Summary
Aquí presentamos un protocolo para determinar automáticamente el funcionamiento locomotor de Drosophila en cambios de temperatura con un campo de control de temperatura programable que produce cambios de temperatura rápida y precisa en tiempo y espacio.
Abstract
Temperatura es un factor ambiental omnipresente que afecta cómo especies se distribuyen y se comportan. Diferentes especies de moscas de la fruta Drosophila tienen respuestas concretas a los cambios de temperaturas en función de su tolerancia fisiológica y capacidad de adaptación. Moscas Drosophila también poseen una sistema que se ha convertido en fundamental para comprender la base neural de la temperatura de procesamiento en ectotermos de detección de temperatura. Presentamos aquí un campo de temperatura controlada que permite cambios de temperatura rápida y precisa con control temporal y espacial para explorar la respuesta de moscas individuales a cambios de temperatura. Individuales moscas se colocan en la arena y expuestas a temperatura pre programada de desafíos, tales como uniforme aumentos graduales de temperatura para determinar las normas de reacción o temperatura espacialmente distribuido al mismo tiempo para determinar preferencias. Individuos son rastreados automáticamente, permitiendo la cuantificación de la velocidad o ubicación de preferencia. Este método puede utilizarse para cuantificar rápidamente la respuesta sobre una amplia gama de temperaturas para determinar las curvas de rendimiento de la temperatura en Drosophila u otros insectos de tamaño similar. Además, puede utilizarse para estudios genéticos para cuantificar preferencias de temperatura y reacciones de mutantes o moscas de tipo salvaje. Este método puede ayudar a descubrir la base de la térmica especiación y adaptación, así como los mecanismos de los nervios detrás de proceso de temperatura.
Introduction
Temperatura es un factor ambiental constante que afecta a cómo funcionan y comportan1organismos. Las diferencias en latitud y altitud conducen a diferencias en el tipo de organismo están expuestos, que resulta en la selección evolutiva de sus respuestas a2,de temperatura3climas. Los organismos responden a diferentes temperaturas, a través de adaptaciones morfológicas, fisiológicas y conductuales que maximizan el rendimiento de sus entornos particulares4. Por ejemplo, en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, poblaciones de diferentes regiones tienen preferencias de temperatura diferentes, tamaños de cuerpo, tiempos de desarrollo, longevidad, fecundidad y rendimiento a pie a diferentes temperaturas2 ,5,6,7. La diversidad observada entre moscas de diferentes orígenes se explica en parte por la variación genética y expresión de gene de plástico8,9. Asimismo, especies de Drosophila de diferentes áreas distribuyen diferentemente entre gradientes de la temperatura y muestran diferencias en la resistencia al calor extremo y frío pruebas10,11,12.
Drosophila se ha convertido recientemente en el modelo de elección para entender las bases genéticas y de los nerviosas de temperatura percepción13,14,15,16,17. En términos generales, moscas adultas perciben temperatura mediante sensores de temperatura periférica frío y caliente en las antenas y sensores de temperatura en el cerebro13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20. los receptores de la periferia para temperaturas expresan Gr28b.d16 o pirexia21, mientras que la periferia receptores fríos se caracterizan por Brivido14. En el cerebro, temperatura es procesada por neuronas expresan TrpA115. Estudios de comportamiento en mutantes de estas vías están mejorando nuestra comprensión de cómo se procesa la temperatura y dan penetraciones en los mecanismos que varían entre las poblaciones de Drosophila de diferentes regiones.
Aquí describimos una arena con control de temperatura que produce cambios de temperatura rápida y precisa. Los investigadores pueden programar previamente estos cambios, que permite manipulaciones estandarizada y repetible de la temperatura sin intervención humana. Moscas se registran y se realiza un seguimiento con software especializado para determinar su posición y la velocidad en diferentes fases de un experimento. La principal medición presentada en este protocolo es la poca velocidad a diferentes temperaturas, ya que es un índice ecológico relevante de rendimiento fisiológico que puede identificar adaptabilidad térmica individual5. Junto con mutantes del receptor de temperatura, esta técnica puede ayudar a revelar los mecanismos de adaptación térmica a nivel celular y bioquímico.
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Protocol
1. preparación de alimentos mosca medio
- Verter 1 L de agua del grifo en un vaso de precipitados de vidrio de 2 L y añada una barra de agitación magnética. Poner el vaso en una placa magnética a 300 ° C hasta que se alcanza la temperatura de ebullición.
- Revuelva a 500 rondas por minuto y agregue lo siguiente: 10 g de agar, 30 g de glucosa, 15 g de sacarosa, 15 g de harina de maíz, 10 g de germen de trigo, 10 g de harina de soja, 30 g de melaza y 35 g de active levadura seca.
