Summary
Hier presenteren we een protocol om automatisch te bepalen door de motorische prestaties van Drosophila op het veranderen van temperatuur met behulp van een programmeerbare temperatuurgevoelig arena die snelle en nauwkeurige temperatuurveranderingen in tijd en ruimte produceert.
Abstract
Temperatuur is een alomtegenwoordige milieu-factor die van invloed op hoe soorten verspreiden en gedragen. Verschillende soorten Drosophila fruitvliegjes hebben specifieke reacties op veranderende temperaturen volgens hun fysiologische tolerantie en aanpassingsvermogen. Drosophila vliegen bezitten ook een temperatuur sensing systeem die fundamenteel zijn voor het begrip van de neurale basis van temperatuur verwerking in koudbloedig zijn gekomen. Wij presenteren hier een temperatuurgevoelig arena waarmee snelle en precieze temperatuurveranderingen met temporele en ruimtelijke controle om te verkennen van de reactie van individuele vliegen aan de veranderende temperaturen. Individuele vliegen zijn geplaatst in de arena en blootgesteld aan vooraf geprogrammeerde temperatuur uitdagingen, zoals uniforme geleidelijke stijging van temperatuur om te bepalen van de reactie normen of ruimtelijk gedistribueerde temperaturen tegelijkertijd voorkeur bepalen. Individuen worden automatisch bijgehouden, waardoor de kwantificering van voorkeur snelheid of locatie. Deze methode kan worden gebruikt om snel het kwantificeren van het antwoord via een breed scala van temperaturen om te bepalen van temperatuur prestaties bochten in Drosophila of andere insecten van gelijkaardige grootte. Daarnaast kan het worden gebruikt voor genetische studies te kwantificeren temperatuur voorkeuren en reacties van mutanten of wild-type vliegen. Deze methode kan helpen ontdekken de basis van thermische speciatie en aanpassing, alsmede de neurale mechanismen achter temperatuur verwerking.
Introduction
Temperatuur is een constante milieu-factor die van invloed op hoe organismen functioneren en zich gedragen1. Verschillen in breedte en hoogte leiden tot verschillen in het type klimaten organisme zijn blootgesteld aan, wat resulteert in evolutionaire selectie voor hun reacties op temperatuur2,3. Organismen reageren op verschillende temperaturen via morfologische, fysiologische en gedragsmatige aanpassingen die maximaliseren van de prestaties onder hun specifieke omgevingen4. Bijvoorbeeld, in de fruitvlieg Drosophila melanogasterhebben bevolkingsgroepen uit verschillende regio's verschillende temperatuur voorkeuren, lichaam maten, developmental tijden, lange levensduur, vruchtbaarheid en wandel prestaties bij verschillende temperaturen2 ,5,6,7. De diversiteit tussen vliegen van verschillende oorsprong in acht genomen wordt ten dele verklaard door genetische variatie en kunststof gen expressie8,9. Evenzo Drosophila soorten uit verschillende gebieden anders over temperatuurgradiënten verdelen en tonen van verschillen in de weerstand aan extreme hitte en koude proeven10,11,12.
Drosophila geworden onlangs ook het model van de keuze om te begrijpen van de genetische en neurale basis van temperatuur waarneming13,14,15,16,17. In het algemeen, volwassen vliegen waarnemen temperatuur door middel van koude en warme perifere temperatuursensoren in de antennes en temperatuursensoren in de hersenen13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20. de periferie receptoren voor warme temperaturen express Gr28b.d16 of koorts21, terwijl de periferie koude receptoren worden gekenmerkt door Brivido14. In de hersenen, wordt temperatuur verwerkt door de neuronen uiten van TrpA115. Behavioral studies op mutanten van deze trajecten zijn het verbeteren van ons begrip van hoe de temperatuur wordt verwerkt en geven inzicht in de mechanismen die tussen populaties van Drosophila uit verschillende regio's variëren.
Hier beschrijven we een temperatuurgevoelig arena dat snel en nauwkeurig temperatuurveranderingen produceert. Onderzoekers kunnen vooraf program deze veranderingen, waardoor voor gestandaardiseerde en herhaalbare temperatuur manipulaties zonder menselijke tussenkomst. Vliegen worden geregistreerd en bijgehouden met gespecialiseerde software om te bepalen van hun positie en snelheid in verschillende fasen van een experiment. De belangrijkste meting gepresenteerd in dit protocol is de snelheid van het lopen bij verschillende temperaturen, want het is een ecologisch relevante index van fysiologische prestaties dat individuele thermische aanpassingsvermogen5kan identificeren. Samen met temperatuur receptor mutanten, kan deze techniek helpen onthullen de mechanismen van thermische aanpassing cellulaire en biochemisch niveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van vliegen voedsel Medium
- Giet 1 liter leidingwater in een bekerglas van 2 L glas en voeg een magnetische roer bar. Zet het bekerglas op een magnetische warmhoudplaat bij 300 ° C tot kooktemperatuur is bereikt.
