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Enriquecer y ampliar las células T específicas de antígeno raro con nanopartículas magnéticas

Published: November 17, 2018 doi: 10.3791/58640
Automatic Translation
1,2,3,4, 2,4
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 2Institute for Cell Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 3Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University, 4Department of Pathology, School of Medicine, Johns Hopkins University

Summary

Linfocitos T antígeno específicos son difíciles de caracterizar o utilizar en terapias debido a su extremadamente baja frecuencia. Aquí proporcionamos un protocolo para desarrollar una partícula magnética que puede atar a las células T antígeno específicas para enriquecer estas células y luego ampliarlas varias centenas para caracterización y tratamiento.

Abstract

Hemos desarrollado una herramienta para enriquecer y expandir las células T específicas de antígeno. Esto puede ser útil en casos tales como A) detectar la existencia de antígenos específicos de células T, B) sondear la dinámica de las respuestas específicas de antígeno, C) entender cómo respuestas antígeno específicas afectan al estado de enfermedad como autoinmunidad, D) desmitificar heterogéneos las respuestas de células T específicas de antígeno, o E) utilizan células de antígeno-específica para la terapia. La herramienta se basa en una partícula magnética que hemos conjugado antígeno específicas y células T señales coestimuladoras y que llamamos como artificial antígeno que presenta las células (aAPCs). En consecuencia, puesto que la tecnología es fácil de producir, se puede fácilmente ser adoptado por otros laboratorios; por lo tanto, nuestro propósito aquí es describir en detalle la fabricación y el uso posterior de la aAPCs. Se explica cómo asociar señales coestimuladoras y antígeno específicas a la aAPCs, cómo utilizarlas para enriquecer para linfocitos T antígeno específicos y cómo ampliar linfocitos T antígeno específicos. Además, se destacan ingeniería diseño consideraciones basan en información experimental y biológica de nuestra experiencia con caracterización de linfocitos T antígeno específicos.

Introduction

Con el surgimiento de muchos inmunoterapias, hay necesidad de ser capaz de caracterizar y controlar las respuestas inmunitarias. En particular, la respuesta inmune adaptativa es de interés debido a la especificidad y la durabilidad de las células. Recientemente, terapias de la célula de T del receptor de antígeno quimérico se han aprobado para la terapia del cáncer; sin embargo, los receptores de antígeno se basa en el antígeno de superficie celular común CD19, en lugar de los antígenos específicos para el cáncer1. Más allá de la especificidad, las inmunoterapias pueden sufrir de la falta de control y la limitada comprensión de la dinámica respuesta inmune en cáncer y autoinmunidad.

Uno de los desafíos de estudiar la respuesta antígeno específica es su extremadamente baja frecuencia, por ej., linfocitos T antígeno específicos son 1 de cada 104 106 T células2,3. Así, para investigar que T las células están presentes o en respuesta, las células necesitan que sea enriquecido y ampliado, o su señal a amplificar. Es caro y difícil de mantener las células de alimentador mediante las técnicas actuales que se centran en la expansión de las células antígeno específicas. Las técnicas actuales que se centran en amplificar la señal de T específicas de antígeno de las células, como ensayo de la enzima-ligado immunospot (ELISPOT), limitar la reutilización de esas células de T4. Por último, debido a la baja sensibilidad, con frecuencia estas dos técnicas deben combinarse para la enumeración específica de antígeno.

Para enfrentar estos problemas, hemos desarrollado el antígeno artificiales basados en nanopartículas magnéticas que presenta células (aAPC)5,6,7,8. La aAPC puede ser funcionalizado con un complejo de péptido señal específica de antígeno cargado de histocompatibilidad (pMHC) y moléculas coestimuladoras -e.g., un anticuerpo anti-CD28-tanto enriquecer las células T antígeno específica y posteriormente estimular su expansión (figura 1). Las partículas así pueden ser un producto estándar rentable que puede ser tanto modificado para requisitos particulares para cubrir estímulos específicos de antígeno estandarizado a través de experimentos y pacientes. Realizar el enriquecimiento y ampliación del proceso resultados en cientos de miles de doble expansión de antígenos específicos de células CD8 + T y puede resultar en frecuencias hasta un 60% después de sólo una semana, lo que permite la caracterización o uso terapéutico de la gran número de células. Adjunto, describimos cómo hacer nanopartículas aAPCs, algunas consideraciones de diseño críticas en la elección de las propiedades de las nanopartículas y demostrar algunos resultados típicos de utilización de estas partículas en aislamiento y expansión de células T CD8 + específica de antígeno.

