Summary
Her vises en arbeidsflyt for kultur og gene expression analyse av endotelceller under væske skjæring stress. Inkludert er en fysisk arrangement for boliger og overvåke flere flyt kamre i et kontrollert miljø og bruk av en ytre referanse for kvantitative PCR samtidig.
Abstract
Vi beskriver en arbeidsflyt for analyse av genuttrykk fra endotelceller underlagt en jevn laminær strømning med flere overvåkede parallell-plate flyt kamre. Endotelceller form den indre mobilnettet foring av blodkar og kronisk utsettes friksjons styrken av blodstrøm kalt skjæring stress. Under fysiologiske forhold, endotelceller funksjon i nærvær av ulike skjæring stress forhold. Dermed kan programmet av skjæring stress i vitro modeller gir bedre innsikt i endothelial svar i vivo. Parallell-plate flow chamber tidligere publisert av Lane et al. 9 er tilpasset å studere endothelial genet regulering i tilstedeværelse og fravær av jevn (ikke-pulsatile) laminær strømning. Nøkkel tilpasninger i oppsettet for laminær strømning som presenteres her inkluderer et stort, dedikert miljø til huset samtidige flyt kretser, overvåking av strømningshastigheter i sanntid, og inkludering av en ytre referanse RNA for normalisering av kvantitativ PCR sanntidsdata. For å vurdere flere behandlinger/forhold med anvendelse av skjæring stress, brukes flere flyt kretser og pumper samtidig i samme oppvarmet og fuktet inkubator. Inntakets hver flyt krets måles kontinuerlig i sanntid å standardisere skjæring stress forhold gjennom eksperimenter. Fordi disse eksperimentene har flere betingelser, bruke vi også en ytre referanse RNA som er tilsatt ved RNA utvinning for normalisering av RNA utvinning og første-strand cDNA syntese effektivitet. Følgende minimere variasjon mellom eksempler. Denne strategien brukes i våre rørledning for gene expression analyse med skjæring stress eksperimenter med parallell-plate flow chamber, men deler av denne strategien, som den ytre referanse RNA spike-i, enkelt og kostnadseffektivt brukes til andre programmer.
Introduction
Vaskulær endotelceller danner den indre mobilnettet foring av blodårer i lukket hjerte-karsystemet høyere arter. De danner grensesnittet mellom blod og vev og er preget av luminal og abluminal flater. Endotelet er et mangfoldig, aktiv og dynamisk system som regulerer blodstrømmen, Nærings smugling, immunitet og veksten av nytt blod fartøy1. I kroppen eksistere endotelceller normalt i et miljø der de er utsatt for sirkulasjon, skjæring stress2friksjons kraft. Skjæring stress er en viktig regulator av endothelial celle gene expression3endotelceller forsøke å opprettholde skjæring stress i et gitt celleområde2,4. Endotelceller demonstrere angiogenic mønstre i fravær av skjæring stress5 som kan forbedre vevsperfusjon. Regionale mønstre av forstyrret flyten og endret skjæring stress er tilknyttet uttrykk for inflammatoriske gener6 og utvikling av aterosklerose7,8. Dermed er modeller som inkluderer skjæring stress en viktig komponent i forståelse endothelial genet regulering.
Vi beskriver en metode for å studere genet regulering i vaskulær endotelceller under skjæring stress. Dette systemet bruker ikke-pulsatile flyt og etterligner flytende skjær stressnivå og oksygen konsentrasjon som modell betingelser for arteriell endotelceller. Denne protokollen inneholder opplysninger av genet knockdown ved hjelp av RNA-interferens (RNAi), satt opp for anvendelse av skjæring stress med parallell-plate flyt apparater og metoder for topp i en ytre referanse RNA før analyse av revers transkriptase kvantitative polymerasekjedereaksjons (RT-qPCR). Denne rørledningen brukes for å studere genet regulering i endotelceller i tilstedeværelse og fravær av laminær skjæring stress og inkluderer en tilpasning av parallell-plate flyt apparatet beskrevet av Lane et al. 9. dette bestemt oppsettet ble utformet for å lette samtidig vurdering av flere eksperimentelle forhold som tillater direkte sammenligning av skjæring stress og normalisering av RNA analyse. En stor oppvarmet enhet med kontrollert fuktighet benyttes for å tillate flere separate flyt kamre og pumper kjører samtidig med strømningshastigheter overvåkes for hver flow chamber montering i sanntid. Anvendelse av dette oppsettet brukes for genet knockdown bruker RNAi i innstillingen for laminær strømning/skjæring stress, men aspekter av denne protokollen kan brukes på noen vurdering av RNA uttrykk.
Felles tilnærminger til anvendelsen av skjæring stress for endotelceller inkluderer microfluidic systemer10, en kjegle-og-plate viscometer11og en parallell-plate flow chamber12. Microfluidic systemer fra forskjellige produsenter har vært nyttig i mechanobiology og mechanotransduction i flere cellen og vev typer og en rekke Biofysiske stimuli. Endotelceller, har de blitt pleide å studere endotelceller i isolasjon, samt samspillet av endotelceller og smugling av immun eller tumor celler10. Disse systemene er imidlertid mindre egnet for gjenvinning av store antall celler9. Både kjegle-og-plate viscometer og parallell-plate flyt kamre tillater utvinning av store antall celler i confluent monolayers12. Disse systemene kan generere en rekke skjær krefter og mønstre12. Parallell-plate flyt kammer forsamling9 har fordelen at sanntid bildebehandling kan utføres gjennom glasset vinduet evaluere mobilnettet morfologi til enhver tid. Videre kan perfusate samles under sterile forhold. For systemet presenteres her, kan også strømmen overvåkes i sanntid og en multi kammer opp. det forenkler vedlikehold av skjær forhold mellom kamre.
Representant eksperimenter, menneskelige umbilical blodåre endotelceller (HUVEC), som representerer en macrovascular endothelial celle type, brukes, og skjæring stress forholdene vi bruker (1 Pa) gjenspeiler arteriell forhold (0,1 - 0,7 Pa). Men denne protokollen kan brukes med andre endothelial celle, og skjæring stress betingelsene justeres etter eksperimentelle spørsmålet. For eksempel evalueringen av menneskelig endotelceller i forhold som modell venøs sirkulasjon ville kreve lavere nivåer av skjæring stress (1-6 Pa) og studier som modell mikrovaskulær sirkulasjon har utnyttet skjæring stress nivåer av 0.4 - 1.2 Pa13 , 14. I tillegg skjæring stress kan variere mellom endotelceller i samme blodåre6. En enkel avlytting system brukes i det gjeldende oppsettet, som samtidig kan overvåke fire separate flyt sløyfer. For labs trenger mer flyt looper, er det plass i et dedikert miljø for en ekstra overvåkingssystem.
