Summary
Her præsenterer vi en protokol for at automatisk bestemme Drosophila bevægeapparatet ydeevne på skiftende temperaturer ved hjælp af en programmerbar temperaturregulerede arena, der producerer holdbar og nøjagtig temperaturændringer i tid og rum.
Abstract
Temperatur er et allestedsnærværende miljømæssig faktor, der påvirker hvordan arter distribuere og opføre sig. Forskellige arter af Drosophila bananfluer har specifikke svar på skiftende temperaturer efter deres fysiologiske tolerance og tilpasningsevne. Drosophila fluer besidder også en temperaturfølende system, der er blevet grundlæggende at forstå det neurale grundlag af temperatur forarbejdning i ectotherms. Vi præsenterer her et temperatur-kontrolleret arena, der tillader hurtig og præcis temperaturændringer med tidsmæssige og rumlige kontrol at udforske svar af individuelle fluer til skiftende temperaturer. Enkelte fluer er placeret i arenaen og udsat for præ-programmerede temperatur udfordringer, såsom ensartet gradvis øges i temperatur til at bestemme reaktion normer eller rumligt distribueret temperaturer på samme tid at fastlægge præferencer. Enkeltpersoner registreres automatisk, giver mulighed for kvantificering af hastighed eller placering præference. Denne metode kan bruges til at kvantificere hurtigt svar over en bred vifte af temperaturer til at bestemme temperaturen performance kurver i Drosophila eller andre insekter af samme størrelse. Derudover kan det bruges til genetiske undersøgelser til kvantificering af temperatur indstillinger og reaktioner mutanter eller wild-type fluer. Denne metode kan hjælpe med at afdække grundlaget for termisk artsdannelse og tilpasning, samt de neurale mekanismer bag temperatur behandling.
Introduction
Temperatur er et konstant miljømæssig faktor, der påvirker hvordan organismer fungerer og opfører sig1. Forskelle i bredde og højde medføre forskelle i type af klimaer organismen udsættes for, hvilket medfører evolutionary udvalg for deres svar til temperatur2,3. Organismer reagere på forskellige temperaturer gennem morfologiske, fysiologiske og adfærdsmæssige tilpasninger, der maksimerer ydeevnen under deres særlige miljøer4. For eksempel, i frugtflue Drosophila melanogasterhar befolkninger fra forskellige regioner forskellige temperatur indstillinger, kroppen størrelser, udviklingsmæssige gange, lang levetid, frugtbarhed og gå ydeevne ved forskellige temperaturer,2 ,5,6,7. Mangfoldighed observeret mellem fluer af forskellig oprindelse er forklaret i en del af genetisk variation og plast gen expression8,9. Ligeledes Drosophila arter fra forskellige områder distribuere forskelligt blandt temperatur forløb og vise forskelle i modstandsdygtighed over for ekstreme varme og kolde test10,11,12.
Drosophila har også for nylig blevet model af valg til at forstå den genetiske og neurale grundlag af temperatur perception13,14,15,16,17. Bredt, voksne fluer opfatter temperatur gennem kolde og varme perifere temperaturfølere i antenner og temperaturfølere i hjernen13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20. periferien receptorer for varme temperaturer express Gr28b.d16 eller feber21, mens periferien kolde receptorer er karakteriseret ved Brivido14. I hjernen behandles temperatur af neuroner at udtrykke TrpA115. Adfærdsmæssige studier på mutanter af disse veje forbedring af vores forståelse af hvordan temperatur er behandlet og give indsigt i mekanismerne, der varierer blandt befolkningerne i Drosophila fra forskellige regioner.
Her beskriver vi en temperatur-kontrolleret arena, der producerer hurtige og præcise temperaturændringer. Efterforskere kan pre program disse ændringer, som muliggør standardiserede og repeterbare temperatur manipulationer uden menneskelig indgriben. Fluer registreres og spores med specialiseret software til at bestemme deres position og hastighed på forskellige faser af et eksperiment. Den vigtigste måling præsenteret i denne protokol er den omvandrende hastighed ved forskellige temperaturer, fordi det er en økologisk relevante indeks af fysiologiske ydeevne, der kan identificere individuelle termisk tilpasningsevne5. Sammen med temperatur receptor mutanter, kan denne teknik hjælpe med at afsløre mekanismerne, der termisk tilpasning på cellulært og biokemiske niveauer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af flyve mad Medium
- Hæld 1 liter vand fra hanen i en 2 L glas bægerglas og tilføje en magnetisk røre bar. Sætte bægerglasset på en magnetisk varmeplade ved 300 ° C, indtil kogepunktet er nået.