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Protocol

Todos los ratones fueron mantenidos por directrices aprobadas por la Junta de revisión institucional de la Universidad Johns Hopkins.

1. Cargue la proteína de la fusión de inmunoglobulina dimérico complejo de histocompatibilidad mayor (MHC-Ig) con secuencia de péptido antígeno deseado.

Nota: Si utiliza H - 2Kb: Ig, a continuación, siga el protocolo detallado en el paso 1.1; Si se usa H-2Db:Ig, a continuación, siga el protocolo detallado en el paso 1.2.

  1. Activa la carga de la secuencia del péptido en H - 2Kb: Ig.
    1. Preparación de buffers necesarios. Preparar el buffer de desnaturalización por lo que una solución de NaCl 150 mM y 15mM Na2CO3 en agua desionizada y luego ajustar el pH a 11.5. Preparar el buffer de renaturalización por lo que una solución de 250 mM Tris HCl en agua desionizada y ajustar el pH a 6.8.
      Nota: Típicamente, es necesario aproximadamente 5 mL de búferes de la desnaturalización y renaturalización de 1 mg de H - 2Kb: Ig.
    2. Desnaturalizar el H - 2Kb: Ig para permitir la Unión del péptido mayor. Traer el H - 2Kb: la concentración de Ig a entre 0.5-2 mg/mL con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Luego diluir el H - 2Kb: Ig a una concentración final de 100-200 μg/mL con volumen de 5-10 equivalentes de desnaturalización del almacenador intermediario y dejar para incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
    3. Añadir 50 exceso molar de péptido secuencia (péptido stock se mantiene generalmente en 1 mM a-80 ° C) para el H - 2 Kb: solución de Ig.
      Nota: Generalmente antígenos péptidos necesitará ser disuelto dentro de al menos 10% dimetil sulfóxido (DMSO) y luego agregó lentamente a PBS permanecer soluble. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos, la cantidad de DMSO puede necesitar ser aumentado.
    4. Renature H - 2Kb: Ig con el péptido. Inmediatamente después de la adición del péptido, llevar la solución a un pH de 7.4 mediante la adición de buffer de renaturalización. Deje que la solución neutralizada de incubar 48 h a 4 ° C.
    5. Concentrar y lavar cargado de péptido H - 2Kb: Ig. utilizando un concentrador centrífugo con un corte de peso molecular de 50 kDa (MWCO), siga las instrucciones del fabricante para lavar la carga de péptido H - 2Kb: solución de Ig 3 veces con PBS, se concentran a menos de 1 mg/mL y cuantificar la concentración en un espectrofotómetro.
  2. Activa la carga de la secuencia del péptido en H-2Db:Ig.
    1. Preparación de buffers necesarios. Preparar el buffer de desnaturalización por lo que una solución de ácido cítrico de 131 mM, 150 mM NaCl y 124 mM Na2HPO4 en agua desionizada y luego ajustar el pH a 6.5. Preparar el buffer de renaturalización por lo que una solución de 120 mM Tris HCl en agua desionizada y ajustar el pH a 8.8.
      Nota: Por lo general, requieren aproximadamente 5 mL de la solución de desnaturalización y 1 mL del buffer de renaturalización para 1 mg de H-2Db:Ig.
    2. Desnaturalizar la H-2Db:Ig para permitir la Unión del péptido mayor. Traer el H-concentración de 2Db:Ig a una concentración final de 0.5-2 mg/mL con PBS. Luego, diluir el H-2Db:Ig a una concentración final de 100-200 μg/mL con 5-10 equivalentes de volumen de tampón de desnaturalización.
    3. Añadir 50 exceso molar de péptido secuencia (péptido stock se mantiene generalmente en 1 mM a-80 ° C) para el H-2Db:Ig solución y deje para incubar durante 1 h a 37 ° C.
    4. Añadir β2 microglobulina y renature H-2Db:Ig con el péptido. Añadir 2 veces exceso molar de β2 microglobulina. Luego, traer la solución a un pH de 7.4 mediante la adición de buffer de renaturalización. Deje que la solución neutralizada de incubar durante 24 h a 4 ° C.
    5. Concentrar y lavar H cargado de péptido-2Db:Ig. utilizando un concentrador centrífugo con una 50 kDa MWCO, siga las instrucciones del fabricante para lavar la carga de péptido H - 2 Kb: solución de Ig 3 veces con PBS, se concentran a menos de 1 mg/mL y cuantificar la concentración en un espectrofotómetro.