- Roer op 500 rondes/min en voeg het volgende toe: 10 gram agar, 30 g van glucose, 15 g van sacharose, 15 g maïsmeel, 10 gram tarwekiemen, 10 gram soja bloem, 30 g van melasse en 35 g van actieve droge gist.
- Wanneer de mix krachtig schuimt, verlaag de temperatuur van de hete plaat tot 120 ° C terwijl het voortdurend roeren.
- Draai de verwarmingsplaat temperatuur verder tot 30 ° C na 10 min en blijven roeren tot het mengsel tot 48 ° C. koelt Meet de temperatuur door het invoegen van een thermometer rechtstreeks in het eten zonder aan te raken de wanden van het bekerglas.
- Los 2 g p-hydroxy-benzoëzuur acid methylester in 10 mL ethanol 96% en toe te voegen aan de mix, samen met 5 mL 1 M propionzuur. Blijven roeren gedurende 3 minuten.
- Het uitschakelen van de verwarmingsplaat en giet 45 mL van voedsel in de steigerend flessen en 6,5 mL van voedsel in de collectie flesjes.
2. voorbereiding van vliegen
- Plaats 20 mannelijke en 20 vrouw vliegt in de steigerend flessen met 45 mL van vliegen voedsel medium. De vliegen naar nieuwe flessen overbrengen na 3 tot 4 dagen door te onttrekken ze naar beneden en ze tappen in de verse flessen. Gooi de vliegen na drie wijzigingen.
- Plaats de flessen in de incubator onder 12-h licht/12-h donkere cycli met een constante temperatuur van 25 ° C.
Opmerking: Een nieuwe generatie van vliegen zal eclose na tien dagen.
- Plaats de flessen in de incubator onder 12-h licht/12-h donkere cycli met een constante temperatuur van 25 ° C.
- Anesthetize nieuwe eclosed vliegen op kooldioxide pads voor een maximum van 4 min en verzamelen ze in 2.5 x 9.5 cm vliegen steigerend flesjes met 6,5 mL van vliegen voedsel medium met behulp van een penseel.
- Alleen Maagd vliegen verzamelen en scheid de items door seks in groepen van 20 vliegen per flacon fokken.
- Plaats de flesjes binnen starterscentra voor 5-7 dagen, veranderen de vliegen naar nieuwe flesjes elke 2-3 dagen en op de dagen voor experimenten.
3. frame van lichten
- Het maken van een houten frame van 10 cm lengte, 4 cm breed en 4 cm hoogte 0,5 cm dik.
- Op elk van de korte zijden, maken een rand van 4 cm lengte, 4 cm hoogte en breedte van 1,5 cm naar binnen gebied van het houten frame. Laat het binnenvlak van de grens open.
- Twee boorgaten van 0,5 cm diameter op het snijpunt van een van de lange randen van het houten frame en op elk van de grenzen op de korte zijden.
- Plaats 10 cm van een warm witte LED strip binnen elk van de grenzen op de korte zijden. Schil de achterkant van de LED-strip aan onmiddellijk lijm deze op zijn plaats.
Opmerking: Voor experimenten in welke verlichting moet worden uitgeschakeld, de warm witte LED strip kan worden vervangen door infrarood LED strips. - Sluit één uiteinde van de LED-strip in een van de randen aan de schakelende voeding en het andere uiteinde op de LED-strip aan de tegenoverliggende rand.
- De schakelende voeding inschakelen om te verifiëren dat beide LED strips inschakelen.
- Betrekking hebben op de open zijde van elke rand met een wit stuk papier.
- Lijm een ander stuk papier aan elk van de interne fasen van de lange randen.
4. temperatuurgevoelig Arena
- Zet de temperatuurgevoelig arena (figuur 1A en 1 C). Zorg ervoor dat de ventilator begint te lopen en de aluminium ring warming begint-up.
- Gebruik een USB-kabel de arena temperatuurgevoelig verbinden met de computer van de controle met het script TemperaturePhases de temperatuur sequenties.
- Open het TemperaturePhases script in de besturingscomputer en controleer of de volgorde van de temperatuur (Video 1) correct is ingesteld.
- Controleer of de duur van elke experimentele fase is ingesteld op 60 s door te verifiëren dat "par. StimulusDur"is gelijk aan 60 s.
- Controleer of het nummer 1) gelijk is aan gewenst aantal fasen, 2) iteratieve ON/OFF set-up van de indicatieve red light emitting diodes (LED's), 3) 2 ° C temperatuurstijging per fase, en 4) 16 ° C als de begin temperatuur hebben allemaal gelijk onder de "Start de experimentele de sectie van de Block".
Opmerking: Laat de vliegen te acclimatiseren naar de Arena vliegen gedurende 7 minuten bij 16 ° C om te voorkomen dat een kunstmatige verhoging van de snelheid tijdens de eerste experimentele fasen (Figuur 2). - Het TemperaturePhases script uitvoeren. De software zal initialiseren voor 5 seconden, zoals bepaald in "arena. Wacht"en dan stop.