RT-qPCR brukes for absolutt kvantifisering av genuttrykk i innstillingen av skjæring stress. Relativ uttrykket av målet gener brukes ofte sammenligne RNA uttrykk i vilkårene. Noen RNA arter kan finnes på svært små mengder eller være fraværende, dermed kompliserer relative mål. For eksempel utøver lang noncoding RNAs i endotelceller potente effekter på relativt lav kopi tall per celle5. I tillegg kan forskjeller i primer-effektivitet føre til en feilaktig tolkning bruker metoden delta-deltaet syklus terskelen (Ct) til å analysere dataene. For å møte denne bekymringen, utfører vi absolutt kvantifisering ved å generere en standard kurve ved hjelp av en kjent mengde plasmider DNA. Videre komplementære DNA (cDNA)-syntese er en ineffektiv prosess, og forskjellene i cDNA effektivitet kan hensyn til forskjeller i RNA uttrykk mellom forhold og mellom prøver15. Anvendelsen av skjæring stress og/eller hva reagenser kan påvirke celle spredning og apoptose levedyktighet, eller legge til komponenter som kan forstyrre RNA isolasjon og/eller cDNA syntese. Kontoen for muligheten for bias fra RNA isolasjon og cDNA syntese, bruker vi en spiker i RNA kontroll syntetisert i laboratoriet lagt ved RNA utvinning og målt med hver cDNA syntese via RT-qPCR. Dette gjør ikke bare justeringen for tekniske forskjeller i RNA utvinning og cDNA syntese, men kan også beregningen av absolutt antall per celle, når celletall er kjent.
Dette systemet bruker ekstra trinn å opprettholde likhet eller hensyn til tekniske forskjeller mellom forhold. Vi vektlegger spesielt følgende på grunn av den komplekse naturen av disse eksperimentene, som involverer flere fysiske set-ups og eksperimentelle forhold som kan føre til eksperimentelle variasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utarbeidelse av eksogene referanse RNA
Merk: Velge en eksogene referanse RNA som ikke finnes i arter eller modell av interesse. For pattedyr systemer, kan firefly luciferase RNA brukes.
-
Linearization av eksogene referanse RNA plasmider
- Forberede eksogene referanse RNA minst 48 timer før forventet RNA utvinning. Få eller produsere en cDNA klone av den valgte eksogene referansen RNA, for eksempel en firefly luciferase cDNA klone i en plasmider vektor passer i vitro transkripsjon (se Tabell for materiale).
- Utføre begrensning enzym (RE) fordøyelsen av 1 µg av full lengde plasmider (firefly luciferase plasmider er pSP-luc + som har 4100 bp) med enkelt-cutter RE (XhoI) i 1,5-mL microfuge rør. Velg en RE som en enkelt cutter (kutt plasmider bare 1 x) på 3 slutten av eksogene referansen RNA sekvens som lar en 5' overheng eller butte enden. En typisk forberedelse, utføre syv plasmider linearization reaksjoner (trinn 1.1.4 - 1.1.7) parallelt til å generere tilstrekkelig RNA konsentrasjon og antallet å fullføre ett sett av eksperimenter eller ett prosjekt.
- Måle plasmider konsentrasjonen med spectrophotometry eller spectrofluorometry.
- Forbered en RE blanding i hver retning: legge til 4 µL av XhoI (20 000 enheter/mL), 8 µL av RE buffer, x µL plasmider (1 µg) og tilstrekkelig H2O å nå en total løsning for 80 µL.
- Inkuber RE blandingen for 2 h på 37 ° C. Bruke RE etter produsentens protokollen, endringer kan resultere i økt star aktivitet eller uspesifisert spalting av målet DNA. Varme deaktivere reaksjonsblandingen etter 20 min på 65 ° C.
- Avslutte RE sammendraget med etanol nedbør i hver retning. RE miksen, direkte legge 4 µL av 0,5 M EDTA pH 8.0, 8 µL av 3 M natrium acetate pH 5.2 og 184 µL av 100% etanol. Bland godt og fryse blandingen på 20 ° C i 30 min.
- Nedspinning blandingen på 4 ° C etter 20 min på en relativ sentrifugalkraften (RCF) 16,100 x g.
- Fjerne nedbryting med fine tips, uten å berøre pellet. Air-Dry pellets for 5 min og resuspend det i 6 µL av H2O (oppvarmet til 37 ° C) av pipettering opp og ned 5 x - 10 x.
- Bekreft linearization av luciferase plasmider ved kjører fordøyd produktet på 2% agarose gel inneholder ethidium bromide (EtBr) sammen med en 1 kb + stige, supercoiled stige, og kutt og uklippet plasmider. Inspisere gel og videre til i vitro transkripsjon hvis kjørefelt for kutt plasmider viser et enkelt band for ~ 4 kb (uncut plasmider har tre bånd. Figur 1).
FORSIKTIG: EtBr er kreftfremkallende. Arbeid i kjemisk avtrekksvifte.
-
I vitro transkripsjon av eksogene referanse RNA plasmider
- Hver tube fordøyd plasmider produkter, utføre i vitro transkripsjon bruker en i vitro transkripsjon metode (se Tabell for materiale). Følg instruksjonene fra produsenten og bruk den riktige phage RNA polymerase. Hvis den cDNA syntese krever en poly(A) hale, eller andre programmer krever en poly(A) hale, Velg en metode i vitro transkripsjon som inkluderer en poly(A) halen tillegg (se Tabell for materiale).
- Kombinere alle i vitro transkribert produkter inn i et enkelt 1.5-mL polypropylen rør før rensing.
-
Purif ication av RNA i vitro transkripsjon reaksjonen
- Rense i vitro transkribert produkter med en i vitro transkripsjon oppryddingen kit (se Tabell for materiale). Følg produsentens protokollen.
- Vurdere RNA konsentrasjonen av måler absorbans ved 260 nm ved hjelp av spectrophotometry.