- Rør 500 runder/min. og tilføje følgende: 10 g agar, 30 g af glukose, 15 g saccharose, 15 g majsmel, hvedekim. 10 g, 10 g af sojamel, 30 g af melasse og 35 g af aktive tørre gær.
- Når blandingen skum energisk, skrue ned varmeplade temperatur til 120 ° C under stadig omrøring.
- Drej varmeplade temperaturen yderligere ned til 30 ° C efter 10 min og fortsætte omrøring indtil blandingen køler til 48 ° C. Måle temperaturen ved at indsætte et termometer direkte i maden uden at røre væggene i bægerglasset.
- 2 g p-hydroxy-benzoesyre syre methylester opløses i 10 mL 96% ethanol og føje det til mix, sammen med 5 mL 1 M propionsyre. Fortsæt omrøring i 3 min.
- Slukke varmepladen og hældes 45 mL af mad i opdræt flasker og 6,5 mL af fødevarer i samling hætteglassene.
2. forberedelse af fluer
- Sted 20 mænd og 20 kvindelige flyver i opdræt flaskerne indeholder 45 mL af flyve mad medium. Overføre fluer til nye flasker efter 3-4 dage ved at trykke dem ned og derefter trykke dem ind i de friske flasker. Kassér flyver efter tre ændringer.
- Placer flasker i inkubator under 12-h lys/12-Hansen mørk cyklusser med en konstant temperatur på 25 ° C.
Bemærk: En ny generation af fluer vil velsmagende efter ti dage.
- Placer flasker i inkubator under 12-h lys/12-Hansen mørk cyklusser med en konstant temperatur på 25 ° C.
- Bedøver nyligt eclosed fluer på CO2-puder i højst 4 min og samle dem i 2,5 x 9,5 cm flyve opdræt hætteglas med 6,5 mL af flyve mad medium ved hjælp af et paintbrush.
- Indsamle kun jomfru fluer og adskille dem med sex i grupper af 20 fluer per opdræt hætteglas.
- Placer hætteglas inde i væksthuse for 5-7 dage, ændre fluer til nye hætteglas hver 2-3 dage og på dagene før eksperimenter.
3. rammen af lys
- Gøre en træramme af 10 cm lang, 4 cm bredde, 4 cm højde og 0,5 cm tykke.
- På hver af de korte kanter, oprette en kant af 4 cm længde, 4 cm højde og 1,5 cm bredde indefter område af træramme. Forlade den indvendige side af grænsen åbne.
- Bore to huller på 0,5 cm i diameter i skæringspunktet mellem en af de lange kanter af træramme og på hver af grænserne på de korte kanter.
- Sted 10 cm af en varm hvid LED strip inde i hver af grænserne på de korte kanter. Skræl tilbage af LED strip til straks lim det på plads.
Bemærk: For eksperimenter i hvilken belysning skal fjernes, varm hvid LED strip kan erstatte infrarød LED strips. - Tilslut den ene ende af LED strip i en af grænserne til den omskiftet strømforsyning og dens anden ende til LED strip på den modsatte kant.
- Tænd den omskiftet strømforsyning til at kontrollere, at begge LED strips tænder.
- Dække den åbne side af hver grænse med et hvidt stykke papir.
- Lim et andet stykke papir til hver af de interne faser af de lange kanter.
4. Temperaturstyret Arena
- Tænd den temperatur-kontrolleret arena (figur 1A og 1 C). Sikre, at blæseren starter kører og aluminium ring starter varmer op.
- Brug et USB-kabel til at tilslutte den temperatur-kontrolleret arena til kontrol computer kører scriptet TemperaturePhases med temperatur sekvenser.
- Åbne TemperaturePhases script i kontrol computer og bekræfte, at temperatur sekvensen er korrekt sat op (Video 1).
- Kontroller, at varigheden af hver eksperimentelle fase er indstillet til 60 s ved at kontrollere, at "par. StimulusDur"er lig med 60 s.
- Kontrollere, at de 1) antal svarende til ønsket antal faser, 2) iterativ ON/OFF set-up af den vejledende rød lysemitterende dioder (lysdioder), 3) 2 ° C temperaturstigning pr. fase, og 4) 16 ° C som udgangspunkt temperaturen er alle korrekte under "Start den eksperimentelle blok"sektion.
Bemærk: Tillad fluer til at acclimate til flyve Arena i 7 min. ved 16 ° C for at undgå en kunstig stigning i hastighed under de første eksperimenterende faser (figur 2). - Kør scriptet TemperaturePhases . Softwaren vil initialisere i 5 sekunder som fastlagt i "arena. Vent"og derefter stop.