- Druk op de spatiebalk van het toetsenbord om te beginnen met het uitvoeren van de experimentele fasen zodra een vlieg is geblazen in de Arena van vliegen (stap 5.3).
Opmerking: De TemperaturePhases is het huidige script beheersen het vak; het is echter mogelijk om andere aangepaste scripts maken voor het gebruik van dit apparaat die aan te aan de eisen van verschillende experimenten passen.
- Sluit de camera op de top van de arena naar de opname computer met behulp van de USB-kabel van de camera.
- Open het programma van de video-opname (Zie Tabel van materialen) in de computer van de opname door het selecteren van "bestand | Nieuwe opname van de film". Een scherm waarop het beeld van de camera wordt geopend.
- Zorg ervoor dat de camera beeld alle randen van de arena en de indicatieve rode LEDs vangt.
- Beginnen met opnemen door op de rode knop in het midden van het scherm de onderkant toont het camera beeld zodra het frame van de lichten rond de arena (stap 5.4 ligt).
Opmerking: kleine veranderingen in de belichting kan beïnvloeden nauwkeurigheid van de tracering. Het is aanbevolen om de verlichting van de arena regelbare temperatuur constant houden door de vaststelling van de locatie van het apparaat.
5. temperatuur gedrags experimenten
- Bereiden de vliegen Arena (Figuur 1 c).
- Plaats een onderdeel van witte geleidende tape op de bovenkant van de koperen tegels, zorgen voor dat alle randen vallen.
- Plaats de verwarmde aluminium ring rond de koperen tegels. De rand van de ring past perfect rond de koperen tegels zodat het altijd op dezelfde locatie is geplaatst.
- Schoon het glas bedekken met een schone tissue en plaats deze op de bovenkant van de ring van aluminium, waardoor een gat waardoor een vlieg in kan worden geblazen.
Opmerking: Voordat de experimenten, jas de glasdeel met de siliconizing agent om een glad oppervlak te maken. Toepassing van de siliconizing agent voor 24u en spoelen met water vóór gebruik.
- Voer het TemperaturePhases script (stap 4.3.3) en open het programma van de video-opname (stap 4.5).
- De vlieg van een steigerend flesje (stap 2.2.2) blazen in de Arena vliegen (bv., 1 mannelijke vliegen in Figuur 3).
- Neem een flesje van vliegen uit de incubator, kraan het tweemaal om te dwingen hen om te gaan naar de bodem, val een vlieg met een mond aspirator, en sluit de flacon en zet het terug in de incubator.
- Plaats de vlieg in de arena via de kloof die tussen de glasdeel en aluminium ring (stap 5.1.3) heeft gelaten.
- Dicht de kloof tussen de glasdeel en aluminium ring door het indrukken van het glasdeel totdat zij de rand van de ring van aluminium tot, zodra de vlieg is ingevoerd om de Arena vliegen.
- Plaats het frame van licht rond de arena om symmetrische verlichting.
- Markeer de locatie (bv., met behulp van een permanent marker) van het frame van licht rond de Arena vliegen (Figuur 1 c) om ervoor te zorgen dat het frame altijd op dezelfde locatie wordt geplaatst.
- Start de opname met de video-opname-programma (stap 4.5.2) en druk op de spatiebalk op het toetsenbord van de computer van de controle om te beginnen met het uitvoeren van de experimentele fasen (stap 4.3.4).
- Immers experimentele fasen zijn gedaan, behalve de video in .mp4 of .avi formaat en de vliegen uit de Arena vliegen met de mond aspirator verwijderen.
Opmerking: Het einde van de experimentele fasen kan worden bepaald door zowel indicatieve rode LEDs wordt uitgeschakeld of door het TemperaturePhases script stoppen.- De video-opname door op de stopknop in het midden van de onderkant van het scherm in het programma voor het opnemen te stoppen. Druk op "bestand | Opslaan als"om de video te bewaren.
6. video bijhouden en Data-analyse
- Gebruik de FlySteps voor het bijhouden van software (Video 2) wilt bijhouden van de video's.
- Open de "configuration_file.ini" in de map "FlyTracker".
- Stel de locatie van de video's in "video_folder" en de namen van de video's in "video_files".
- Geef de grenzen van de Arena van vliegen in "arena_settings" op basis van (x, y) pixelcoördinaten van meerdere punten aan de rand van de arena.
- Geef de locatie van de indicatieve rode LEDs in "led_settings" op basis van (x, y) pixelcoördinaten van de locatie van het middelpunt van de LED's.
- Controleer de locatie van de grenzen van de Arena vliegen door te stellen "debug" op "true" in "arena_settings", op "Opslaan" te klikken, en het uitvoeren van het script in de terminal. Een schermopname maken van de video wordt weergegeven met een blauw vierkantje gevormd door de coördinaten in "arena_settings" ingevoerd.
Opmerking: Dit plein omringt het gebied worden bijgehouden. - "Debug" wijzigen in "arena_settings" naar "false", klik op "Opslaan" en het scherm in de terminal nogmaals uitvoeren.