Merk: RNA konsentrasjon beregnes ved hjelp av Beer-Lambert lov. Dette sier at absorbansen av nukleinsyrer (som absorberer lys sterkt på 260 nm) er proporsjonal med konsentrasjonen. En absorbansen 1,0 tilsvarer 40 µg/mL av enkelt-strandet.
-
Aliquoting lager RNA i PCR rør for eksperimentell bruk
- Kontroller RNA konsentrasjonen er 1 µg/µL.
- Hvis RNA konsentrasjonen > 1 µg/µL, fortynne sluttvederlag til 1 µg / µL. Aliquot 1 µL i PCR rør og lagre dem på-80 ° C.
- Hvis RNA konsentrasjonen er < 1 µg/µL, utføres mer nedbør med 5 M ammonium acetate (forutsatt i kit) etter produsentens protokollen. Hvis RNA konsentrasjonen er fortsatt < 1 µg/µL, fortsette med aliquoting 1 µL inn PCR rørene.
- Kontroller RNA konsentrasjonen er 1 µg/µL.
2. Skyv belegg
Merk: Trinn 2.1-2.10 skal utføres 24-48 h før forventet celle seeding.
- Forvarm ovnen til 250 ° C.
- Bruker sterilt hansker, vikle hver glass lysbilde 2 x med aluminiumsfolie. Unngå å berøre overflaten av lysbildet direkte.
- Stekes lysbildene i ovnen i 1 time ved 250 ° C og la lysbildene avkjøles til romtemperatur.
Merk: Dette trinnet er viktig for å ødelegge noen skadelige endotoxin. - Mens lysbildene avkjøling, lage en fibronectin lager løsning av 1 mg/mL med destillert vann og ruge det i 30 min på 37 ° C å oppløse. Gjøre 100 µL dele. Avsatt dele for umiddelbar bruk og fryse de gjenværende dele for fremtidig bruk.
- Pakk den ytre dekket med aluminiumsfolie før du setter av objektglass i en biosafety kabinett. Utføre trinn 2.6-2.7 og 2.9 i biosikkerhet kabinett.
- Plass av objektglass i et sterilt rektangulære 4-vel celle kultur parabol.
- Fortynn fibronectin lager løsning 1: 100 med destillert vann. Coat hvert lysbilde med 1 mL av fortynnet fibronectin, dråpe for dråpe, bruker en pipette. Kontroller at hele lysbildet er dekket.
- Inkuber lysbildene i en vev kultur inkubator på 37 ° C 24-48 h.
- Etter inkubasjon, Sug opp fibronectin ved å vippe 4-vel celle kultur parabolen. Unngå å berøre lysbildet direkte med aspirator.
3. celle Seeding på Glass lysbilder
- Telle menneskelige endotelceller på tidlig passage (passasje 2-5), og frø ~1.0 x 106 celler på hver fibronectin-belagt objektglass med 1 mL av media (1.0 x 106 celler/mL media). Frø cellene 24 timer før den etterlengtede laminær strømning hvis ingen annen behandling utføres.
Merk: Disse tallene brukes som en guide for eksperimenter med 24 h flyt.- Justere seeding tetthet for å oppnå en confluent monolayer av celler på cellen høsting og RNA utvinning.
- La cellene overholder lysbildet i 15 min på 37 ° C.
- Legg 3 mL media i hver brønn av celle kultur retten å dekke lysbildet, og ruge cellene på 37 ° C i 24 timer med 5% CO2.
4. liten påvirkes RNA (siRNA) hva
-
Utarbeidelse av celler på glass lysbilder for siRNA transfection og flyt eksperimenter
- Følg protokollen i trinn 2 (lysbildet belegg) og 3 (celle seeding på glass lysbilder) for glass lysbilde forberedelse og belegg for flyt eksperimenter.
- Frø cellene 24 timer før siRNA behandling (48 timer før den laminær strømning).
- Frø menneskelige endotelceller i antibiotika-frie medier på 750 000 til 1 x 106 celler per lysbilde å oppnå 85-95% samløpet neste dag.
Merk: HUVEC er brukt i denne protokollen.
-
Utarbeidelse av siRNA-lipid-baserte transfection reagens komplekser (per lysbilde)
- Utforme egendefinerte siRNAs eller Bestill forhåndslagde siRNAs for ønsket genet av interesse.
Merk: Utføre følgende i en biosafety kabinett. - Legge til 6 µL av siRNA (20 µM stock) i 414 µL av redusert serum medium (se Tabell for materiale) og bland forsiktig av pipettering.
- Fortynn 49,5 µL av forsiktig blandet lipid-baserte transfection reagensen (se Tabell for materiale) i 130.5 µL av redusert serum medium.
- Bland forsiktig og ruge ved romtemperatur for 5 min.
- Kombinere utvannet siRNAs og lipid-baserte transfection reagens, bland forsiktig og ruge i 15 min ved romtemperatur. Bland forsiktig for å unngå forstyrrelser i lipid-baserte transfection reagens komplekser.
Merk: Løsningen kan vises skyet som komplekser. - Mens komplekser er forming, fjerne vekstmediet og vask cellene 1 x med redusert serum medium.
- Legge til 2,4 mL av redusert serum medium i hvert lysbilde.
- Legg til 600 µL av forsiktig blandet siRNA-lipid-baserte transfection reagens komplekser hver plate, og rock platen og tilbake til mix. Sikre den endelige konsentrasjonen av siRNA er 40 nM. Kontroller at lysbildet er helt dekket.
- Inkuber cellene på 37 ° C 4 h.
- Legg 1 mL av antibiotika-fri endothelial celle vekst medier som inneholder 3 x vanlig konsentrasjonen av fetal bovin serum (FBS) uten å fjerne transfection blanding.
- Inkuber cellene på 37 ° C til klar til bruk.
- Utforme egendefinerte siRNAs eller Bestill forhåndslagde siRNAs for ønsket genet av interesse.
5. beregning av Flow Rate basert på ønsket skjæring Stress9
- Beregne infusjonshastigheten basert på ønsket skjær stress i henhold til denne formelen:
her
Q er infusjonshastigheten i mL/min;
Τ er ønsket skjær stress i det tilsvarer en Newton/cm2 (1 Pa = 10 dynes/cm2);
w er bredden på parallell-plate flyt kammeret i cm;
h er høyden av parallell-plate flow chamber i cm;
µ er viskositeten av media i cP (g/cm·s).