- Tryk på mellemrumstasten på tastaturet for at begynde at køre de eksperimentelle faser når et fly er blevet blæst ind i arenaen flyve (trin 5.3).
Bemærk: TemperaturePhases er den nuværende script kontrol boksen; Det er dog muligt at oprette andre brugerdefinerede scripts til at bruge denne enhed, at tilpasser sig kravene i forskellige eksperimenter.
- Tilslut kameraet på toppen af arenaen til optagelse computer ved hjælp af kameraets USB-kabel.
- Åbn programmet videooptagelse (Se Tabel af materialer) i optagelse computer ved at vælge "fil | Nye filmoptagelse". En skærm, der viser billede fra kameraet åbner.
- Sikre, at kamerabilledet indfanger alle kanter af arenaen og de vejledende røde lysdioder.
- Starte optagelsen ved at trykke på den røde knap i midten af skærmens nederste kant viser kamerabilledet når rammen af lys ligger omkring arena (trin 5.4).
Bemærk: små ændringer i belysning kan påvirke nøjagtigheden af sporingen. Det anbefales at holde belysningen af den temperatur-kontrolleret arena konstant ved at fastsætte placeringen af apparatet.
5. temperatur adfærdsmæssige eksperimenter
- Forberede den flyve Arena (figur 1 c).
- Placer en streng af hvide ledende tape på toppen af kobber fliser, at sikre alle kanter er dækket.
- Placer den opvarmede aluminium ring omkring kobber fliserne. Kanten af ringen passer perfekt omkring kobber fliserne, så det er altid placeret i den samme placering.
- Rene glas dække med en ren væv og placere den på toppen af aluminium ring, hvilket efterlader et hul, hvorigennem en flue kan blive blæst i.
Bemærk: Før eksperimenter, pels dækslet glas med den siliconizing agent til at skabe en glat overflade. Anvende den siliconizing agent for 24 h og skyl det med vand før brug.
- Kør scriptet TemperaturePhases (trin 4.3.3) og Åbn programmet videooptagelse (trin 4.5).
- Blæse flyve fra et opdræt hætteglas (trin 2.2.2) ind i arenaen flyve (fx., 1 mandlige flyve i figur 3).
- Tage et hætteglas med fluer fra rugemaskinen, skal du trykke på den to gange for at tvinge dem til at gå til bunds, fælde en flue med en mund indsugningsventil, og luk hætteglasset og sætte det tilbage i inkubatoren.
- Læg fluen i arena gennem den kløft, der er blevet efterladt mellem glas dækning og aluminium ring (trin 5.1.3).
- Lukke kløften mellem glas dækning og aluminium ring ved at skubbe dækslet glas, indtil den når kanten af aluminium ring, så snart fluen er introduceret til den flyve Arena.
- Placere rammen af lys omkring arena at sikre symmetrisk belysning.
- Mark placeringen (f.eks., ved hjælp af en permanent markør) af rammen af lys omkring den flyve Arena (figur 1 c) at sikre, at rammen er altid placeret i den samme placering.
- Starte optagelsen med video-optagelsesprogram (trin 4.5.2) og tryk på mellemrumstasten på tastaturet på kontrol computer til at begynde at køre de eksperimentelle faser (trin 4.3.4).
- Efter alle eksperimentelle faser er færdig, gemme video i .mp4 eller .avi-format og fjerne fluen fra arenaen flyve med munden indsugningsventil.
Bemærk: I slutningen af de eksperimentelle faser kan bestemmes ved begge vejledende røde lysdioder er slukket eller ved at TemperaturePhases script stoppe.- Stoppe videooptagelsen ved at trykke på stop-knappen i skærmens nederste kant i optagelsesprogram. Tryk på "fil | Gem som"at gemme videoen.
6. video sporing og analyse af Data
- Bruge FlySteps tracking software (Video 2) til at spore videoerne.
- Åbn "configuration_file.ini" i mappen "FlyTracker".
- Angiv placeringen af videoerne i "video_folder" og navnene på videoerne i "video_files".
- Angive den flyve Arena i "arena_settings" baseret på grænser (x, y) pixelkoordinater flere punkter på kanten af arenaen.
- Angiv placeringen af de vejledende røde lysdioder i "led_settings" baseret på (x, y) pixelkoordinater placeringen af midten af lysdioder.
- Kontrollere placeringen af grænser af arenaen flyve ved at indstille "debug" til "true" i "arena_settings", at klikke på "Gem", og kører scriptet i terminalen. Et skærmbillede af videoen vises med en blå firkant, dannet af de koordinater, der er indtastet i "arena_settings".