- Cuando la mezcla hace espuma vigorosamente, baje la temperatura de la placa caliente a 120 ° C manteniendo agitación.
- Girar a la temperatura de la placa más hasta 30 ° C después de 10 min y continuar revolviendo hasta que la mezcla se haya enfriado a 48 ° C. Medir la temperatura introduciendo un termómetro directamente en la comida sin tocar las paredes del vaso.
- Disolver 2 g de ésteres metílicos de ácidos p-hidroxi-benzoico en 10 mL de etanol al 96% y añadir a la mezcla, junto con 5 mL de ácido propiónico de 1 M. Seguir revolviendo durante 3 minutos.
- Apague la placa caliente y vierta 45 mL de alimento en la cría botellas y 6,5 mL de alimentos en los frascos de colección.
2. preparación de las moscas
- Lugar 20 varones y 20 mujeres vuela en las botellas de crianza que contiene 45 mL de medio de alimentos mosca. Transferir las moscas a las botellas de nuevo después de 3 a 4 días golpeando hacia abajo y luego aprovechando las botellas frescas. Deseche las moscas después de tres cambios.
- Colocar las botellas dentro de la incubadora bajo ciclos oscuros de 12 h luz/12 h con una temperatura constante de 25 ° C.
Nota: Una nueva generación de moscas le eclose después de diez días.
- Colocar las botellas dentro de la incubadora bajo ciclos oscuros de 12 h luz/12 h con una temperatura constante de 25 ° C.
- Anestesiar nuevamente moscas eclosed de almohadillas de dióxido de carbono para un máximo de 4 minutos y recoger en mosca viales cría 2.5 x 9.5 cm con 6,5 mL de medio de alimentos mosca con un pincel.
- Recoger sólo Virgen moscas y separarlos por sexo en grupos de 20 moscas por frasco de cría.
- Colocar los frascos dentro de incubadoras durante 5-7 días, cambiando las moscas a viales nuevos cada 2-3 días y en los días antes de los experimentos.
3. marco de luces
- Hacer un marco de madera de 10 cm de longitud, 4 cm de ancho, altura 4 cm y 0,5 cm de espesor.
- En cada uno de los bordes cortos, crear un borde de 4 cm de longitud, 4 cm de altura y 1,5 cm de ancho hacia el interior área de la estructura de madera. Deja la cara interna de la frontera abierta.
- Taladre dos orificios de 0,5 cm de diámetro en la intersección de uno de los bordes laterales de la estructura de madera y en cada una de las fronteras en los bordes cortos.
- Lugar de 10 cm de una tira de LED blanco cálida dentro de cada una de las fronteras en los bordes cortos. Pele la parte posterior de la tira de LED para encolarla inmediatamente.
Nota: Para los experimentos en que la iluminación se debe eliminar, puede sustituirse la tira de LED blanco cálida LED infrarrojo tiras. - Conecte un extremo de la tira de LED en una de las fronteras a la fuente de alimentación conmutada y su otro extremo a la tira de LED en el borde opuesto.
- Encienda la fuente de alimentación conmutada para verificar que ambas tiras de LED se encienda.
- Cubra el lado abierto de cada borde con un trozo blanco de papel.
- Pegar otro trozo de papel a cada una de las fases internas de los bordes laterales.
4. control de temperatura de la Arena
- Encienda la arena con control de temperatura (figura 1A y 1C). Asegúrese de que el ventilador comienza a funcionar y el anillo de aluminio comienza a calentar.
- Utilice un cable USB para conectar la arena con control de temperatura para la computadora de control, ejecutar el script TemperaturePhases con las secuencias de la temperatura.
- Abrir el script TemperaturePhases en la computadora de control y verificar que la secuencia de temperatura está configurada correctamente (Video 1).
- Comprobar que la duración de cada fase experimental se establece en 60 s verificando que "par. StimulusDur"es igual a 60 s.
- Compruebe que el número 1) igual al número de fases, 2) iterativas ON/OFF ajuste de la luz roja indica diodos (LEDs), aumento de la temperatura del ° C 3) 2 por fase, deseado y 4) 16 ° C como temperatura inicial todo correcto debajo de "Inicio de la experimental sección del bloque".
Nota: Deje que las moscas se adapte a la Arena vuela por 7 min a 16 ° C para evitar un aumento artificial de la velocidad durante las primeras fases experimentales (figura 2). - Ejecute el script TemperaturePhases . El software se inicializa durante 5 segundos como en "arena. Wait"y luego stop.
- Presione la barra espaciadora del teclado para empezar a correr las fases experimentales una vez que una mosca se ha fundido en la Arena de la mosca (paso 5.3).