Merk: Typisk laminær skjæring stress eksperimenter (ikke-pulsatile) i denne arbeidsflyten er gjennomført på τ = 1 Pa (10 dynes/cm2). µ kan måles ved hjelp av en viscometer som en kjegle-og-plate viscometer og kan variere avhengig av innholdet i media inkludert serum og ekstra dekstran9. - For å oppnå en bestemt τ (skjæring stress), kan du justere infusjonshastigheten og/eller viskositet. På høyere flyt priser, kan tilhenger celler dissociate fra lysbildet. Flyt samplingsfrekvenser med typiske flyt kamre er vist i tabell 1.
6. oppsett av et dedikert miljø for overvåking System og flere parallell-plate flyt Chambers (figur 2)
- Bruk et stort oppvarmet enhet/inkubator med flere hyller, interne elektrisitet tilgang og glassdører-referert til som stranden (innebygde miljø med justerbar CO2 ) og varme-å huse flere flyt kamrene samtidig i eksperimenter som kreve både skjæring stress og direkte sammenligning mellom to eller flere behandlinger eller utganger (dvs., DNA, RNA og protein).
Merk: Stranden gir hyppige overvåking av strøm krets, inkludert infusjonshastigheten, uten hyppige avbrudd av miljøet. - Sikre tilstrekkelig CO2 er tilgjengelig for eksperimentet og at CO2 skjerm er funksjonelle. Sikre vann skuffen fylles riktig, slik at det blir fuktet luft.
7. oppsett av parallell-plate flyt apparater
Merk: For produksjon av parallelle plater, se Lane et al. 9.
- Autoclave flyten kammer plater, reservoaret, avdemping, rør og Luers for hver parallell-plate flow chamber oppsett som vist i tabell 2.
-
Oppsett av flyt loop (figur 3).
- Plass sterilt håndklær i biologisk sikkerhet regjering. Samle flyt loop systemet, først uten parallell-plate flyt kammeret, i biologiske sikkerhetskabinett kabinettet.
- Koble rør forsamlingen for reservoaret:
- Sett inn et #14 vanskelig rør i ett hull og to #14 myk rør inn i andre to hullene i hetten flyt reservoaret. Sørg for at en av de myke rørene berører bunnen av reservoaret som ut slangen.
- Plasser en 1/16" mannlige Luer på slutten av #14 vanskelig rør og knytte et sterilt filter som en ventilasjonen.
- Plasser en 1/16" kvinnelige Luer på slutten av #14 myk tilsig rør, kommer fra reservoaret og fest en 4-veis stopcock.
Merk: Gene expression analyse eller andre studier hvor perfusates trenger ikke være samlet, 2-veis stopcocks kan brukes i stedet for 4-veis stopcocks i denne protokollen. - Plasser en 1/16" mannlige Luer på slutten av #14 myk utløp røret, kommer fra reservoaret.
- Koble reservoaret ut slangen til pumpen rør: Plasser en 1/16" kvinnelige Luer i hver ende av en #13 vanskelig tube (pumpe rør). Koble #14 myk utløp røret fra reservoaret til #13 vanskelig røret ved å koble 1/16" mannlige og kvinnelige Luers sammen.
- Koble pumpen slangen med "avdemping bro" rør: Plasser en 1/8†mannlige Luer og en 1/8†kvinnelige Luer i hver ende av en #16 bløt rør. Koble 1/16" kvinnelige Luer #13 hard-rør (etter utløp pumpe slangen) med 1/8†mannlige Luer av #16 myk røret.
- Montere rør for flyt avdemping: Plasser en 3/16" mannlige Luer i enden av #25 myk slangen og gjenta dette i den andre siden av flyt avdemping. Fest de ledige endene på #25 myk rørene på hver side av flyt avdemping.
- Koble "avdemping bro" slangen med rør for flyt avdemping: koble en #25 bløt rør fra flyt dampener med #16 myk tube "avdemping bro" bruker 1/8†kvinnelige Luer fra #16 "avdemping bro" side og det allerede plassert 3/16" mannlige Luer fra #25 myk avdemping rør side.
- Montere "kammer bro" rør:
- Plasser en 1/8†kvinnelige Luer og en 1/8†mannlige Luer i hver ende av en #16 bløt rør ("kammer bro" rør).
- Koble 1/8†kvinnelige Luer av "kammer bro" med 3/16" mannlige Luer på #25 bløt rør fra gratis slutten av flyt avdemping.
- På 1/8†mannlige Luer (gratis slutten) av "kammer bro" forbindelsesslangen, plassere en 4-veis stopcock.
- Koble 4-veis stopcock fra "kammer bro" gratis slutten til 4-veis stopcock fra reservoaret tilsig myk slangen (fra trinn 7.2.2.3). Lukk stopcocks.
- Legge til medier i reservoaret og avdemping. For 48-h eksponering å ta stress, legge til 35 mL av media i reservoaret og 25 mL til avdemping. Juster volumet av media basert på varigheten av flyt eksperimentet og antall celler seeded.
- Bringe det sammensatte løkke med systemet pumpen i stranden. Sett #13 vanskelig røret (pumpe rør) inn i pumpen hodet og sikre den. Åpne stopcocks.
- Slå på pumpen og sakte øke pumpen fart. La media sirkulere gjennom løkken systemet. Kontroller for lekkasje eller blokkering (f.eks, press oppbygging). Kontroller at media strømmer tilbake til reservoaret.
-
Oppsett av flyt kammer
- Plasser en 1/8†kvinnelige Luer i enden av en #16 myk rør og fest en 4-veis stopcock. Fest gratis slutten av røret til høyre side av den øverste platen (tilsig siden).
- Plasser en 1/8†mannlige Luer i enden av en #16 myk rør og fest en 4-veis stopcock. Fest gratis slutten av røret på venstre side av topp-platen (utløp -siden).
- Plasser en 1/8†mannlige Luer og en 1/8†kvinnelige Luer i hver ende av en bløt rør #16 (boble felle rør). Fest slangen til boble felle via 1/8†mannlige Luer. Knytte en 4-veis stopcock til den andre enden av den rør via 1/8†kvinnelige Luer.
- Ved hjelp av sterile pinsett, overføre av celle-seeded objektglass fra 4-vel celle kultur parabol til fordypningen på bunnplaten. Sikre celle-seeded siden av av objektglass vender.
- Bruker en 10 mL sprøyte, legge til 10 mL av varm media bunnplaten i rød pakning linjen rundt tallerkenen. Kan media å strømme gjennom lysbildet og dekker cellene. Unngå å legge medier direkte på lysbildet.