Bemærk: Denne square omgiver området kan spores. - Ændre "debug" i "arena_settings" til "false", klik på "Gem", og køre skærmen i terminalen endnu.
Bemærk: Dette vil starte sporing proces.
Bemærk: Fluer kan gå ud af området tracking på opvarmet aluminium ringen. Dette sker under de første sekunder af et eksperiment, hvorefter fluer holder rørende den opvarmede ring og forblive inde i området tracking.
Bemærk: Videoer kan spores med andre tracking software i henhold til eksperimentatoren præferencer.
- Brug (x, y) placering af hvert fly leveret af tracking software til at beregne foranstaltning af interesse for temperatur ydeevne. Brugerdefinerede scripts (fx., FlyStepsAnalysis i tillægs) kan bruges.
- Sammenlign temperatur performance kurver af forskellige flyve grupper ved hjælp af gentagne målinger (RM) variansanalyse (ANOVA) og post-hoc flere sammenligninger ved hjælp af statistisk software (Se Tabel af materialer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den temperatur-kontrolleret arena (figur 1A) består af tre kobber fliser hvis temperaturen kan styres individuelt gennem en programmerbar kredsløb. Hver kobber flise besidder en temperaturføler, der giver feedback til programmerbare kredsløb. Kredsløbet aktiveres en strømforsyning for at øge temperaturen på hver flise. Passiv termoelektrisk elementer fungerer som konstant varmeelementer til at opretholde den ønskede temperatur, mens en køleplade, køles af en blæser giver konstant køling. Omfanget af temperaturforandringer bestemmer hastigheden på processen i en ikke-lineær måde. En stigning på 2 ° C kræver kun 0,1 s, og en stigning på 18 ° C kræver 4 s. En skærm tilsluttet den programmerbare kredsløb (figur 1 c) informerer brugeren af temperaturen målt af temperaturfølere i hver af fliserne. Kobber fliserne er omgivet af en aluminium ring konstant opvarmet til 50 ° C (figur 1B og 1 C) af halvledere rundt i periferien. Denne ring danner kanterne af flyve Arena (figur 1 c), det område, som fluer skal placeres. Den flyver Arena er omfattet af en Silikoniseret glas dækning (figur 1A og 1 C), som giver en 3 mm høj plads, som sikrer, at fluer kan gå men ikke flyve. Ved siden af arenaen flyve er to røde lysdioder (figur 1 c), der kan programmeres til at markere forskellige eksperimentelle faser. For eksempel, for resultaterne vist i figur 2A, hvert LED er forbundet med en anden temperatur, mens i figur 2B, hver LED angiver 60 s. FlySteps software kan registrere, når hver af de vejledende lysdioder er på, og forskeren kan derefter bruge disse oplysninger til automatisk for at bestemme de eksperimentelle faser baseret på temperatur eller tid.
Den temperatur-kontrolleret arena kan bruges til at sammenligne den adfærdsmæssige reaktion af fluer fra forskellige genetiske baggrunde til dynamisk temperaturændringer. For eksempel, kan fluer fra forskellige arter blive udsat for gradvist stigende temperaturer (figur 3) at sammenligne forskelle i termisk ydeevne. Hastigheden af alle arter stiger temperaturen stiger indtil nå et punkt af maksimal ydelse, hvorefter det henfaldet og omkom. Enkelte arter har dog en særlig respons kurven med bestemte maksimale svar hastigheder og termisk tolerancer. Tidligere rapporter har vist, at Drosophila fra forskellige arter varierer blandt udviklingsmæssige timing, lang levetid, frugtbarhed, karosserimål, seksuel kommunikation og temperatur tolerance3,6,7 ,8,22. Således, vores beskrivelse af artsspecifikke bevægelse i en temperaturgradient tilføjer til dette organ af arbejde.
Den temperatur-kontrolleret arena kan også bruges til at udforske svar til konditionering eksperimenter baseret på temperatur. Den simpleste form af denne tilgang er en operant betingning paradigme, hvor fluer er uddannet til at foretrække den ene side af arenaen over den anden, ved opvarmning af den side, der vil være undgået23,24,25. Vi udsat enkelte fluer til 40 ° C i midten og en af side fliserne, mens anden side flisen på en komfortable 22 ° C (figur 4). Wild-type fluer hurtigt stoppet bevæger sig langs arenaen og forblev i den behagelige beliggenhed. Derimod klassisk hukommelse mutant tumpe holdt udforske arena og brugte mindre tid end kontrol i den behagelige beliggenhed. Forskellene mellem udførelsen af wild-type fluer og tumpe mutanter blev større, når alle fliser blev sat til 22 ° C og sammenligningerne blev foretaget mellem grupperne behandling. Tumpe mutanter viste også større forskelle mellem træning og test faser i forhold til wild-type fluer (figur 4). Disse resultater tyder på en påvirkning af hukommelse tilbage i den behagelige beliggenhed.