Nota: El TemperaturePhases es el script actual control de la caja; sin embargo, es posible crear otros scripts personalizados para utilizar este dispositivo que se ajustan a los requisitos de diferentes experimentos.
- Conecte la cámara encima de la arena para el equipo de grabación usando el cable USB de la cámara.
- Abrir el programa de grabación de vídeo (véase Tabla de materiales) en el equipo de grabación seleccionando "archivo | Nueva grabación de película". Se abrirá una pantalla que muestra la imagen de la cámara.
- Asegúrese de que la imagen de la cámara capta todos los bordes de la arena y el LED rojo indicativo.
- Iniciar la grabación pulsando el botón rojo en medio del borde inferior de la pantalla que muestra la imagen una vez que el cuadro de luces se encuentra alrededor de la arena (paso 5.4).
Nota: pequeños cambios en la iluminación puede afectar la precisión de seguimiento. Se recomienda para mantener la iluminación del recinto de control de temperatura constante mediante la fijación de la ubicación del aparato.
5. temperatura experimentos conductuales
- Preparar la Arena mosca (figura 1).
- Colocar un filamento de cinta conductora blanca en la parte superior de las baldosas de cobre, asegurando que cubrir todos los bordes.
- Coloque el anillo de aluminio calentado alrededor de las baldosas de cobre. El borde del anillo encaja perfectamente en las baldosas de cobre por lo que siempre se coloca en el mismo lugar.
- Limpie la cubierta de vidrio con un paño limpio y colóquelo en la parte superior del anillo de aluminio, dejando un espacio a través del cual puede soplarse en una mosca.
Nota: Antes de los experimentos, capa de la cubierta de vidrio con el agente siliconado para crear una superficie resbalosa. Aplique al agente siliconado para 24 horas y enjuagar con agua antes de usarla.
- Ejecute el script TemperaturePhases (paso 4.3.3) y abrir el programa de grabación de vídeo (paso 4.5).
- Volar la mosca de un frasco de cultivo (paso 2.2.2) en la mosca de Arena (por ej., 1 hombre volar en la figura 3).
- Tomar un frasco de las moscas de la incubadora, púlselo dos veces para obligarlos a ir a la parte inferior, atrapar una mosca con un aspirador de boca y cerrar el frasco y lo pones de nuevo en la incubadora.
- Colocar la mosca en la arena el espacio que ha quedado entre la tapa de cristal y anillo de aluminio (paso 5.1.3).
- Cerrar la brecha entre la cubierta de cristal y anillo de aluminio empujando la tapa de vidrio hasta que alcance el borde del anillo de aluminio como la mosca se introduce a la mosca de Arena.
- Coloque el marco de luces alrededor de la arena para iluminación simétrica.
- Marque la ubicación (por ej., usando un marcador permanente) del cuadro de luces alrededor de la Arena de volar (figura 1) para asegurar que el marco se coloca siempre en el mismo lugar.
- Iniciar la grabación con el programa de grabación de vídeo (paso 4.5.2) y presione la barra espaciadora en el teclado de la computadora de control para comenzar a correr las fases experimentales (paso 4.3.4).
- Fases experimentales después de todo se hacen, guardar el video en formato. MP4 o .avi y eliminar la mosca de la Arena vuela con el aspirador de boca.
Nota: Al final de las fases experimentales se puede determinar por ambos LED rojo indicativo sea apagado o por la detención de secuencia de comandos TemperaturePhases .- Detener el grabación presionando el botón de parada en medio del borde inferior de la pantalla en el programa de grabación de vídeo. Presione "archivo | Guardar como"para guardar el video.
6. vídeo de seguimiento y análisis de datos
- Utilizar FlySteps (Video 2) el software de seguimiento para los videos.
- Abrir el "configuration_file.ini" dentro de la carpeta "FlyTracker".
- Establecer la ubicación de los vídeos de "video_folder" y los nombres de los vídeos de "video_files".
- Especificar las fronteras de la Arena vuela en "arena_settings" basado en (x, y) coordenadas de píxeles de varios puntos en el borde de la arena.
- Especificar la ubicación de los LED rojo indicativos en "led_settings" basado en (x, y) coordenadas de píxel de la ubicación del centro de los LEDs.
- Compruebe la ubicación de las fronteras de la mosca de Arena mediante el establecimiento de "debug" a "true" en "arena_settings", clic en "Guardar" y ejecutar el script en la terminal. Una captura de pantalla del video aparece con un cuadrado azul formado por las coordenadas introducidas en "arena_settings".
