Entrega de gene lentiviral assistida por laser em óvulos fertilizados de camundongos

Resumo

Mouse de ovos fertilizados e embriões adiantados do palco são protegidos pela zona pelúcida, uma matriz de glicoproteína que forma uma barreira contra a entrega do gene. Este artigo descreve um protocolo para perfurar a zona com um laser para transduce células embrionárias com vetores Lentivirus e criar ratos transgénicos.

Resumo

Lentivírus são eficientes vetores para entrega de gene em células de mamíferos. Seguindo a transdução, o genoma de Lentivirus estàvel é incorporado ao cromossomo do hospedeiro e é passado para a descendência. Assim, eles são vetores ideais para a criação de linhas de célula estável, na vivo entrega dos indicadores e transdução de ovos única célula fertilizada para criar animais transgénicos. No entanto, rato fertilizado ovos e embriões adiantados do palco são protegidos pela zona pelúcida, uma matriz de glicoproteína que forma uma barreira contra a entrega do gene Lentivirus. Lentivírus são demasiado grandes para penetrar a zona e são tipicamente entregues pela microinjeção de partículas virais em cavidade perivitelline, o espaço entre a zona e as células embrionárias. O requisito para tecnólogos altamente qualificados e equipamentos especializados minimizou o uso do lentivírus para entrega de genes em embriões de rato. Este artigo descreve um protocolo para permeabilizing os ovos fertilizado de rato por perfurar a zona com um laser. Laser-perfuração não resulta em danos aos embriões e permite lentivírus ter acesso às células embrionárias para a entrega do gene. Transduzidas embriões podem desenvolver-se em blastocisto in vitro e se implantado em ratos pseudopregnant, evoluir para filhotes transgênicos. O laser utilizado neste protocolo é eficaz e fácil de usar. Genes, entregados por lentivírus estàvel incorporam em células embrionárias de rato e são transmissível germline. Este é um método alternativo para a criação de ratos transgênicos que requer sem micromanipulação e microinjeção de ovos fertilizados.

Introdução

Este método fornece instruções detalhadas para permeabilizing a zona pelúcida de ovos fertilizado de rato para tornar as células embrionárias acessível para a entrega do gene lentivírus. Lentivírus são projetados pela natureza para entrega eficiente de gene de células de mamíferos. Eles infectam células de divisão e não dividindo e integrarem o genoma de Lentivirus seu anfitrião cromossomos¹. O intervalo de células hospedeiras Lentivirus prontamente é expandido por pseudotyping o lentivirus recombinante com a glicoproteína de vírus estomatite vesicular (VSV-G), devido a ampla tropismo do VSV-G proteínas². Após transdução....

Protocolo

Todos os animais procedimentos e tratamentos utilizados neste protocolo estavam em conformidade com as orientações de cuidados com animais de NIH/NIEHS e foram aprovados pelo Animal Care e Comissão de utilização (ACUC) no NIH/NIEHS, Animal protocolo 2010-0004.

1. preparações

1. Prepare-se compra e recombinação não-propagação lentivírus carreg o gene de interesse. Neste estudo, lentivirus SBI511 expressando a proteína fluorescente verde copépode (copGFP; abreviado para GFP) de um alongamento promotor de 1a fator foi usado para a transdução. Protocolos padrão² foram usados para produzir e lentivírus título em tí....

Resultados

Desenvolvimento de ovos de rato isolado/transfectadas fertilizado pode ser verificado ao microscópio diariamente (Figura 1). Os embriões saudáveis desenvolvem-se em blastocisto dentro de 3-4 dias. Neste protocolo, 60-70% dos embriões não tratados desenvolvem-se em blastocisto²³. Fora 114 embriões transduzidos laser-perfurados, 54 desenvolveu-se em blastocisto (taxa de 47%) e 46 blastocistos expressaram GFP (46/54 = 85%)

Discussão

A capacidade dos lentivírus para integrar o seu genoma hospedeiro torna um vetor ideal para a entrega do gene estável. Vetores de Lentivirus podem transportar até 8,5 mil par (kbp) de material genético que pode acomodar células específicas ou inducible promotores, marcadores de seleção ou partes fluorescentes. Material genómico incorporado pode replicar como parte de seu genoma do hospedeiro e ser regulamentado para expressar ou desactivar em pontos de tempo desejado. Estes vetores permitem spatiotemporal controle sobre .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
de plasmídeo CD510B-1	Biosciences	CD510B-1	usado para embalar o lentivírus expressando EF1a-copGFP
Dimetilpolissiloxano	Sigma	DMPS5X	cultivando embriões
hialuronidase	Sigma	H3506	usado para remover células do cumulus
XYClone Laser Hamilton	Thorne Biosciences		perfurando ovos
fertilizados com camundongosDispositivo de transferência de embriões não cirúrgicos (NSET)	ParaTechs	60010	NSET de embriões
KSOM médio	Millipore	MR-020P-5F	embriões de cultura
Composição do KSOM:			mg/100mL
NaCl			555
KCl			18,5
KH2PO4			4,75
MgSO4 7H2O			4,95
CaCl2 2H2O			25
NaHCO3			210
Glicose			3,6
Na-Pyruvate			2.2
DL-Ácido Láctico, sal			0.174mL
10 mM EDTA			100µ L
Estreptomicina			5
Penicilina			6,3
0,5% vermelho			0,1mL
L-Glutamina			14,6
MEM Aminoácidos Essenciais			1mL
MEM AA			0,5mL
BSA			100
M2 médio	Millipore	MR-015-D	embriões de cultura
Composição de M2:			mg/100mL
Cloreto de cálcio			25,1
Sulfato de magnésio (anidro)			16,5
Cloreto			35,6
Fosfato de Potássio Monobásico			16,2
Bicarbonato			35
Cloreto de Sódio			553,2
Albumina Bovina Fração			400
D-Glicose			100
Na-HEPES			54,3
Fenol Vermelho			1,1
Ácido Pirúvico			3.6
		DL-Láctico	295

Sistema de sódio de fenol não essencial de potássio de Sódio Ácido