- Forsiktig plassere topplate på den nederste platen, justere fra den ene til den andre. Unngå innføring av luftbobler. Skru plater sammen tett.
- Fjerne luftbobler fra boble fellen ved å åpne stopcock på høyre side (tilsig) av platen og mildt rødme 20 mL av varm media bruker en 30-mL sprøyte. Kontroller stopcock til venstre (strøm) av platen er lukket og at media strømmer gjennom boble felle stopcock (åpne). Kast spyles media.
- Lukk stopcock på boble fellen og åpne stopcock på venstre side (strøm) av kammeret. Heve til venstre (strøm) i kammeret til en vinkel på 45 grader og forsiktig flush 20 mL av varm media bruker en 30-mL sprøyte fra retten (tilsig) av kammer for å fjerne luftbobler fra kammeret. Bobler kan bli visualisert gjennom vinduet. Kast spyles media.
- Lukk stopcocks på begge sider av kammeret og cap. Inspisere cellene av mikroskopi.
- Transport kammeret til stranden med tidligere montert loop system.
- Sakte redusere pumpen fart og pause pumpen. Lukk stopcocks på flyt loop system å forhindre lekkasje.
- Koble chamber og loop system sammen via stopcocks. Åpne alle stopcocks.
- Sakte øke pumpen fart og undersøke oppsettet for lekkasje eller blokkering. Sikre media sirkulerer i én retning og returnerer til reservoaret.
- Plass flowsensoren på 'kammer bridge' slangen på siden tilsig av kammeret. Kontroller at sensoren er riktig orientert i retning av flyt.
- Justere pumpen fart for å få infusjonshastigheten ble beregnet tidligere basert på ønsket skjær stress.
Merk: Infusjonshastigheten kan variere avhengig av høyden og bredden på hvert kammer og viskositet av media. - Slå på CO2 tank å oppnå 5% CO2 og Plasser et vann brett inne stranden.
8. høsting av celler og utvinning av RNA fra flyt kammeret
- Når den ønskede tidsperioden flyt er fullført, langsomt slå ned peristaltiske pumpen fart til 0 og slå av strømmen. Raskt lukke alle åpne stopcocks og fjern kammeret og tilknyttede slangen med en stopcock i hver ende.
- Ta kammeret til en ren Borstemmaskin og forsiktig skru alle skruene for å fjerne topplaten. Bruker p-nese pinsett, fjerne av objektglass fra bunnplaten og legg den i en 100 mm diameter vev kultur parabol.
- Vask lysbildet med 10 mL kaldt fosfat-bufret saltoppløsning (PBS)- / - og når cellene under et mikroskop for å bekrefte etterlevelse av cellen og justering i retning av flyt.
- Sug opp PBS fra platen og overføre lysbildet til en ren 100 mm diameter rett. Legge til 350 µL av lyseringsbuffer fra RNA utvinning kit (se Tabell for materiale), som inneholder 1/100 av beta-mercaptoethanol, på lysbildet.
FORSIKTIG: Legge til beta-mercaptoethanol i kjemisk avtrekksvifte. - Skrape cellene av lysbildet bruker polyetylen blad celle skraper. Tilt vev kultur fatet, slik at væsken som bassenget på bunnen, og fjerne av objektglass med tang. Pipetter cellen lysate i en 1.5-mL tube og holde det på is.
- Fortynne lager eksogene referanse RNA (luciferase RNA) til 0.0025 ng/µL gjennom føljetong fortynning før du legger det til prøven. For eksempel hvis lager konsentrasjonen 1 µg/µL, en fortynning av 1/400.000 er nødvendig for å oppnå 0.0025 ng / µL. legge 10 µL av fortynnet luciferase RNA hvert utvalg fra cellen lysate for nedstrøms RNA isolering og analyse.
- Fortsette med RNA utvinning protokollen ifølge instruksjonene fra produsenten, eller fryse lysate-80 ° c før kunne fortsette med utvinning.
9. beregning av effektiviteten av RNA utvinning og cDNA syntese
Merk: Beregne luciferase effektiviteten etter RT-qPCR ved å sammenligne den teoretiske avkastningen og eksperimentelle avkastningen.
- Bestemme den teoretiske avkastningen for luciferase RNA.
- Bestemme den totale mengden luciferase Kopier lagt til prøven. (Legge 0.025 ng/sample = 2,73 x 107 eksemplarer av luciferase RNA per prøve før RNA ekstraksjon.)
- Beregne molekylær masse luciferase RNA ved hjelp av en gjennomsnittlig molekylær masse per nukleotid på 330 g/mol og multiplisere det med lengden på firefly luciferase RNA, 1652 nukleotider.
- Dele mengden luciferase RNA lagt (0.025 ng) for hver prøve før RNA ekstraksjon av molekylære massen til molar antallet. Deretter multiplisere som ved Avogadros tall å gi Kopier lagt til prøven.
- Beregn den teoretiske avkastningen luciferase kopiene for hver RT-qPCR reaksjon ved hjelp av ligning:
- Beregne eksperimentelle avkastningen for luciferase kopier for hver RT-qPCR reaksjon med luciferase plasmider for å generere en standardkurven for RT-qPCR.
- Beregne luciferase effektivitet (%) ved hjelp av formelen:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket linearization av luciferase plasmider bruker begrensningen enzymer ble bekreftet av kjører fordøyd produkter på en agarose gel (figur 1). Størrelsen på linearisert produktet ble bekreftet på DNA stiger og sammenligning uncut plasmider.
Vi har tilpasset parallell-plate flow chamber oppsettet fra Lane et al. 9 for eksperimenter som krever flere betingelser og behandling med skjæring stress eller flere skjæring stress betingelser. Vi bruker en dedikert miljø, stranden, som kan huse flere, ferdig montert flyt kretser at alle har overvåket strømningshastigheter (figur 2). Infusjonshastigheten overvåkes bare oppstrøms av parallell-plate (figur 3). Den flyt kretser og kan overvåkes direkte gjennom glassdørene uten forårsaker svingninger i temperatur, fuktighet eller gass innholdet på stranden.