2. conjugar complejos péptido-MHC y moléculas coestimuladoras en la superficie de nanopartículas magnéticas para formar nanopartículas artificiales antígeno que presenta las células. Utilice uno de tres métodos diferentes dependiendo del tamaño de partícula y aplicación.

Nota: Puede utilizarse un número de técnicas diferentes de conjugar las proteínas a la superficie de las partículas. En este documento, se describen 3 enfoques distintos: partículas recubiertas de Amina (paso 2.1), N-hydroxysuccinimide (NHS)-revestidas partículas (paso 2.2) y anti-biotin-revestido (paso 2.3). Estos procesos también se han descrito en detalle en la sección de métodos de dos documentos publicados6,7. Realizar todos los pasos en una campana de bioseguridad con soluciones estériles para mantener la esterilidad de la aAPC stock partículas.

  1. Capa específica de antígeno estimulantes las señales y con partículas magnéticas recubiertas de Amina (figura 2). Este proceso se describe por 100 nm, cubierto de Amina superparamagnéticas nanopartículas.
    Nota: Protocolos detallados para la fijación del anticuerpo a la superficie de una partícula revestida de Amina pueden encontrarse en https://www.micromod.de/en/technotes-2.html, donde 201 Nota técnica describe cómo a thiolate anticuerpos y conjugado a maleimida funcionalizar partículas y 202 describe el proceso necesario para funcionalizar las partículas recubiertas de Amina con grupos funcionales de maleimida. Aquí, sólo ligeras modificaciones se destacan para las señales coestimuladoras Unidas a estas partículas y MHC-Ig.
    1. Tiolato los anticuerpos con el reactivo de Traut (Nota técnica 201).
      1. Preparar un 10 x tampón de PBS-etilendiaminotetracético ácido (EDTA) (0,1 M PBS y 100 mM EDTA). Añadir la 10 x tampón PBS-EDTA a los anticuerpos en un 1:10 ratio para evitar la oxidación de tioles libres a los anticuerpos.
      2. Añadir 20 exceso molar de reactivo de Traut (2-iminothiolane) para el anticuerpo e incubar por 2 h a temperatura ambiente con la mezcla. Medir a reactivo de Traut (polvo seco) dentro de una campana química para evitar la respiración como convierte a grupos amino a grupos tiol.
      3. Lavar a fondo con el 1 x de tampón de PBS-EDTA 3 veces con un concentrador centrífugo de una 50 kDa MWCO y siga las instrucciones del fabricante, concentrando hasta un volumen final de 500 μl. medir la concentración de la solución de anticuerpo utilizando una Espectrofotómetro.
    2. Convertir los grupos funcionales de aminas en la nanopartícula magnética maleimida grupos con sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) ciclohexano-1-carboxilato (Sulfo-SMCC, nota 202).
      1. Añadir la 10 x tampón PBS-EDTA a los anticuerpos en un 1:10 relación a las partículas.
      2. Disolver el Sulfo-SMCC en agua desionizada y agitar para resuspender en una concentración de 1 mg/mL. Mida la Sulfo-SMCC (polvo seco) dentro de una campana química para evitar la respiración como convierte a grupos amino grupos de maleimida.
      3. Añadir 0.016 nmol de la solución Sulfo-SMCC cada milímetro cuadrado de superficie de las partículas. Para 1 mg de las 100 partículas de nanómetro, utilizar 0.3 mg de Sulfo-SMCC. Dejar para reaccionar durante 1,5 h a temperatura ambiente.
      4. Lavar las partículas con el 1 x de tampón de PBS-EDTA 3 veces usando un campo magnético con una columna magnética y resuspender en 500 μl de 1 x de tampón PBS-EDTA.
        Nota: Si utiliza partículas menores de 200 nm, tales como las partículas nm 100 describen, imanes permanentes probablemente no será lo suficientemente potentes como para tirar de las partículas para el lavado o concentración de propósitos. Así, para lavar las partículas más pequeñas, use una columna magnética compuesta de esferas ferromagnéticas para amplificar el campo magnético.
    3. Reaccionan las partículas maleimida funcionalizados con anticuerpos thiolated (Nota técnica 201).
      1. Añadir las partículas a un vial de centelleo de vidrio, añadir una barra de agitación magnética mini, coloque sólo una pulgada por encima de una placa de agitación magnética e inducir magnética mezcla de la solución de partículas.