Opmerking: Hiermee start u het proces voor het bijhouden.
Opmerking: Vliegen kunnen lopen uit het gebied bijhouden op de verwarmde aluminium ring. Dit gebeurt tijdens de eerste seconden van een experiment, waarna vliegen stoppen de verwarmde ring aan te raken en blijven binnen het gebied volgen.
Opmerking: Video's kunnen worden bijgehouden met andere opsporingssoftware volgens de experimentator van voorkeuren.
- Gebruik de (x, y) locatie van elke vliegen verstrekt door de tracking-software voor het berekenen van de maatregel van belang voor de prestaties van de temperatuur. Aangepaste scripts (bv., FlyStepsAnalysis in aanvullende) kan worden gebruikt.
- Vergelijk de temperatuur prestaties bochten van verschillende vliegen groepen met behulp van herhaalde metingen (RM) variantieanalyse (ANOVA) en post-hoc meerdere vergelijkingen met behulp van statistische software (Zie Tabel van materialen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De temperatuurregeling arena (figuur 1A) bestaat uit drie koperen tegels waarvan temperatuur kan afzonderlijk worden gecontroleerd door middel van een programmeerbare circuit. Elke koper tegel bezit een temperatuursensor die feedback aan de programmeerbare circuit geeft. Het circuit activeert een voeding te verhogen van de temperatuur van elke tegel. Passieve Thermo-elektrische elementen fungeren als constante warmte-elementen om de gewenste temperatuur, terwijl een heat sink gekoeld door een ventilator constante koeling biedt. De omvang van de temperatuurverandering bepaalt de snelheid van het proces in een niet-lineaire manier. Een stijging van 2 ° C vereist slechts 0,1 s, en een stijging van 18 ° C vereist 4 s. Een scherm dat is aangesloten op het programmeerbare circuit (Figuur 1 c) informeert de gebruiker van de temperatuur gemeten met de temperatuursensoren in elk van de tegels. De koperen tegels zijn omringd door een aluminium ring voortdurend verwarmd tot 50 ° C (figuur 1B en 1 C) door halfgeleiders langs de rand. Deze ring vormt de randen van de vliegen Arena (Figuur 1 c), het gebied waarin vliegen zijn worden geplaatst. De vliegen Arena wordt gedekt door een gesiliconiseerd glasdeel (figuur 1A en 1 C), waarin een 3 mm hoge ruimte die ervoor zorgt dat vliegen kunnen lopen maar niet vliegen. Naast de Arena vliegen zijn twee rode LEDs (Figuur 1 c) die kunnen worden geprogrammeerd om verschillende experimentele fasen markeren. Bijvoorbeeld, voor de resultaten die worden weergegeven in figuur 2A, elke LED is geassocieerd met een verschillende temperatuur, terwijl in figuur 2B, elke LED geeft aan 60 s. De FlySteps -software kan registreren wanneer elk van de indicatieve LEDs brandt, en de onderzoeker deze informatie kunnen gebruiken kan om automatisch te bepalen door de experimentele fasen op basis van temperatuur of tijd.
De arena temperatuurgevoelig kan worden gebruikt om te vergelijken van de gedragsmatige reactie van vliegen van verschillende genetische achtergronden op dynamische temperatuurveranderingen. Bijvoorbeeld kunnen vliegt vanaf verschillende soorten worden blootgesteld aan geleidelijk toenemende temperaturen (Figuur 3) verschillen in thermische prestaties moeten worden vergeleken. De snelheid van alle soorten neemt toe naarmate de temperatuur stijgt tot het bereiken van een punt van maximale prestaties, waarna het verval en omgekomen. Elke soort heeft echter een bijzondere responscurve met specifieke maximale respons snelheden en thermische toleranties. Eerdere rapporten is gebleken dat Drosophila van verschillende soorten verschilt de ontwikkelingstoxiciteit timing, lange levensduur, vruchtbaarheid, Lichaamsafmetingen, seksuele communicatie en temperatuur tolerantie3,6,7 ,8,22. Dus onze beschrijving van soortspecifieke voortbewegen in een temperatuurgradiënt wordt toegevoegd aan dit orgaan van het werk.
De arena temperatuurgevoelig kan ook worden gebruikt om te verkennen van de reactie op het conditioneren van experimenten op basis van temperatuur. De eenvoudigste vorm van deze aanpak is een paradigma van de Operante conditionering waarin vliegen zijn opgeleid om de voorkeur aan één kant van de arena boven de andere, door het opwarmen van de kant die zal worden vermeden23,24,25. We blootgesteld individuele vliegen tot 40 ° C in het midden en een van de zijelementen, terwijl het andere zijelement bij een comfortabele 22 ° C (Figuur 4). Wild-type vliegen snel gestopt vooruitbrengt op de arena en bleef in de comfortabele locatie. In tegenstelling, de klassieke geheugen mutant Dunce gehouden het verkennen van de arena en besteed minder tijd dan de besturingselementen in de comfortabele locatie. De verschillen tussen de prestaties van de wild-type vliegen en Dunce mutanten werd groter toen alle tegels waren ingesteld op 22 ° C en er vergelijkingen tussen de behandeling in groepen gemaakt werden. Domkop mutanten bleek ook grotere verschillen tussen opleiding en test fases in vergelijking met de wild-type vliegen (Figuur 4). Deze resultaten suggereren een effect van geheugen op de resterende in de comfortabele locatie.