Produksjonsprosesser kan føre til små variasjoner i kammeret høyde. Dermed skal strømningshastigheter beregnes for hvert kammer å oppnå det samme skjæring stresset (tabell 1). I teorien kamre med identiske høyder kan bruke identiske strømningshastigheter for å oppnå det samme skjæring stresset og kan brukes i serien. Typisk eksperimenter med endotelceller bruke skjæring stress 0 - 1,5 Pa. laminær skjæring stress 1 Pa ble brukt i denne arbeidsflyten modell arteriell endothelial skjæring stress. Det kan også være variasjoner mellom pumpen hodet innstillingene og pumpe hoder over tid med bruk. Bruke gjennomstrømningsmåler kan utgjør disse forskjellene.
Eksperimenter ved hjelp av anvendelsen av skjæring stress ofte innebære flere skjæring stress betingelser, behandling forhold og tidspunkt. Der det er mulig bruker vi en endogen referanse RNA konto for alle variabilities i den eksperimentelle set-up. For noen eksperimenter, finne en endogen referanse RNA med kvantitative stabilitet er ikke gjennomførbart16. Videre kan kvantitativ stabilitet eller ustabilitet av endogene referanse gener mellom eksempler tilskrives enten stimulans-avhengige effekter på mobilnettet uttrykk nivåer eller variasjoner i effektiviteten av RNA utdrag eller omvendt transkripsjon. Kontoen for disse ineffektivitet, og innstillingen der en endogen referanse genet ikke er kvantitativt stabil, bruker vi en spiker i eksogene referanse genet. Eksperimenter med laminær skjæring stress i pattedyr endotelceller, bruker vi en firefly luciferase RNA som eksogene RNA spike (figur 4A).
Figur 4 viser analysert RT-qPCR eksperimentelle data fra skjæring stress eksperimenter vurdere Krüppel som faktor 2 (KLF2) tap-av-funksjon ved hjelp av siRNA. KLF2 er en transkripsjon faktor upregulated laminær strømning i endotelceller og store transcriptional megler av endothelial genuttrykk i innstillingen av laminær strømning2.
Figur 4A viser luciferase effektivitet for tre separate forsøk, hver med to flyt kamre. Luciferase effektivitet kan være like mellom prøver av et eksperiment (eksperiment 1) eller vise noen variasjoner (eksperimenter 2 og 3) (figur 4A). Disse resultatene er verdifullt i eksperimentell systemer der bare små absolutt endringer ses. Bruk av en ytre referanse genet kan være spesielt viktig eksperimenter der eksperimentelle behandlinger kan påvirke effektiviteten av omvendt transkripsjonstjenester eller PCR17. Resultatene avbildet i figur 4A er typisk. En luciferase effektivitet på 5% angir at 5% av luciferase RNA (dvs., første startbeløpet for RNA) lagt til utvalget før RNA ekstraksjon oppdages av RT-qPCR. Mellom prøver eller betingelsene i ett enkelt eksperiment er luciferase effektivitet vanligvis ± 50%. Resultatene bør tolkes med forsiktighet hvis variasjon av luciferase effektiviteten er > 50% og bør inneholde en gjennomgang av eksperimentelle prosedyrer og vilkår.
Figur 4B viser typisk eksperimentelle resultatene av RT-qPCR fra gjentatte skjæring stress eksperimenter, hver med flere parallell-plate flyt kamre. Innenfor hvert eksperiment normaliseres KLF2 mRNA uttrykk på tre måter. Første normalisering bruker en endogen referanse RNA, Cyclophilin A (CycA). Andre normalisering bruker en eksogene referanse RNA, firefly luciferase (Luc). Tredje normalisering bruker begge endogene og eksogene referansen RNA. Innenfor hvert eksperiment som vist i figur 4B, alle tre normalisering metoder (normalisering endogene referanse genet, eksogene referanse genet og begge endogene og eksogene gener sammen) gir samme resultater. Hvis metoden normalisering endrer resultatene (f.eksfører til > 50% forskjell), bør resultatene tolkes med forsiktighet. Når det er betydelig variasjon mellom metoder for normalisering, bør endogen referanse gene(s) gjennomgås, som det kan være den avhengige variabelen i eksperimentell systemet. Tilsvarende bør eksperimentelle prosedyrer og vilkår gjennomgås. Figur 4Bgir KLF2 knockdown bruker siRNA lignende knockdown effektivitet mellom tre separate forsøk (eksperiment 1, 2 og 3). Vi brukte tre distinkte biologiske prøver for disse eksperimentene, bruker kinesere samtidig kjører flyt med skjæring stress på 1 Pa for hvert eksperiment.
Figur 1: Agarose gel bilde av linearization av eksogene luciferase plasmider. Supercoiled og 1 kb + DNA stiger brukes som markører for å finne både uncut og skjær luciferase plasmider størrelser i kilobases (kb). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: skjematisk oversikt over flere flyt krets samlinger i et dedikert miljø (stranden). Strømningshastigheter i både flyt kretser er lett overvåkes i sanntid, uten å forstyrre miljøet, og både kretser kan kjøre samtidig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: skjematisk oversikt over en enkelt flyt krets forsamling. Rør størrelser og Luers brukes angis i denne figuren. Kontroller at strømmen måleren er orientert i retning av flyten og plassert oppstrøms flyt kammeret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representant resultater fra KLF2 tap-av-funksjon eksperimenter i menneskelig endotelceller utsatt for skjæring stress (1 Pa) for 24 h. (A) dette panelet viser kvantifisering av eksogene luciferase RNA i tre separate flyt eksperimenter. Luciferase effektivitet kan ligne mellom prøver av et eksperiment (eksperiment 1) eller Vis noen variasjoner (eksperimenter 2 og 3). Luciferase (absolutt eksemplarer) er kopien antall luciferase RNA oppdaget av revers transkriptase kvantitative PCR (RT-qPCR) av absolutt kvantifisering bruker en standard kurve. Luciferase effektivitet er eksperimentell luciferase Kopier delt de teoretiske luciferase eksemplarene hvert utvalg multiplisert med 100 (se trinn 8 av protokollen). Relative luciferase effektivitet er luciferase effektiviteten til hver prøve delt referanse tilstanden (strøm + Ctlsi) innen hvert eksperiment. (B) disse panelene viser normalisering av genuttrykk i et eksempel skjæring stress eksperimenter ved hjelp av både endogene og eksogene gener. Resultatene er fra revers transkriptase kvantitative PCR (RT-qPCR). Knockdown KLF2 mRNA uttrykk vises i nærvær av laminær strømning med skjæring stress 1 Pa for 24 h. FC = kaste endring; CycA = cyclophilin A, brukes som en endogen referanse RNA; Luc = luciferase, brukes som en eksogene referanse RNA. Dataene tilpasset fra mann et al. 5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Kammeret høyde (mikron, µm) |