      2. A la solución de la mezcla, añadir gota a gota los anticuerpos thiolated (0,5 mg de anticuerpos por cada 1 mg de partículas). Dejar para reaccionar durante la noche a temperatura ambiente.
      3. Lavar con tampón de PBS 1 x 3 veces usando un campo magnético y resuspender en 500 μl de PBS 1 x. Etiquetar y almacenar a 4 ° C hasta por 6 meses.
        Nota: Máxima eficacia verbal ocurre cuando partículas maleimida funcionalizados se mezclan inmediatamente con thiolated proteína.
  2. Capa específica de antígeno estimulantes las señales y con partículas magnéticas recubiertas de NHS (figura 3). Este proceso se describe por 200 nm, cubierto de NHS superparamagnéticas nanopartículas.
    1. Preparar el buffer de resuspensión, amortiguamiento buffer y buffer de almacenamiento. El buffer de resuspensión es 25 mM 2-(N-morfolino) (n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido ácido (MES) con 0.01% de Tween 20 se ajustó a pH 6.0. El amortiguamiento buffer es una solución de 100 mM de Tris-HCl a pH 7.4. El buffer de almacenamiento de información es una solución de 0,01% y de 10 mM PBS Tween a pH 7,4.
    2. Resuspender las partículas liofilizadas en 1 mL de la solución de resuspensión. Vortex vigorosamente durante al menos 15 minutos hasta que sin agregados visibles.
    3. Colocar las partículas magnéticas en un soporte magnético para eliminar el sobrenadante, resuspender con 0,5 mL de buffer de resuspensión y transferencia a un vial de centelleo de vidrio. Vortex hasta que no hay agregados visibles.
    4. Añadir 0,1 mg de proteína total por 1 mg de partículas resuspendidas. Vortex para mezclar y reaccionan a temperatura ambiente durante 2.5 h mientras se mezcla.
    5. Añadir 0,1 mL del tampón de amortiguamiento y reaccionan a temperatura ambiente durante 30 minutos mientras se mezcla.
    6. Coloque el frasco centelleo en un soporte magnético y lavar las partículas. Espere hasta que el sobrenadante esté claro para eliminar. Eliminar las partículas del soporte magnético, agregar 1 mL de buffer de resuspensión y agitar hasta que no hay agregados visibles. Repetir este proceso tres veces y resuspender las partículas en 1 mL de buffer de resuspensión. Almacenar las partículas a 4 ° C hasta por 6 meses.
  3. Capa específica de antígeno y estimulantes señales anti-biotin-cubierta de partículas magnéticas (figura 4). Este proceso se describe para 50-100 nm, nanopartículas superparamagnéticas anti-biotina.
    1. Biotinylate MHC-Ig o moléculas coestimuladoras.
      1. Ajustar la concentración de proteína a 0.5-2 mg/mL en tampón PBS. Suspender sulfo-NHS-biotina en una concentración de 10 mg/mL en agua desionizada y añadir 20-fold anticuerpo molar de exceso de estimulación. Incubar a temperatura ambiente durante 45 minutos.
      2. Lavado con PBS 3 veces usando un concentrador centrífugo con una 50 kDa MWCO, siga las instrucciones del fabricante, concentrando hasta un volumen final de 500 μl. medir la concentración de la solución de anticuerpo usando un espectrofotómetro.
    2. Biotinilado conjugado Ig MHC o señales coestimuladoras a nanopartículas anti-biotina. Para 500 μl del stock partículas anti-biotina, Añadir 0,5 nmol de anticuerpos estimulantes e incubar a 4 ° C durante la noche.
    3. Lave las nanopartículas conjugadas aAPC. Porque estas partículas son menores de 200 nm, mojar una columna magnética y colocar en un soporte magnético.
    4. Añadir la suspensión de partículas de la proteína a la columna. Permita que todas las proteínas/partículas entrar totalmente en la columna.
    5. Lavar añadiendo 0.5 mL de PBS tres veces a la columna.
    6. Eluir quitando la columna del soporte magnético, agregar 0.5 mL de PBS a la columna y usando el émbolo, expulse la aAPCs partículas en un vial de centelleo de vidrio. Almacenar las partículas a 4 ° C hasta por 6 meses.
      Nota: Las partículas son estables a 4 ° C (no debe ser congelado) por hasta 6 meses. Temperaturas más altas disminuyen la funcionalidad de las partículas y cierta agregación de las partículas han sido observados (datos no mostrados). No guarde a temperatura ambiente durante largos períodos de tiempo como esto disminuye significativamente la vida útil de las partículas.