Nota: Esta plaza rodea la zona para realizar un seguimiento. - Cambiar "debug" en "arena_settings" a "false", haga clic en "Guardar" y ejecutar la pantalla en el terminal una vez más.
Nota: Con esto iniciará el proceso de seguimiento.
Nota: Moscas pueden caminar fuera del área de seguimiento a la anilla de aluminio caliente. Esto ocurre durante los primeros segundos de un experimento, después de lo cual moscas dejará de tocar el anillo caliente y permanecen dentro del área de seguimiento.
Nota: Los Videos pueden ser rastreados con otro software de seguimiento de acuerdo a las preferencias del experimentador.
- Uso (x, y) la ubicación de cada mosca que proporciona el software de seguimiento para calcular la medida de interés para el funcionamiento de la temperatura. Scripts personalizados (e.g., FlyStepsAnalysis en complementario) puede ser utilizado.
- Comparar las curvas de rendimiento de la temperatura de los diferentes grupos de moscas utilizando análisis de varianza (ANOVA) de medidas repetidas (MR) y post-hoc de comparaciones múltiples utilizando el software estadístico (véase Tabla de materiales).
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Representative Results
El ámbito de control de temperatura (figura 1A) se compone de tres naipes de cobre cuya temperatura puede ser controlada individualmente a través de un circuito programable. Cada azulejo de cobre posee un sensor de temperatura que da retroalimentación al circuito programable. El circuito activa una fuente de alimentación para aumentar la temperatura de cada azulejo. Elementos termoeléctricos pasivos actúan como elementos de calefacción constante para mantener la temperatura deseada, mientras que un disipador de calor enfriado por un ventilador de enfriamiento constante. La magnitud del cambio de temperatura determina la velocidad del proceso de una manera no lineal. Sólo requiere un aumento de 2 ° C 0.1 s y un aumento de 18 ° C requiere 4 s. Una pantalla conectada al circuito programable (figura 1) informa al usuario de la temperatura medida por los sensores de temperatura en cada uno de los azulejos. Las baldosas de cobre están rodeadas por un anillo de aluminio constantemente calentado a 50 ° C (figura 1B y 1C) por semiconductores alrededor de la periferia. Este anillo forma los bordes de la Arena vuela (figura 1), la zona en la que las moscas son para colocarse. La Arena de la mosca está cubierta por una cubierta de vidrio siliconado (figura 1A y 1C), que proporciona un espacio alto y 3 mm que asegura que vuela puede caminar pero no volar. Junto a la Arena de la mosca son dos LEDs rojos (figura 1) que pueden programarse para marcar diferentes fases experimentales. Por ejemplo, los resultados se muestra en la figura 2A, cada LED está asociada con una temperatura distinta, mientras que en la figura 2B, cada LED indica 60 s. El software de FlySteps puede registrar cuando cada uno de los LED indicativos, y el investigador puede utilizar esta información para determinar automáticamente las fases experimentales basadas en la temperatura o el tiempo.
El ámbito de control de temperatura puede utilizarse para comparar la respuesta de comportamiento de moscas de diferentes orígenes genéticos a cambios de temperatura dinámica. Por ejemplo, moscas de diferentes especies pueden estar expuestos al poco a poco aumento de la temperatura (figura 3) para comparar las diferencias en el rendimiento térmico. La velocidad de todas las especies aumenta a medida que aumenta la temperatura hasta llegar a un punto de máximo rendimiento, después de lo cual decayó y murió. Sin embargo, cada especie tiene una curva de respuesta particular con velocidades de respuesta máxima específica y tolerancia térmica. Informes anteriores han demostrado que Drosophila de diferentes especies difieren entre el momento del desarrollo, longevidad, fecundidad, dimensiones del cuerpo, comunicación sexual y temperatura tolerancia3,6,7 ,8,22. Así pues, nuestra descripción de locomoción propios de cada especie en un gradiente de temperatura agrega a este cuerpo de trabajo.
El ámbito de control de temperatura puede utilizarse también para explorar la respuesta a los experimentos basados en temperatura de acondicionamiento. La forma más simple de este enfoque es un paradigma de condicionamiento operante en que entrenan a los moscas a preferir un lado de la arena sobre el otro, calentando la parte que será evitado23,24,25. Nos expuestos a moscas individuales a 40 ° C en el medio y uno de los azulejos laterales, dejando el otro lado azulejo en un cómodo 22 ° C (figura 4). El salvaje-tipo vuela detenido a lo largo de la arena y permaneció en el lugar cómodo rápidamente. Por el contrario, el mutante de memoria clásico burro mantuvo explorando la arena y pasó menos tiempo que los controles en la ubicación cómoda. Las diferencias entre el funcionamiento de las moscas de tipo salvaje y mutantes de burro llegó a ser más grandes cuando todas las fichas estaban resueltos a 22 ° C y se realizaron comparaciones entre los grupos de tratamiento. Mutantes de burro también mostraron mayores diferencias entre las fases de entrenamiento y test en comparación con las moscas del tipo salvaje (figura 4). Estos resultados sugieren un efecto de memoria en permanecer en el lugar cómodo.