Kombinationer af temperatur og placering er også nyttigt at forstå funktionen af forskellige temperatur receptorer under dynamiske temperaturændringer. Vi udsat enkelte D. melanogaster Gr28b.d og TrpA1GAL4 mutanter stigende temperaturer (2 ° C øge hver 60 s) samtidig med en behagelig beliggenhed ved 22 ° C (figur 5). Den behagelige beliggenhed flyttet fra venstre til højre, og vice versa, pr. iteration. Resultaterne viser, at periferien temperatur receptor Gr28b.d mutanter opfører sig som kontrollen, som de bruger mere tid i den komfortable placering som temperaturen stiger. Men hjernen temperatur receptor TrpA1GAL4 mutanter er ikke påvirket af stigende temperaturer og ændre ikke deres placeringer i arenaen. Stigninger og fald i kurven for TrpA1GAL4 mutanter vise effekten i fluer, der sad allerede i den komfortable placering, før det blev komfortable og forblev der i denne fase. Konsekvens af toppe og dale af kurven for TrpA1GAL4 tyder på, at disse fluer forblev stadig for de fleste af eksperimentet; Derfor blev de konstant talt når deres placering var den betragtes som komfortable. Denne konklusion blev bekræftet ved visuel inspektion af de optagede videoer. Disse resultater støtte tidligere fysiologiske rapporter tyder på, at periferien opfattelse af hurtige og store ændringer ikke afhænger af Gr28b.d17 og der flyver besidder en vigtigste centrale mekanisme til forstand temperatur baseret på TrpA1 14,21.
Figur 1: Diagram over temperatur kontrolleret-arena. (A) en lateral udsigt af den temperatur-kontrolleret arena. En programmerbar kredsløb forbinder en power supply og temperatur sensorer til varmelegemer under kobber fliser til at styre deres temperatur. Fliser er konstant køles ned gennem en varmeveksler, der er tilsluttet en fan. En opvarmet aluminium ring, som et glas dække hviler omgiver fliser. (B) termisk imaging viser fliser på 24 ° C (øverst) og side fliser på 24 ° C med en midterste flise ved 30 ° C (nederst). (C) en ovenfra af arenaen. Et kamera registrerer kobber fliser, aluminium ring og røde lysdioder, så bestemmer automatisk eksperimentelle faser. En skærm i hjørnet af boksen, ikke optaget med kameraet, viser den aktuelle flise temperatur. (D) ring af lys: to varm hvid LED strips inde i en trækasse, der er omfattet af hvidbogen sikre konstant og symmetrisk belysning af hele arenaen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: fluer skal vænne til arenaen før du starter temperatur protokollen. (A) enkelt mandlige fluer blev introduceret til arenaen og lov til at udforske på en konstant 16 ° C i 1 min., hvorefter temperaturen begyndte stigende. (B) enkelt fluer udsat for 16 ° C, 20 ° C eller 24 ° C (ingen gruppe forskelle, to-vejs ANOVA F (2,570) = 4.156, p = 0.162) har en højere bevægelse i begyndelsen af eksperimentet end efter 5 min (to-vejs RM ANOVA F (9,570) = 7.803, p < 0,0001). Data er middelværdien og standardafvigelsen på middelværdien (± SEM) af 20 jomfru kvindelige fluer 5 til 7 dage gamle testet over flere dage. Stjerne angiver signifikant forskel mellem grupper (*** p < 0,0001; Tukey's flere sammenligning test, p = 0,05). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Bevægelse af 5 Drosophila arter udsat for gradvist stigende temperaturer. Enkelte mand flyver fra tempererede (blå), tropisk (rød), og kosmopolitiske (brun) Drosophila arter blev udsat for en stigende temperaturgradient (2 ° C hvert 60 s) mellem 16 og 46 ° C. De første 7 min var konstant på 22 ° C til at tillade fluer til at udforske arenaen. Arter var signifikant forskellig (to-vejs RM ANAVA F(4,70) = 28.46, p < 0,001). (a) D. melanogaster (brun; fyldt cirkler) var hurtigere når introduceret til arenaen. (b) D. yakuba (rød; tomme pladser) var hurtigere som temperaturen steg. (c) D. suzukii (brun fyldt firkantet) var langsommere end andre kosmopolitiske fluer på sin maksimale ydeevne punkt. (d) D. simulans (brun, tomme cirkler) var i forfald på det højeste punkt af D. melanogaster. Hvert punkt repræsenterer middelværdien (± SEM) af 15 mandlige fluer 5 til 7 dage gamle testet over flere dage. Betydning fremgår af symboler (♦ = forskel fra alle, p < 0,0001; † = forskel fra alle undtagen D. melanogaster, p < 0,0001; • = forskel fra D. melanogaster, p < 0,01; ¢ = forskel fra D. melanogaster, p < 0,001; = forskellen mellem navngivne grupper, p < 0,0001; Tukey's flere sammenligning test, p = 0,05). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: den temperatur-kontrolleret arena kan bruges til operant betingning. D. melanogaster Canton-S stamme (vildtype; sort kant) og dnc1 (tumpe, rød kant) mutanter var uddannet til at foretrække en lateral flise ved 22 ° C efter opvarmning i midten og overfor laterale fliser til 40 ° C i 4 min (uddannelse, ikke mønster). Hukommelse af de opvarmede områder er derefter testet ved at indstille alle fliser til 22 ° C (test; gittermønster). Fluer var betinget at foretrækker fliser til venstre i halvdelen af eksperimenterne, så fliser til højre i anden halvdelen. Procentdelen af den samlede tid inde i flisen ved 22 ° C under træning og testning blev målt til at sammenligne forestillinger. Grupperne var signifikant forskellig (en-vejs ANOVA F(3,76) = 23,23, p < 0,0001), med tumpe udfører værre end vildtype samlet. Data er gennemsnit (± SEM) af 20 jomfru kvindelige fluer 5 til 7 dage gamle testet over flere dage. Stjerner angiver betydning forskellen blandt grupper (*** p > 0,0001; *** p > 0.001; ** p > 0,01; Tukey's flere sammenligning test, p = 0,05) venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: reaktion på temperatur mutanter stigende temperatur, når en behagelig placering. Temperatur mutanter Gr28b.d (grøn; kvadrater) reagere som kontrolelementer (w1118, sort, cirkler) ved at øge procentdelen af tiden i den komfortable område som temperaturstigninger (to-vejs RM ANOVA F (1,38) = 0.5107, p = 0.479). TrpA1GAL4 mutanter (gul, trekanter) er forskellig fra kontrollen (w1118, sort), som de ikke forøger tid i den komfortable område som temperaturstigninger (to-vejs RM ANOVA F (1,38) = 1.670, p = 0.019). Data er gennemsnit (± SEM) af 20 mandlige fluer 5 til 7 dage gamle testet over flere dage. TrpA1GAL4 er væsentligt forskellige fra Gr28b.d og kontrol (p < 0,05; Tukey's flere sammenligning test, p = 0,05). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi præsenteret en automatiseret temperaturregulerede arena (figur 1) der producerer præcise temperaturændringer i tid og rum. Denne metode giver mulighed for eksponering af individuelle Drosophila ikke kun forprogrammerede gradvise stigninger i temperaturen (figur 2 og figur 3), men også dynamisk temperatur udfordringer, hvor hver flise af flyve arena blev opvarmet uafhængigt af hinanden til en anden temperatur (figur 4 og figur 5).
Den temperatur-kontrolleret arena bruger en innovativ tilgang til den varme proces. I stedet for at producere temperaturændringer i fliser gennem termoelektrisk Peltier varmeelementer anvendes i traditionelle metoder, temperatur-kontrolleret arena bruger nuværende for at varme op en kobber masse med kobber fliser, og fluer er placeret øverst. Kobber massen er konstant køles af en køleplade blok forbundet til fan. Peltier-lignende elementer bruges til at opretholde den ønskede temperatur af kobber massen, når det har været varmet. Fordi disse elementer ikke er den vigtigste temperatur generatorer, lider de mindre stress, som forlænger deres levetid og tillader hurtigere temperaturændringer. En programmerbar kredsløb, der modtager feedback fra temperatursensorer under hver af de kobber flise, som kan også aktivere lav spænding strømforsyning, koordinerer den varme mekanisme. Forskere kan angive Hvornår og hvor temperaturændringer opstår og bestemme intensitet og retning af sådanne ændringer. Desuden tillader kobling metoden med specialiserede tracking software, såsom FlySteps, analyse af alle aspekter vedrørende Drosophilas bevægelse, såsom den generelle hastighed på bestemte temperaturer eller tid tilbragt i visse steder ( Figur 2, figur 3, figur 4, figur 5). Ikke desto mindre skal alle resultater overveje karakteristika iboende at flyve adfærd, der kan påvirke deres bevægelse. For eksempel, hvis fluer ikke er tilladt at udforske arenaen og bilægge før du ændrer temperaturen, hastighedsmålinger kan være kunstigt høje (figur 2). Fluer kan også efterlade duftstoffer, der påvirker efterfølgende fluer; Derfor, glas dækning skal rengøres, og tape der dækker fliserne skal ændres mellem fag. Eftersom at locomotion falder som fluer alder26, er det vigtigt at fluerne er standardiseret for alder at undgå variation i resultaterne. I vores arena, har fluer også vist centrophobism, foretrækker kanter over det midterste område. Eksperimentatorer skal kontrollere dette ved at ændre placeringen af behagelige områder for at forhindre overvurderer site præference.