3. caracterizar el contenido de la proteína antígeno Artificial que presenta células de nanopartículas usando la detección de anticuerpos fluorescentes.

Nota: Se trata de un útil de control de calidad del antígeno artificial producido células presentadoras. También, la cantidad de señal estimulante se utiliza para producir dosis equivalente de la aAPC en lotes y varios tipos de aAPC (e.g., diferentes tamaños).

  1. Medir la concentración de partículas de recubrimiento aAPCs.
    1. Utilizar partículas no conjugadas de la solución y hacer una titulación de dosis 1:2 en una solución de PBS a través de una placa de cultivo de tejidos con fondo plano de 96 pozos con 100 μl por pocillo.
    2. Leer las partículas en un espectrofotómetro de lectura de la placa a 405 nm para crear una curva estándar de concentración conocida de la partícula.
    3. Tomar una muestra de la aAPCs conjugado diluido en PBS hasta un volumen total de 100 μl y leer en el espectrofotómetro.
  2. Retire una muestra de aAPCs fabricado y tinción con anticuerpos fluorescentes.
    1. Para calcular cuánto muestra quitar, estimar el número de anticuerpos en la superficie de la partícula.
      Nota: Para estas técnicas, se asume una densidad de alrededor de 1000 anticuerpos/μm2 de superficie de la partícula. Para ser capaces de detectar la fluorescencia, que requiere unos 1011 Ig MHC o moléculas CD28 totales por prueba fluorescente.
    2. Llevar el volumen total de aAPCs hasta 100 μl de PBS, añadir los tinción de anticuerpos en una dilución 1: 100 e incube durante 1 h a 4 ° C.
      Nota: Anticuerpos ejemplo utilizados con éxito son FITC conjugado anti rata ratón Ig λ1, λ2, λ3 cadena ligera, clon R26 46 para detectar Ig MHC y ratón conjugado FITC anti hámster armenio/Siria IgG, clon G192-1, para la detección de anti-ratón CD28.
  3. Lavar las partículas y leer la fluorescencia en un lector de placas de fluorescentes.
    1. Magnéticamente lavar (como se describe en el paso 2) las fracciones de la aAPC teñido tres veces con 0,5 mL de PBS.
    2. Eluir la aAPCs lavado con 0.5 mL de PBS.
    3. Añadir 100 μl de la aAPCs eluídas a una placa de 96 pocillos con fondo plano para leer la concentración usando la absorbancia como paso 3.1.
    4. Los restantes 400 μL, dividido en partes alícuotas dos 200 μl y añadir a dos pocillos de una placa de 96 pozos, fondo plano negra, poliestireno. Valorar en una proporción de 1:2 hacia abajo la placa tomando 100 μl de la solución y mezclar con el siguiente pozo con 100 μl de PBS en cada uno bueno por lo menos cuatro veces.
      Nota: Promedio múltiples réplicas de la medida para reducir el ruido en la medición.
    5. En la misma placa de 96 pozos negra, hacen una curva estándar del anticuerpo fluorescente utilizado para teñir, añadiendo en 1: 200 en un pozo con 200 μL de PBS y valoración hacia abajo en el cociente 1:2 para pozos de por lo menos 12.
    6. Después de aAPC y fluorescente anticuerpos están en la placa, lea la placa con un lector de placas de fluorescentes.
  4. Calcular la cantidad de proteína por cada partícula. Determinar la concentración de anticuerpos mediante la comparación de los valores de la curva estándar, donde se conoce la concentración de anticuerpos, asumiendo una proporción de 1:1 de tinción de anticuerpos detectados anticuerpos. Entonces dividiendo esta concentración de anticuerpos detectado con la concentración de partículas determinada por el ensayo de absorbancia dará el número de anticuerpos por partícula.