Combinaties van temperatuur en locatie zijn ook nuttig om te begrijpen van de functie van verschillende temperatuur receptoren tijdens dynamische temperatuurveranderingen. Wij individuele D. melanogaster Gr28b.d en TrpA1GAL4 mutanten op de toenemende temperaturen blootgesteld (2 ° C verhogen elke 60 s) en biedt een comfortabele locatie bij 22 ° C (Figuur 5). De comfortabele locatie verschoven van links naar rechts, en vice versa, per iteratie. Resultaten tonen aan dat de periferie temperatuur receptor Gr28b.d mutanten als het besturingselement gedragen, als ze meer tijd in de comfortabele locatie naarmate de temperatuur toeneemt besteden. Echter hersenen temperatuur receptor TrpA1GAL4 mutanten worden niet beïnvloed door de toenemende temperaturen en hun locaties in de arena niet veranderen. Het effect vertonen vliegen die al in de comfortabele locatie zaten voordat het werd comfortabel en bleef er tijdens die fase de verhogingen en de daling van de curve van TrpA1GAL4 mutanten. De consistentie van pieken en dalen van de curve van TrpA1GAL4 duiden er op dat deze vliegen gebleven nog steeds voor het grootste deel van het experiment; Vandaar, werden zij voortdurend geteld wanneer hun locatie de was beschouwd als comfortabel. Deze conclusie werd bevestigd door visuele inspectie van de opgenomen video's. Deze resultaten ondersteuning vorige fysiologische rapporten suggereren dat periferie perceptie van snelle en grote wijzigingen is niet afhankelijk van de Gr28b.d17 en dat vliegen een belangrijkste centrale mechanisme voor de gevoel temperatuur op basis van TrpA1 bezitten 14,,21.
Figuur 1: Diagram voor temperatuur gecontroleerde-arena. (A) een laterale weergave van de arena temperatuurgevoelig. Een programmeerbare circuit verbindt een levering en temperatuur sensoren met verwarmingselementen onder koperen tegels om hun temperatuur controle. Tegels zijn voortdurend afgekoeld door een heat sink verbonden met een ventilator. Een verwarmde aluminium ring waarover een glasdeel ligt omringt de tegels. (B) thermische imaging weergegeven: de tegels vastgesteldop 24 ° C (boven) en zijelementen bij 24 ° C met een middelste tegel bij 30 ° C (onder). (C) een bovenaanzicht van de arena. Een camera registreert de koperen tegels, aluminium ring en rode LEDs, dan bepaalt automatisch de experimentele fasen. Een scherm in de hoek van het vak niet opgenomen door de camera toont de actuele temperatuur van de tegel. D ring van licht: twee warm witte LED strips in een houten doos bedekt met Witboek zorgen constante en symmetrische verlichting van de hele arena. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: vliegen naar de arena moeten acclimatiseren voordat het protocol temperatuur. (A) één mannelijke vliegen werden ingevoerd om de arena en toegestaan om te verkennen op een constante 16 ° C gedurende 1 min, waarna de temperatuur begon te verhogen. (B) single vliegen blootgesteld aan 16 ° C, 20 ° C en 24 ° C (geen groep verschillen; two-way ANOVA F (2,570) = 4.156, p = 0.162) hebben een hogere motoriek aan het begin van het experiment dan na 5 min (twee richtingen RM ANOVA-F (9,570) = 7.803, p < 0.0001). Gegevens zijn gemiddelde en standaardafwijking van het gemiddelde (± SEM) van 20 Maagd vrouwelijke vliegen 5 tot 7 dagen oud gedurende meerdere dagen getest. Sterretje geeft significant verschil tussen groepen (*** p < 0,0001; Tukey is meerdere vergelijkingstest, p = 0,05). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Motoriek soorten 5 Drosophila blootgesteld aan geleidelijk toenemende temperaturen. Individuele mannetje vliegt van gematigde (blauw), tropische (rood) en kosmopolitische (bruin) Drosophila soorten werden blootgesteld aan een toenemende temperatuur verloop (2 ° C elke 60 s) tussen 16 en 46 ° C. De eerste 7 min werden voortdurend bij 22 ° C te laten vliegen om te verkennen van de arena. Soorten aanzienlijk verschilden (two-way ANOVA-F(4,70) van het RM = 28.46, p < 0,001). (a) D. melanogaster (bruin; gevuld cirkels) was sneller wanneer ingevoerd om de arena. (b) D. yakuba (rood; lege vierkantjes) was sneller als de temperatuur verhoogd. (c) D. suzukii (bruin gevulde vierkant) was langzamer dan de andere kosmopolitische vliegen op zijn punt van maximale prestaties. (d) D. simulans (bruin; lege cirkels) was in verval op het maximale punt van D. melanogaster. Elk punt vertegenwoordigt het gemiddelde (± SEM) van 15 mannelijke vliegen 5 tot 7 dagen oud gedurende enkele dagen getest. Betekenis aangegeven met symbolen (♦ = verschil uit alle, p < 0,0001; † = verschil uit alle behalve D. melanogaster, p < 0,0001; • = verschil van D. melanogaster, p < 0,01; ¢ verschil van D. melanogaster, p = < 0.001; = verschil tussen benoemde groepen, p < 0,0001; Tukey is meerdere vergelijkingstest, p = 0,05). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: de arena temperatuurgevoelig kan worden gebruikt voor Operante conditionering. D. melanogaster Canton-S stam (wild-type; zwarte rand) en dnc1 (domkop; rode rand) mutanten werden opgeleid om liever een laterale tegel bij 22 ° C na de opwarming van het midden en tegenover laterale tegels tot 40 ° C gedurende 4 minuten (opleiding, niet patroon). Geheugen van de verwarmde gebieden wordt vervolgens getest door het instellen van alle tegels op 22 ° C (test; rasterpatroon). Vliegen zijn geconditioneerd om liever tegels aan de linkerkant in de helft van de experimenten en tegels aan de rechterkant in de andere helft. Het percentage van de totale tijd binnen de tegel bij 22 ° C tijdens opleiding en testen werd gemeten om te vergelijken van de prestaties. Groepen verschilden significant (one-way ANOVA-F(3,76) = 23.23 p < 0.0001), met Dunce uitvoeren over het algemeen slechter dan wild-type. Gegevens zijn gemiddelde (± SEM) van 20 Maagd vrouwelijke vliegen 5 tot 7 dagen oud gedurende enkele dagen getest. Sterretjes geven betekenis verschil tussen groepen (*** p > 0,0001; *** p > 0.001; ** p > 0,01; Tukey is meerdere vergelijkingstest, p = 0.05) Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: reactie van temperatuur mutanten op verhoging van de temperatuur als een comfortabele locatie beschikbaar is. Temperatuur mutanten Gr28b.d (groene; vierkanten) reageren als besturingselementen (w1118, zwart; cirkels) door verhoging van het percentage van de tijd in de comfortabele omgeving naarmate de temperatuur toeneemt (twee richtingen RM ANOVA-F (1,38) = 0.5107, p = 0.479). TrpA1GAL4 mutanten (geel; driehoeken) verschillen van besturingselementen (w1118, zwart), zoals ze doen niet meer tijd in de comfortabele omgeving naarmate de temperatuur toeneemt (twee richtingen RM ANOVA-F (1,38) = 1.670, p = 0.019). Gegevens zijn gemiddelde (± SEM) van 20 mannelijke vliegen 5 tot 7 dagen oud gedurende enkele dagen getest. TrpA1GAL4 verschilt aanzienlijk van de Gr28b.d en de controle (p < 0,05; Tukey is meerdere vergelijkingstest, p = 0,05). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier hebben we een automatische temperatuurregeling arena (Figuur 1) die nauwkeurige temperatuurveranderingen in tijd en ruimte produceert gepresenteerd. Met deze methode kunt blootstelling van individuele Drosophila niet alleen voorgeprogrammeerde geleidelijke stijging van de temperatuur (Figuur 2 en Figuur 3), maar ook dynamische temperatuur uitdagingen waarin elke tegel van de vlieg arena werd verwarmd onafhankelijk van elkaar tot een verschillende temperatuur (Figuur 4 en Figuur 5).
De arena temperatuurgevoelig maakt gebruik van een innovatieve benadering van het verhittingsproces. In plaats van produceren temperatuurveranderingen in de tegels door Thermo-elektrische Peltier warmte-elementen die worden gebruikt in de traditionele methoden, de arena temperatuurgevoelig gebruikt huidige opwarmen van een koperen massa met de koperen tegels en vliegen worden geplaatst aan de bovenkant. De koperen massa is voortdurend afgekoeld door een koellichaam blok verbonden met een ventilator. Peltier-achtige elementen worden gebruikt om de gewenste temperatuur van de koperen massa zodra het heeft opgewarmd. Omdat deze elementen niet de belangrijkste temperatuur generatoren zijn, lijden ze minder stress, die zich uitstrekt van hun levensduur en vergunningen sneller temperatuurveranderingen. Een programmeerbare circuit die feedback ontvangt van temperatuursensoren onder elk van de koperen tegel, die ook de voeding laagspanning activeren kunt, coördineert de verwarming-mechanisme. Onderzoekers kunnen opgeven wanneer en waar de temperatuurveranderingen optreden en de intensiteit en de richting van dergelijke veranderingen bepalen. Bovendien, de koppeling van de methode aan gespecialiseerde tracking software, zoals FlySteps, vergunningen analyse van alle aspecten met betrekking tot de Drosophila verkeer, zoals de algemene snelheid bij bepaalde temperaturen of de tijd doorgebracht in bepaalde locaties ( Figuur 2 Figuur 3, Figuur 4en Figuur 5). Niettemin, alle resultaten moeten rekening houden met kenmerken die inherent zijn aan het vliegen van gedrag dat mogelijk van invloed zijn op hun motoriek. Bijvoorbeeld, als vliegen zijn niet toegestaan om te verkennen van de arena en regelen voordat u de temperatuur wijzigt, snelheidsmetingen worden kunstmatig hoog (Figuur 2). Vliegen kunnen ook laten odorant die invloed hebben op de latere vliegen; Vandaar, de glasdeel moet worden gereinigd, en tape die betrekking hebben op de tegels moet worden gewijzigd tussen onderwerpen. Gezien het feit dat motoriek daalt als leeftijd26vliegt, is het belangrijk dat de vliegen wordt gestandaardiseerd voor leeftijd om te voorkomen dat de variatie in resultaten. In onze arena, hebben vliegen ook aangetoond centrophobism, liever randen over het midden gebied. Onderzoekers moeten hiervoor controle door het veranderen van de locatie van comfortabele gebieden om te voorkomen dat overschatten site voorkeur.