De nuværende Karakteristik af arenaen og krav af tracking-processen kunne begrænse nogle eksperimentelle procedurer. For eksempel, omfatter tæt miljø af arenaen ikke adgangspunkter hvorigennem lugt kunne indføres, som forhindrer undersøgelser, hvor denne stimulus er vigtigt. Ligeledes nødvendiggør FlyStepts tracker videoer med ensartet baggrunde, som begrænser muligheden for tilføje fødevarer eller andre varer til den flue miljø. Arena kunne tilpasses for at inkludere en forbindelse til en gas ventil, og software udvikling findes der kan give mulighed for flere objekter til at være til stede. Fremtidige projekter kan drage fordel af disse muligheder for at tilpasse sig den temperatur-kontrolleret arena til specifikke eksperimentelle behov.
Endelig, vi har vist i de resultater, forskellige arter af Drosophila udføre forskelligt som temperaturen stiger (figur 3), og at temperaturen mutanter reagerer ikke på samme måde som kontroller (figur 5). Dette viser, at denne nye metode kan bruges til at udforske Drosophilas termiske adfærd og hvordan det påvirkes af naturlig udvælgelse og funktionelle kendetegn. Endelig, det illustrerer at vores metode kan hjælpe yderligere forståelse af termisk tilpasning og typebestemmelse samt temperatur receptorer interaktioner med andre stimuli i fremtidige undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet i en del af et legat fra Adfærdspåvirkninger og kognitiv neurovidenskab Program af Groningen Universitet og et graduate stipendium fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) fra Mexico, ydes til Andrea Soto-Padilla, og en bevilling fra John Templeton Foundation for studiet af tid tildeles Hedderik van Rijn og Jean-Christophe Billeter. Vi er også taknemmelige til Peter Gerrit Bosma for sin deltagelse i udviklingen af FlySteps bane.
Scripts TemperaturePhases, FlySteps, og FlyStepAnalysis kan findes som supplerende oplysninger og i de følgende midlertidige og offentligt tilgængelige link:
https://dataverse.nl/privateurl.XHTML?token=c70159ad-4d92-443d-8946-974140d2cb78
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arduino Due | Arduino | A000062 | Software RUG |
| Electronics Board | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-Main-02-2014 | |
| Power supply Boost | XP-Power 48. V 65 W | ECS65US48 | Set to 53 Volt |
| Power supply Tile Heating | XP-Power 15. V 80 W | VFT80US15 | |
| Power supply Cooling | XP-Power 15. V 130 W | ECS130U515 | |
| Peltier elements | Marlow Industries | RC12-4 | 2 Elements, controlled DC feed |
| Heat sink | Fisher Technik | LA 9/150-230V | Decoupled for vibration |
| Temperature sensors | Measurement Specialties | MCD_10K3MCD1 | Micro Thermistor Probe |
| Copper block/tiles | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-CB-01-2014 | |
| Auminum ring | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-RoF-02-2015 | |
| Tesa 4104 white tape 25 x 66 mm | RS Components | 111-2300 | White conductive tape |
| Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
| Warm white LED strip | Ledstripkoning | HQ-3528-SMD | 60 LEDs per meter |
| Switch Power Supply | Generic | T-36-12 | |
| Logitech c920 | Logitech Europe S.A | PN960-001055 | |
| QuickTime Player | Apple Computer | Recording program | |
| Tracking analysis software | R | Packages: pacman | |
| Tracking analysis software | MATLAB | ||
| Thermal Imaging | FLIR T400sc | ||
| Graphs and Statisticts Software | Graph Pad Prism | ||
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | Siliconising agent |
| Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
| Flypad | Flystuff | 59-114 | |
| Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25x95 mm |
| Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
| Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
| Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
| Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
| Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
| Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
| Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
| Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
| Molasses | Flystuff | 62-117 | |
| Active dry yeast | Red Star | ||
| Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
References
- Abram, P. K., Boivin, G., Moiroux, J., Brodeur, J. Behavioural effects of temperature on ectothermic animals unifying thermal physiology and behavioural plasticity. bioRxiv. , (2016).