Bredde (centimeter, cm) |
Flow Rate (mL/min) for 1 Pa skjæring stress | Viskositet (centipoises, cP) |
| 303.80 | 1,90 | 19.48 | 0.90 |
| 326.10 | 1,90 | 22.45 | 0.90 |
| 344.84 | 1,90 | 25,10 | 0.90 |
| 319.06 | 1,90 | 21.49 | 0.90 |
Tabell 1: Kammer høyder og eksempler på flyt priser for ulike flyt kammer å oppnå skjæring stress 1 pa
| J kluter |
| Pinsett |
| Reservoaret flaske og Cap |
| Avdemping og Cap |
| Flyt Loop |
| 1/16" mannlige Luer x 3 |
| 1/16" kvinnelige Luer x 3 |
| 1/8†mannlige Luer x 2 |
| 1/8†kvinnelige Luer x 4 |
| 3/16" mannlige adapter x 2 |
| 14 L/S Hard Tube (2 tommer) x 1 |
| 14 L/S bløt rør (5 tommer) x 2 |
| 16 L/S bløt rør (3 tommer) x 2 |
| 25 L/S bløt rør (3 tommer) x 2 |
| 13 L/S Hard Tube (10 tommer) x 1 |
| Flow Chamber |
| 1/8†mannlige Luer x 2 |
| 1/8†kvinnelige Luer x 2 |
| 16 L/S bløt rør (3 tommer) x 3 |
| Topp- og bunnplater |
| Skruene |
Tabell 2: Deler skal autoklaveres i trinn 6.2 i protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Skjæring stress er en fysiologiske tilstand som modulerer endothelial funksjon, delvis ved å påvirke stabil gene expression2,5. Modeller av genet regulering i ulike skjæring stress forhold vil bidra til en større forståelse av endothelial funksjon. Denne pragmatisk arbeidsflyten inneholder en flyt krets ved hjelp av en parallell-plate flyt kammer tilpasset fra Lane et al. 9 og representerer laminær, ikke-pulsatile flyt. Generelle oppsettet ble utviklet for å forenkle eksperimenter som krever flere flyt kamre og minimere eksperimentelle variasjon i denne innstillingen.
Samlingen flyt krets er en viktig komponent i denne arbeidsflyten og er tilpasset fra Lane et al. 9. flere tilpasninger av denne samlingen og protokollen ble gjort for å gjenspeile den eksperimentelle systemet. Et stort oppvarmet enhet, stranden, er en tilpasning som forenkler samtidige operasjonen og overvåking av flere flyt kretser innenfor samme miljø. Dette systemet har vært brukt med hell for anvendelse av skjæring stress til endotelceller for ulike tidsperioder, fra 1 time til 7 dager, og på flere nivåer av skjæring stress (f.eks1.0, 1.5 og 2.0 Pa). Dette systemet ble også brukt for genet knockdown studier for å vurdere funksjon av et flyt-responsive endothelial gen i innstillingen for skjæring stress (Figur 4)5. Det er betydelig variasjon mellom pumper og pumpe hoder, som også endres over tid på grunn av normal slitasje. Kontoen for disse forskjellene, bruker vi en flowsensoren ligger proksimale til flow chamber å kontinuerlig overvåke strømningshastigheter. Forskjellige størrelser av rør og Luers brukes til å sikre trangt for hver komponent og å hindre alle lekkasje under eksperimenter. Vi teller celler og seeded ca 1 000 000 celler per glass lysbilde, dropwise, og deretter la cellene ruge ved 37 ° C i 15 minutter for å øke tilslutning effektivitet. Sammenlignet med endoteliale progenitor celler som kan bli sådd for en kort tid før den skjæring stress9, frø vi menneskelige endotelceller for minst 24 timer før den skjæring stress. Kortere varighet kan føre til dislodging av celler under flyt eller et usammenhengende lag av endotelceller, selv med riktig seeding tetthet. Vi vektlegger inspeksjon av lysbilder for en confluent monolayer av endotelceller både før og etter skjæring stress. Vi finner at lysbildene belagt med fibronectin, en naturlig ekstracellulær matrix komponent18, opprettholde den endotelial monolayer mer konsekvent sammenlignet med sider belagt med gelatin (denaturert fibrillar skriver jeg kollagen). Til slutt, flyt dampeners i denne protokollen er optimalisert for å bruke 30 mL av media, forhold til 190 mL medier for andre produsenter.
Flere trinn i flow krets forsamlingen krever ytterligere omsorg. En selv monolayer av endotelceller bør opprettes før den skjæring stress. Det er viktig å frø celler på objektglass dropwise å øke antall celler som overholder lysbildet, og dermed hele lysbildet dekning. Ventetiden mellom cellen frø og legge til flere medier til lysbildet generelt forbedrer seeding effektivitet som det gir tilstrekkelig tid for cellene å overholde lysbildet i stedet for å bli vasket bort i flere lysbildet skuffen. Inspisere cellene visuelt før, under og etter skjæring stress. Et mikroskop kan plasseres på stranden for dette formålet. Flowsensoren må festes i riktig retning og infusjonshastigheten målet skal kontrolleres for hvert individuelle flyt kammer. Flow loopen systemet bør være perfused uten kammer å sikre at ingen medier lekkasje eller andre problemer, som presset oppbygging, å unngå perturbing cellene under de faktiske eksperimentene. Inspisere for og eliminere bobler i systemet. Mens testing flow loopen systemet, sikre stopcocks er alle åpne før du slår på peristaltiske pumpen å tillate uavbrutt, enveis. Kontroller at alle stopcocks er lukket før flow chamber vedlegges loopen og fullt åpnet før omstart pumpen.
