
Mayer' s HematoxilinaSIGMAMHS32solução de coloração
Carbonato de LítioSIGMA62470tampão de lavagem
Meio de montagem AquosoThermo ScientificTA-125-AMsolução de montagem
AcetonaSIGMA179124solvente
Solução de ácido fosfomolíbdicoSIGMAHT153para histologia
Direct Red 80 (Picrosirius Vermelho)Solução de coloração365548 SIGMA
Bio Clear (agente de limpeza de origem terpena)Produto Bio-Optica06-1782Dpara a preparação de amostras histológicas
Meio de montagem de endurecimento rápido Eukitt (Poli (metacrilato de butilo-co-metacrilato de metila)Solução de montagem SIGMA3989
Dodecil sulfato de sódioFluka71725pó
Solução de peróxido de hidrogênio (30%)Solução SIGMAH1009
Vectorstain ABC KIT, incluindo: anti-coelho IgG ABC, soro normal de coelho, Secundário-biotinilado Anti-Rato IgG,Vector LaboratoriesPK-6100solução de coloração
3-amino-9-etilcarbazolVector LaboratoriesSK-4200solução de coloração
Mac3 anticorpo BDBiosciences553322anticorpo
ImagePro Premier 9Media Cybernetics050910000-2534software para analisar imagens
Fio a Solução tampão de solução salina tamponada

Referências

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  1. Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. New England Journal of Medicine. 340 (2), 115-126 (1999).
  2. Lafont, A. Basic aspects of plaque vulnerability. Heart. 89 (10), 1262-1267 (2003).
  3. Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal models of atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (5), 1104-1115 (2012).
  4. Bentzon, J. ....

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