Combinaciones de temperatura y ubicación también son útiles para entender la función de los receptores de temperatura durante los cambios de temperatura dinámica. Hemos expuesto individuales mutantes de D. melanogaster Gr28b.d y TrpA1GAL4 para aumento de la temperatura (aumento de 2 ° C cada 60 s) mientras que proporciona un lugar cómodo a 22 ° C (figura 5). La cómoda ubicación cambió de izquierda a derecha y viceversa, por iteración. Los resultados muestran que los mutantes de Gr28b.d periferia temperatura del receptor se comportan como el control, ya que pasan más tiempo en el lugar cómodo como aumentos de temperatura. Sin embargo, cerebro temperatura del receptor TrpA1GAL4 mutantes no es afectada por el aumento de la temperatura y no cambia sus ubicaciones en la arena. Los aumentos y disminución en la curva de TrpA1GAL4 mutantes muestran el efecto en moscas que ya estaban sentados en el lugar cómodo antes de convertirse en cómodo y permaneció allí durante esa fase. La consistencia de picos y valles de la curva de TrpA1GAL4 sugieren que estas moscas sigue siendo todavía para la mayoría de la experiencia; por lo tanto, constantemente se contaron cuando su ubicación era el considerado cómodo. Esta conclusión fue confirmada por la inspección visual de los vídeos grabados. Estos resultados apoyan anteriores fisiológicas informes sugiriendo esa percepción de la periferia de grandes y rápidos cambios no depende de Gr28b.d17 y que las moscas poseen un mecanismo central principal a temperatura del sentido basado en TrpA1 14,21.
Figura 1: Diagrama de temperatura controlada-arena. (A) vista lateral de la arena con control de temperatura. Un circuito programable conecta un sensores de temperatura y suministro de potencia con resistencias bajo tejas de cobre para controlar su temperatura. Los azulejos se enfrían constantemente a través de un disipador de calor conectado a un ventilador. Un anillo de aluminio calentado sobre la cual descansa una cubierta de cristal rodea los azulejos. (B) termográfica que muestra las fichas de 24 ° C (arriba) y azulejos de lado a 24 ° C con una media baldosa a 30 ° C (inferior). (C) una visión superior de la arena. Una cámara registra la baldosas cobre, anillo de aluminio y LED ' s rojos, entonces automáticamente determina fases experimentales. Una pantalla en la esquina de la caja, no registrada por la cámara, muestra la temperatura actual del azulejo. (D) anillo de la luz: dos tiras de LED blanco cálidas dentro de una caja de madera cubierto de papel blanco aseguran iluminación constante y simétrica de la arena entera. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: moscas deben aclimatarse a la arena antes de iniciar el protocolo de la temperatura. (A) moscas macho solos fueron introducidos a la arena y permite explorar en una constante de 16 ° C por 1 min, después de que la temperatura comenzó a aumentar. (B) solo moscas expuestas a 16 ° C, 20 ° C y 24 ° C (sin diferencias de grupo; F ANOVA dos vías (2.570) = 4.156, p = 0.162) tienen una mayor locomoción al principio del experimento que después de 5 minutos (F de ANOVA de dos vías RM (9.570) = 7.803, p < 0.0001). Los datos son la media y error estándar de la media (± SEM) de las moscas hembra Virgen 20 5 a 7 días de edad probado sobre varios días. Asterisco indica diferencia significativa entre grupos (*** p < 0.0001; Tukey de prueba de comparación múltiple, p = 0.05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Locomoción de 5 especies de Drosophila expuesta a aumentando poco a poco las temperaturas. Hombre individual vuela desde templado tropical (azul), (rojo) y cosmopolita especie de Drosophila (marrón) fueron expuesto a un gradiente de aumento de temperatura (2 ° C cada 60 s) entre 16 y 46 ° C. Los primeros 7 min fueron constantemente a 22 ° C permitir que vuela explorar la arena. Especies fueron significativamente diferentes (F(4,70) de ANOVA de dos vías RM = 28.46, p < 0.001). (a) D. melanogaster (marrón; lleno de círculos) era más rápido cuando introdujo en la arena. (b) D. Plaza (rojo; vaciar plazas) era más rápido aumento de la temperatura. (c) D. suzukii (marrón; cuadrado relleno) fue más lento que las otras moscas cosmopolitas en su punto de máximo rendimiento. (d) D. simulans (marrón; vaciar círculos) estaba en decadencia en el punto máximo de D. melanogaster. Cada punto representa la media (± SEM) de las moscas macho 15 5 a 7 días de edad probados durante varios días. Significado indicado por símbolos (♦ = diferencia de todos, p < 0.0001; † = diferencia de todos excepto la D. melanogaster, p < 0.0001; • = diferencia de D. melanogaster, p < 0.01; ¢ = diferencia de D. melanogaster, p < 0.001; = diferencia entre grupos con nombre, p < 0.0001; Tukey de prueba de comparación múltiple, p = 0.05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: el ámbito de control de temperatura puede ser utilizado para el condicionamiento operante. Cepa de Cantón-S D. melanogaster (tipo salvaje; negro frontera) y dnc1 (burro; borde rojo) mutantes fueron entrenados para preferir un azulejo lateral a 22 ° C después de calentar el medio y frente a los azulejos laterales a 40 ° C durante 4 min (formación, no patrón). Memoria de las áreas calentadas y luego se prueba poniendo todas las fichas a 22 ° C (prueba; cuadrícula). Moscas se acondicionaron a preferir baldosas a la izquierda en la mitad de los experimentos, entonces los azulejos a la derecha en la otra mitad. Se midió el porcentaje de tiempo total en el azulejo a 22 ° C durante la formación y pruebas para comparar actuaciones. Grupos fueron significativamente diferentes (F(3,76) ANOVA unidireccional = 23.23, p < 0.0001), con burro realizar peor tipo salvaje en general. Los datos son la media (± SEM) de las moscas hembra Virgen 20 días 5 a 7 pruebas durante varios días. Los asteriscos indican diferencias de significación entre los grupos (*** p > 0.0001; *** p > 0,001; ** p > 0.01; Tukey de prueba de comparación múltiple, p = 0.05) por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: respuesta de mutantes de temperatura al aumentar la temperatura cuando se proporciona una ubicación cómoda. Mutantes de temperatura Gr28b.d (verde; plazas) responden como controles (w1118, negro, círculos) incrementando el porcentaje de tiempo en la zona cómoda como aumentos de temperatura (F de ANOVA de dos vías RM (1,38) = 0.5107, p = 0.479). Mutantes de TrpA1GAL4 (amarillo; triángulos) son diferentes de los controles (w1118negro), como no aumentar el tiempo en la zona cómoda como aumentos de temperatura (F de ANOVA de dos vías RM (1,38) = 1.670, p = 0.019). Los datos son la media (± SEM) de 20 moscas macho probados durante varios días de edad de 5 a 7 días. TrpA1GAL4 es significativamente diferente de Gr28b.d y el control (p < 0.05; Tukey de prueba de comparación múltiple, p = 0.05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí hemos presentado una automatizado con control de temperatura arena (figura 1) que produce cambios de la temperatura exacto en tiempo y espacio. Este método permite la exposición del individuo de la Drosophila no sólo pre-programados aumenta gradual de la temperatura (figura 2 y figura 3), sino a los retos de la temperatura dinámica en el cual se calentó cada baldosa de la arena mosca forma independiente a una temperatura diferente (figura 4 y figura 5).
El ámbito de control de temperatura utiliza un enfoque innovador para el proceso de calentamiento. En vez de producir cambios de temperatura en los azulejos a través de resistencias termoeléctrico Peltier utilizados en los métodos tradicionales, la arena con control de temperatura utiliza corriente para calentar una masa de cobre con las baldosas de cobre, y moscas se colocan en la parte superior. La masa de cobre se enfría constantemente por un bloque disipador conectado a un ventilador. Elementos Peltier como se utilizan para mantener la temperatura deseada de la masa de cobre una vez se haya calentado. Porque estos elementos no son los generadores principales de temperatura, sufren menos estrés, que se extiende su vida útil y permite cambios más rápidos de la temperatura. Un circuito programable que recibe información de sensores de temperatura en cada uno de lo azulejo de cobre, que puede también activar la fuente de alimentación de baja tensión, coordina el mecanismo de la calefacción. Los investigadores pueden especificar dónde y cuándo se producen cambios de temperatura y determinan la intensidad y dirección de tales cambios. Además, el método de acoplamiento con especializado seguimiento de software, como FlySteps, permite análisis de todos los aspectos relativos a movimiento de Drosophila , como la velocidad total a ciertas temperaturas o el tiempo pasado en ciertos lugares ( Figura 2, figura 3, figura 4, figura 5). Sin embargo, todos los resultados deben tener en cuenta las características inherentes a volar el comportamiento que pueda afectar su locomoción. Por ejemplo, si vuela no se les permite explorar el campo e instalarse antes de cambiar la temperatura, las medidas de velocidad pueden ser artificialmente altas (figura 2). Moscas también pueden dejar olores que afectan moscas posterior; por lo tanto, hay que limpiar la cubierta de vidrio y cinta que cubre los azulejos debe cambiarse entre sujetos. Dado que locomoción disminuye en edad26, es importante que moscas son estandarizadas por edad para evitar la variación en los resultados. En nuestro ámbito, moscas también han demostrado centrophobism, prefiriendo los bordes sobre la zona media. Experimentadores deben controlar esto cambiando la ubicación de las áreas cómodas para evitar sobreestimar preferencia de sitio.