Vi finner at tillegg av en ytre referanse genet er nyttig i forskjellige scenarioer. Endothelial celle media inneholder ofte heparin, som er en inhibitor av PCR17. Mens noen RNA utvinning protokoller innlemme fremgangsmåte for å fjerne heparin, kan spor forårsake forskjeller i PCR effektivitet mellom eksempler. Potent behandlinger kan også utelukke identifikasjon av en endogen referanse genet som kvantitativt stabil. Våre lab har skapt en effektiv protokoll for å syntetisere 5'-avkortet og poly-A-tailed luciferase RNA som en eksogene referanse RNA. Denne strategien har vist seg for å være en kostnadseffektiv tilnærming i forhold til å kjøpe en kommersielt tilgjengelig RNA. Under utarbeidelsen av eksogene referanse RNA er det viktig å aliquot RNA i engangs dele å unngå flere fryse-Tin sykluser. Grundig blande og nøyaktig pipettering er avgjørende for å opprettholde Inter aliquot konsistens. Typisk eksperimenter viser en luciferase effektivitet i størrelsesorden 5% ± 2,5 men kan variere fra 1-10%. Det er forsvarlig å rette RT-qPCR resultater for både eksogene referanse RNA effektiviteten og en endogen referanse (housekeeping) genet.
Eksperimentene vi utfører, brukes firefly luciferase sekvenser som ikke-pattedyr pigg i referanse RNA i pattedyr modeller. Eksperimenter der firefly luciferase er uttrykt i celler, vil dette ikke være en passende referanse genet. Andre artsspesifikke referanse gener kan brukes, inkludert den Caenorhabditis elegans miRNA cel-miR-3919 og ribulose bisphosphate carboxylase plante RNA20.
Denne flyten kretsen modeller en 2D-monolayer av endotelceller dyrket på vev kultur plast eller glass, som er ganske stiv. Matrix stivhet kan påvirke endothelial svaret flytende skjæring stress21. Dette modell-systemet bruker en relativt høy oksygen konsentrasjon mer lik arteriell enn venøs Oksygenkonsentrasjoner. Denne modellen tett ligner rette segmenter av større fartøy i et lukket kardiovaskulære system og har et relativt homogene miljø for endotelceller på lysbildet. Andre bestemte betingelser i 3-D strukturer, for eksempel bifurcations eller curvatures av fartøy, ikke er representert med denne modellen. Andre systemer kan modell andre flyt mønstre, inkludert de i buet regioner i blodkar, men gir færre celler enn systemet er beskrevet i denne protokollen. Tilsvarende kan andre samlinger være mer passende hvis > 1 x 106 celler, eller hvis en enkeltcelle analyse. Vår nåværende program modeller ikke-pulsatile laminær strømning. Likevel, denne modellen kan brukes til å generere andre bølgeformer, inkludert pulsatile eller oscillasjon bølgeformer, med konsistens, flyt priser overvåkes kontinuerlig.
Samlet inneholder pragmatisk arbeidsflyten et system for samtidig bruk av skjæring stress til flere flyt kamre med overvåkede strømningshastigheter. Materialer og prosedyrer i denne arbeidsflyten er utformet for å minimere eksperimentell variasjoner mellom prøver og betingelser. Denne arbeidsflyten har blitt brukt for RNAi eksperimenter i innstillingen for laminær strømning og kan brukes for noen eksperimenter krever flere betingelser med laminær skjæring stress, eller flere laminær skjæring stress størrelser og/eller tidspunkt, inkludert alternative bølgeformer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av CIHR MOPP 142307 til P.A.M H.S.J.M. er en mottaker av en kanadisk institutter for helse forskning treningsprogrammet i regenerativ medisin fellesskap. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. og M.K.D. er mottakere av dronning Elizabeth II Graduate stipend i vitenskap og teknologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | gibco | 25300-062 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 10 mm2 Culture Dish | Sarstedt | 83.3902 | |
| 30 mL Syringe | BD | 302832 | |
| 4-Way Stopcocks | Discofix | D500 | |
| Aluminum foil | |||
| BEACH | Darwin Chambers Company | MN: HO85, SN: 4947549 | |
| Cell Scrapers | |||
| CO2 Meter | BioSphenix, Ltd. | MN: P120, SN: 0342 | |
| CO2 Sensor | BioSphenix, Ltd. | MN: C700, SN: 52852 | |
| Distilled water | gibco | 15230-170 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- | gibco | 14190-144 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | Promo Cell | C-22011 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix | Promo Cell | C-39216 | |
| Fibronectin (pure) | Sigma-Aldrich | 11051407001 | |
| Filter (0.20 um) | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Flow Dampener and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Meter: 400 Series Console | Transonic Scisense Inc. | T402 | |
| Flow Meter: 400 Series Tubing | Transonic Scisense Inc. | TS410 | |
| Flow Reservoir and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Sensor | Transonic Scisense Inc. | ME4PXL | |
| Isotemp 737F Oven | Fisher Scientific | FI-737F | |
| J cloth | J cloth | ||
| Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) | Fisherfinest | 12-544-4 | |
| Paper sterilization pouch | Cardinal Health | 92713 | |
| Pump (Masterflex L/S Economy Drive) | Cole-Parmer | 7554-90 | |
| Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| Rectangular 4 Well Dish | Thermo Scientific | 267061 | |
| Tweezers | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing | |||
| Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-25 | |
| Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-14 | |
| Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-16 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-13 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-14 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luer | |||
| 3/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-08 | For #25 tubing |
| 1/8" Male Luer | Cole-Parmer | 30800-24 | For #16 tubing |
| 1/8" Female Luer | Cole-Parmer | 30800-08 | For #16 tubing |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-00 | For #14 tubing |
| 1/16" Female Luer | Cole-Parmer | 45508-00 | For #14 tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockdown reagents | |||
| Oligofectamine Reagent | Invitrogen | 12252-011 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | gibco | 31985-070 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vitro transcription | |||
| Generuler 1kb+ DNA ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
| MEGAclear Kit | Ambion | AM1908 | |
| mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| pSP-luc+ | Promega | E4471 | |
| Supercoiled DNA Ladder | New England BioLabs Inc. | N0472S | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| UltraPure Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585011 | |
| XhoI Restriction Enzyme | New England BioLabs Inc. | R0146S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction | |||
| Beta-mercaptoethanol | Sigma | M3148-100mL | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
References
- Aird, W. C.
- Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
- Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).
- Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).
- Won, D., et al. Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow. The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).
- Baeyens, N., et al. Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point. eLIFE. 4, 04645 (2015).
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), 3349 (2012).
- Gray, K. M., Stroka, K. M. Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models. Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).
- Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).
- Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs). Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20 (2017).
- Thormar, H. G., et al. Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis. Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).
- Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription. Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).
- Vaughan-Shaw, P. G., et al. A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification. Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).
- Collins, C., et al. Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells. Nature Communications. 5, 3984 (2014).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).
- Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR. Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).
- Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).