De huidige kenmerken van de arena en de eisen van het controleproces kunnen sommige experimentele procedures beperken. Bijvoorbeeld, bevat de nauwe omgeving van de arena geen toegangspunten via welke geuren kunnen worden ingevoerd, waardoor studies waarin deze stimulans belangrijk is. Ook vereist de FlyStepts tracker video's met uniforme achtergronden, waardoor de mogelijkheid van voedsel of andere items toe te voegen aan de vlieg van milieu beperkt. De arena kan worden aangepast aan het opnemen van een verbinding met een gas klep en software ontwikkelingen bestaan die mogelijk voor meer objecten aanwezig te zijn. Toekomstige projecten kunnen profiteren van deze mogelijkheden aan te passen de temperatuurgevoelig arena aan specifieke experimentele behoeften.
Tot slot hebben wij aangetoond in de resultaten die verschillende soorten Drosophila anders uitvoeren als de temperatuur stijgt (Figuur 3) en die temperatuur mutanten niet reageren op dezelfde manier als besturingselementen (Figuur 5). Dit toont aan dat deze nieuwe methode kan worden gebruikt om te verkennen de Drosophila thermisch gedrag en hoe het wordt beïnvloed door natuurlijke selectie en functionele eigenschappen. Tot slot, het laat zien dat onze methode verder begrip van thermische aanpassing helpen kan en soortvorming, alsook de interacties van temperatuur receptoren met andere stimuli in de toekomst studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd deels gesteund door een beurs van de gedrags- en cognitieve neurowetenschappen programma van de Rijksuniversiteit Groningen en een afgestudeerde beurs van de Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) uit Mexico, toegekend aan Andrea Soto-Padilla, en een subsidie van de John Templeton Foundation voor de studie van tijd toegekend aan Hedderik van Rijn en Jean-Christophe Billeter. Wij zijn ook dankbaar Peter Gerrit Bosma voor zijn deelname aan de ontwikkeling van de FlySteps tracker.
Scripts TemperaturePhases, FlySteps, en FlyStepAnalysis kan worden gevonden als aanvullende informatie en in de volgende link op het gebied van tijdelijke en publiekelijk beschikbaar:
https://dataverse.nl/privateurl.XHTML?token=c70159ad-4d92-443d-8946-974140d2cb78
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arduino Due | Arduino | A000062 | Software RUG |
| Electronics Board | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-Main-02-2014 | |
| Power supply Boost | XP-Power 48. V 65 W | ECS65US48 | Set to 53 Volt |
| Power supply Tile Heating | XP-Power 15. V 80 W | VFT80US15 | |
| Power supply Cooling | XP-Power 15. V 130 W | ECS130U515 | |
| Peltier elements | Marlow Industries | RC12-4 | 2 Elements, controlled DC feed |
| Heat sink | Fisher Technik | LA 9/150-230V | Decoupled for vibration |
| Temperature sensors | Measurement Specialties | MCD_10K3MCD1 | Micro Thermistor Probe |
| Copper block/tiles | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-CB-01-2014 | |
| Auminum ring | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-RoF-02-2015 | |
| Tesa 4104 white tape 25 x 66 mm | RS Components | 111-2300 | White conductive tape |
| Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
| Warm white LED strip | Ledstripkoning | HQ-3528-SMD | 60 LEDs per meter |
| Switch Power Supply | Generic | T-36-12 | |
| Logitech c920 | Logitech Europe S.A | PN960-001055 | |
| QuickTime Player | Apple Computer | Recording program | |
| Tracking analysis software | R | Packages: pacman | |
| Tracking analysis software | MATLAB | ||
| Thermal Imaging | FLIR T400sc | ||
| Graphs and Statisticts Software | Graph Pad Prism | ||
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | Siliconising agent |
| Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
| Flypad | Flystuff | 59-114 | |
| Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25x95 mm |
| Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
| Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
| Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
| Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
| Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
| Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
| Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
| Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
| Molasses | Flystuff | 62-117 | |
| Active dry yeast | Red Star | ||
| Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
References
- Abram, P. K., Boivin, G., Moiroux, J., Brodeur, J. Behavioural effects of temperature on ectothermic animals unifying thermal physiology and behavioural plasticity. bioRxiv. , (2016).