Las características actuales de la arena y los requisitos del proceso de seguimiento podrían limitar algunos procedimientos experimentales. Por ejemplo, el medio ambiente cerca de la arena no incluye puntos de acceso a través del cual se podían introducir olores, lo que impide que los estudios en los que este estímulo es importante. Del mismo modo, el tracker de FlyStepts requiere un videos con fondo uniforme, que limita la posibilidad de añadir alimentos u otros artículos de medio ambiente de la mosca. La arena puede ser adaptada para incluir una conexión a una válvula de gas, y desarrollos de software existen que puedan tener objetos más a estar presente. Proyectos futuros pueden aprovechar estas posibilidades para adaptar el ámbito de control de temperatura a necesidades experimentales.
Por último, hemos demostrado en los resultados que diferentes especies de Drosophila el desempeño diferente temperatura aumenta (figura 3) y que mutantes de temperatura no responden de la misma manera como controles (figura 5). Esto demuestra que este nuevo método puede utilizarse para explorar el comportamiento térmico de Drosophila y cómo es afectado por la selección natural y características funcionales. Por último, ilustra que nuestro método puede ayudar a entender de adaptación térmica y en el futuro estudios de especiación, así como las interacciones de los receptores de temperatura con otros estímulos.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado en parte por una beca del comportamiento y del programa de Neurociencia cognitiva de la Universidad de Groningen y una beca de postgrado de la Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) de México, otorgado a Andrea Soto Padilla y una beca de la John Templeton Foundation para el estudio del tiempo otorgado a Hedderik van Rijn y Jean-Christophe Billeter. Agradecemos también a Peter Gerrit Bosma por su participación en el desarrollo del FlySteps tracker.
Secuencias de comandos TemperaturePhases, FlySteps y FlyStepAnalysis pueden encontrarse información complementaria como en el siguiente enlace temporal y disposición:
https://dataverse.nl/privateurl.XHTML?token=c70159ad-4d92-443d-8946-974140d2cb78
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arduino Due | Arduino | A000062 | Software RUG |
| Electronics Board | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-Main-02-2014 | |
| Power supply Boost | XP-Power 48. V 65 W | ECS65US48 | Set to 53 Volt |
| Power supply Tile Heating | XP-Power 15. V 80 W | VFT80US15 | |
| Power supply Cooling | XP-Power 15. V 130 W | ECS130U515 | |
| Peltier elements | Marlow Industries | RC12-4 | 2 Elements, controlled DC feed |
| Heat sink | Fisher Technik | LA 9/150-230V | Decoupled for vibration |
| Temperature sensors | Measurement Specialties | MCD_10K3MCD1 | Micro Thermistor Probe |
| Copper block/tiles | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-CB-01-2014 | |
| Auminum ring | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-RoF-02-2015 | |
| Tesa 4104 white tape 25 x 66 mm | RS Components | 111-2300 | White conductive tape |
| Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
| Warm white LED strip | Ledstripkoning | HQ-3528-SMD | 60 LEDs per meter |
| Switch Power Supply | Generic | T-36-12 | |
| Logitech c920 | Logitech Europe S.A | PN960-001055 | |
| QuickTime Player | Apple Computer | Recording program | |
| Tracking analysis software | R | Packages: pacman | |
| Tracking analysis software | MATLAB | ||
| Thermal Imaging | FLIR T400sc | ||
| Graphs and Statisticts Software | Graph Pad Prism | ||
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | Siliconising agent |
| Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
| Flypad | Flystuff | 59-114 | |
| Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25x95 mm |
| Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
| Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
| Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
| Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
| Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
| Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
| Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
| Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
| Molasses | Flystuff | 62-117 | |
| Active dry yeast | Red Star | ||
| Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
References
- Abram, P. K., Boivin, G., Moiroux, J., Brodeur, J. Behavioural effects of temperature on ectothermic animals unifying thermal physiology and behavioural plasticity. bioRxiv. , (2016).