- Rajpurohit, S., Schmidt, P. S. Measuring thermal behavior in smaller insects: A case study in Drosophila melanogaster demonstrates effects of sex, geographic origin, and rearing temperature on adult behavior. Fly. 10 (4), 149-161 (2016).
- Jezovit, J. A., Levine, J. D., Schneider, J. Phylogeny environment and sexual communication across the Drosophila genus. The Journal of Experimental Biology. 220 (1), 42-52 (2017).
- Sinclair, B. J., Williams, C. M., Terblanche, J. S. Variation in Thermal Performance among Insect Populations. Physiological and Biochemical Zoology. 85 (6), 594-606 (2012).
- Gibert, P., Huey, R., Gilchrist, G. Locomotor performance of Drosophila melanogaster: Interactions among developmental and adult temperautures, age, and geography. Evolution. 55 (1), 205-209 (2001).
- Trotta, V., et al. Thermal plasticity in Drosophila melanogaster: A comparison of geographic populations. BMC Evolutionary Biology. 6, 1-13 (2006).
- Klepsatel, P., Gálikova, M., De Maio, N., Huber, C. D., Christian, S., Flatt, T. Variation in thermal performance and reaction norms among populations of Drosophila melanogaster. Evolution. 67 (12), 3573-3587 (2013).
- Latimer, C. A. L., Wilson, R. S., Chenoweth, S. F. Quantitative genetic variation for thermal performance curves within and among natural populations of Drosophila serrata. Journal of Evolutionary Biology. 24, 965-975 (2011).
- Chen, J., Nolte, V., Schlotterer, C. Temperature-related reaction norms of gene expression: Regulatory architecture and functional implications. Molecular Biology and Evolution. , (2015).
- Kellermann, V., Overgaard, J., Hoffmann, A. A., Flojgaard, C., Svenning, J. -C., Loeschcke, V. Upper thermal limits of Drosophila are linked to species distributions and strongly constrained phylogenetically. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16228-16233 (2012).
- Andersen, J. L., Manenti, T., Sørensen, J. G., Macmillan, H. A., Loeschcke, V., Overgaard, J. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
- Krstevska, B., Hoffmann, A. A. The effects of acclimation and rearing conditions on the response of tropical and temperate populations of Drosophila melanogaster and D. simulans to a temperature gradient (Diptera: Drosophilidae). Journal of Insect Behavior. 7 (3), 279-288 (1994).
- Frank, D. D., Jouandet, G. C., Kearney, P. J., Macpherson, L. J., Gallio, M. Temperature representation in the Drosophila brain. Nature. 519 (7543), 358-361 (2015).
- Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. The coding of temperature in the Drosophila brain. Cell. 144 (4), 614-624 (2011).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
- Ni, L., et al. A gustatory receptor paralogue controls rapid warmth avoidance in Drosophila. Nature. 500 (7464), 580-584 (2013).
- Liu, W. W., Mazor, O., Wilson, R. I.
- Neely, G. G., et al. TrpA1 Regulates Thermal Nociception in Drosophila. Public Library of Science ONE. 6 (8), e24343 (2011).
- Zhong, L., et al. Thermosensory and non-thermosensory isoforms of Drosophila melanogaster TRPA1 reveal heat sensor domains of a thermoTRP channel. Cell Reports. 1 (1), 43-55 (2012).
- Barbagallo, B., Garrity, P. A. Temperature sensation in Drosophila. Current Opinion in Neurobiology. 34, 8-13 (2015).
- Tang, X., Platt, M. D., Lagnese, C. M., Leslie, J. R., Hamada, F. N. Temperature integration at the AC thermosensory neurons in Drosophila. Journal of Neuroscience. 33 (3), 894-901 (2013).
- Petavy, G., David, J. R., Gibert, P., Moreteau, B. Viability and rate of development at different temperatures in Drosophila: A comparison of constant and alternating thermal regimes. Journal of Thermal Biology. 26 (1), 29-39 (2001).
- Diegelmann, S., Zars, M., Zars, T. Genetic dissociation of acquisition and memory strength in the heat-box spatial learning paradigm in Drosophila. Learning & Memory. 13 (1), 72-83 (2006).
- Zars, M., Zars, T. High and low temperatures have unequal reinforcing properties in Drosophila spatial learning. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 192 (7), 727-735 (2006).
- Zars, T., Wolf, R., Davis, R., Heisenberg, M. Tissue-specific expression of a type I adenylyl cyclase rescues the rutabaga mutant memory defect: in search of the engram. Learning & Memory. 7 (1), Cold Spring Harbor, NY. 18-31 (2000).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Brain Research. 46 (5), 320-325 (2011).