- Rajpurohit, S., Schmidt, P. S. Measuring thermal behavior in smaller insects: A case study in Drosophila melanogaster demonstrates effects of sex, geographic origin, and rearing temperature on adult behavior. Fly. 10 (4), 149-161 (2016).
- Jezovit, J. A., Levine, J. D., Schneider, J. Phylogeny environment and sexual communication across the Drosophila genus. The Journal of Experimental Biology. 220 (1), 42-52 (2017).
- Sinclair, B. J., Williams, C. M., Terblanche, J. S. Variation in Thermal Performance among Insect Populations. Physiological and Biochemical Zoology. 85 (6), 594-606 (2012).
- Gibert, P., Huey, R., Gilchrist, G. Locomotor performance of Drosophila melanogaster: Interactions among developmental and adult temperautures, age, and geography. Evolution. 55 (1), 205-209 (2001).
- Trotta, V., et al. Thermal plasticity in Drosophila melanogaster: A comparison of geographic populations. BMC Evolutionary Biology. 6, 1-13 (2006).
- Klepsatel, P., Gálikova, M., De Maio, N., Huber, C. D., Christian, S., Flatt, T. Variation in thermal performance and reaction norms among populations of Drosophila melanogaster. Evolution. 67 (12), 3573-3587 (2013).
- Latimer, C. A. L., Wilson, R. S., Chenoweth, S. F. Quantitative genetic variation for thermal performance curves within and among natural populations of Drosophila serrata. Journal of Evolutionary Biology. 24, 965-975 (2011).
- Chen, J., Nolte, V., Schlotterer, C. Temperature-related reaction norms of gene expression: Regulatory architecture and functional implications. Molecular Biology and Evolution. , (2015).
- Kellermann, V., Overgaard, J., Hoffmann, A. A., Flojgaard, C., Svenning, J. -C., Loeschcke, V. Upper thermal limits of Drosophila are linked to species distributions and strongly constrained phylogenetically. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16228-16233 (2012).
- Andersen, J. L., Manenti, T., Sørensen, J. G., Macmillan, H. A., Loeschcke, V., Overgaard, J. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
- Krstevska, B., Hoffmann, A. A. The effects of acclimation and rearing conditions on the response of tropical and temperate populations of Drosophila melanogaster and D. simulans to a temperature gradient (Diptera: Drosophilidae). Journal of Insect Behavior. 7 (3), 279-288 (1994).
- Frank, D. D., Jouandet, G. C., Kearney, P. J., Macpherson, L. J., Gallio, M. Temperature representation in the Drosophila brain. Nature. 519 (7543), 358-361 (2015).
- Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. The coding of temperature in the Drosophila brain. Cell. 144 (4), 614-624 (2011).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
- Ni, L., et al. A gustatory receptor paralogue controls rapid warmth avoidance in Drosophila. Nature. 500 (7464), 580-584 (2013).
- Liu, W. W., Mazor, O., Wilson, R. I.
- Neely, G. G., et al. TrpA1 Regulates Thermal Nociception in Drosophila. Public Library of Science ONE. 6 (8), e24343 (2011).
- Zhong, L., et al. Thermosensory and non-thermosensory isoforms of Drosophila melanogaster TRPA1 reveal heat sensor domains of a thermoTRP channel. Cell Reports. 1 (1), 43-55 (2012).
- Barbagallo, B., Garrity, P. A. Temperature sensation in Drosophila. Current Opinion in Neurobiology. 34, 8-13 (2015).
- Tang, X., Platt, M. D., Lagnese, C. M., Leslie, J. R., Hamada, F. N. Temperature integration at the AC thermosensory neurons in Drosophila. Journal of Neuroscience. 33 (3), 894-901 (2013).
- Petavy, G., David, J. R., Gibert, P., Moreteau, B. Viability and rate of development at different temperatures in Drosophila: A comparison of constant and alternating thermal regimes. Journal of Thermal Biology. 26 (1), 29-39 (2001).
- Diegelmann, S., Zars, M., Zars, T. Genetic dissociation of acquisition and memory strength in the heat-box spatial learning paradigm in Drosophila. Learning & Memory. 13 (1), 72-83 (2006).
- Zars, M., Zars, T. High and low temperatures have unequal reinforcing properties in Drosophila spatial learning. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 192 (7), 727-735 (2006).
- Zars, T., Wolf, R., Davis, R., Heisenberg, M. Tissue-specific expression of a type I adenylyl cyclase rescues the rutabaga mutant memory defect: in search of the engram. Learning & Memory. 7 (1), Cold Spring Harbor, NY. 18-31 (2000).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Brain Research. 46 (5), 320-325 (2011).