- Rajpurohit, S., Schmidt, P. S. Measuring thermal behavior in smaller insects: A case study in Drosophila melanogaster demonstrates effects of sex, geographic origin, and rearing temperature on adult behavior. Fly. 10 (4), 149-161 (2016).
- Jezovit, J. A., Levine, J. D., Schneider, J. Phylogeny environment and sexual communication across the Drosophila genus. The Journal of Experimental Biology. 220 (1), 42-52 (2017).
- Sinclair, B. J., Williams, C. M., Terblanche, J. S. Variation in Thermal Performance among Insect Populations. Physiological and Biochemical Zoology. 85 (6), 594-606 (2012).
- Gibert, P., Huey, R., Gilchrist, G. Locomotor performance of Drosophila melanogaster: Interactions among developmental and adult temperautures, age, and geography. Evolution. 55 (1), 205-209 (2001).
- Trotta, V., et al. Thermal plasticity in Drosophila melanogaster: A comparison of geographic populations. BMC Evolutionary Biology. 6, 1-13 (2006).
- Klepsatel, P., Gálikova, M., De Maio, N., Huber, C. D., Christian, S., Flatt, T. Variation in thermal performance and reaction norms among populations of Drosophila melanogaster. Evolution. 67 (12), 3573-3587 (2013).
- Latimer, C. A. L., Wilson, R. S., Chenoweth, S. F. Quantitative genetic variation for thermal performance curves within and among natural populations of Drosophila serrata. Journal of Evolutionary Biology. 24, 965-975 (2011).
- Chen, J., Nolte, V., Schlotterer, C. Temperature-related reaction norms of gene expression: Regulatory architecture and functional implications. Molecular Biology and Evolution. , (2015).
- Kellermann, V., Overgaard, J., Hoffmann, A. A., Flojgaard, C., Svenning, J. -C., Loeschcke, V. Upper thermal limits of Drosophila are linked to species distributions and strongly constrained phylogenetically. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16228-16233 (2012).
- Andersen, J. L., Manenti, T., Sørensen, J. G., Macmillan, H. A., Loeschcke, V., Overgaard, J. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
- Krstevska, B., Hoffmann, A. A. The effects of acclimation and rearing conditions on the response of tropical and temperate populations of Drosophila melanogaster and D. simulans to a temperature gradient (Diptera: Drosophilidae). Journal of Insect Behavior. 7 (3), 279-288 (1994).
- Frank, D. D., Jouandet, G. C., Kearney, P. J., Macpherson, L. J., Gallio, M. Temperature representation in the Drosophila brain. Nature. 519 (7543), 358-361 (2015).
- Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. The coding of temperature in the Drosophila brain. Cell. 144 (4), 614-624 (2011).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
- Ni, L., et al. A gustatory receptor paralogue controls rapid warmth avoidance in Drosophila. Nature. 500 (7464), 580-584 (2013).
- Liu, W. W., Mazor, O., Wilson, R. I.
- Neely, G. G., et al. TrpA1 Regulates Thermal Nociception in Drosophila. Public Library of Science ONE. 6 (8), e24343 (2011).
- Zhong, L., et al. Thermosensory and non-thermosensory isoforms of Drosophila melanogaster TRPA1 reveal heat sensor domains of a thermoTRP channel. Cell Reports. 1 (1), 43-55 (2012).
- Barbagallo, B., Garrity, P. A. Temperature sensation in Drosophila. Current Opinion in Neurobiology. 34, 8-13 (2015).
- Tang, X., Platt, M. D., Lagnese, C. M., Leslie, J. R., Hamada, F. N. Temperature integration at the AC thermosensory neurons in Drosophila. Journal of Neuroscience. 33 (3), 894-901 (2013).
- Petavy, G., David, J. R., Gibert, P., Moreteau, B. Viability and rate of development at different temperatures in Drosophila: A comparison of constant and alternating thermal regimes. Journal of Thermal Biology. 26 (1), 29-39 (2001).
- Diegelmann, S., Zars, M., Zars, T. Genetic dissociation of acquisition and memory strength in the heat-box spatial learning paradigm in Drosophila. Learning & Memory. 13 (1), 72-83 (2006).
- Zars, M., Zars, T. High and low temperatures have unequal reinforcing properties in Drosophila spatial learning. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 192 (7), 727-735 (2006).
- Zars, T., Wolf, R., Davis, R., Heisenberg, M. Tissue-specific expression of a type I adenylyl cyclase rescues the rutabaga mutant memory defect: in search of the engram. Learning & Memory. 7 (1), Cold Spring Harbor, NY. 18-31 (2000).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Brain Research. 46 (5), 320-325 (2011).