4. enriquecer específica de antígeno CD8 + células de T con el antígeno Artificial preparado nanopartículas células presentadoras.

  1. Aislamiento de células T CD8 +.
    1. Eutanasia a los animales por la exposición a isoflurano seguido por dislocación cervical.
    2. Quitar el bazo y los ganglios linfáticos de ratones C57BL/6j de tipo salvaje y colocar en una solución de PBS. Macerar los órganos y responsables de las células a través de una estéril 70 μm tamiz de celular con lavados frecuentes de PBS.
    3. Para eliminar los no - células T CD8 +, utilice un kit de aislamiento de no-touch T CD8 + celular y seguir las instrucciones del fabricante.
      Nota: Cada condición del antígeno requiere por lo menos 3 x 106 células de T CD8 +.
  2. Añadir la aAPCs nanopartículas para atar a las células T CD8 +.
    1. Tras el aislamiento, concentrado a un volumen de 100 μl de PBS con 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) y 2 mM EDTA.
    2. Determinar el número de aAPCs añadir mediante el cálculo basado en la relación de 1011 aAPC-limite, péptido cargado MHC-Ig para cada 10 células de CD8 + T6 .
    3. Incubar las partículas de la aAPC y de células T CD8 + por 1 h a 4 ° C con mezcla continua en un poliestireno estéril 5 mL redondo tubo inferior.
  3. Preparar medios suplementados y factor de crecimiento de la célula de T (TCGF) responsables y de la cultura de células T CD8 +.
    1. De medios complementados, suplemento medios RPMI 1640 completo (con glutamina) con 1 x no esenciales aminoácidos, piruvato de sodio 1 mM, 0,4 x solución de vitamina, 92 μm 2-Mercaptoetanol, 10 μm ciprofloxacina y 10% suero bovino fetal (FBS).
    2. Para hacer TCGF, siga los protocolos ya establecidos y que se hace referencia aquí9.
      Nota: TCGF es un cóctel propio de citoquinas inmune humano que es esencial para proporcionar a las células T señales de estimulación adicional necesarias para crecer. TCGF podría cambiarse por células T conocido estimulante citoquinas como IL-2, IL-7, o IL-15; sin embargo, uno puede polarizar la respuesta de la célula de T por consiguiente. El protocolo descrito en este documento no ha sido optimizado con estos cócteles; así otras técnicas deben consultarse para concentraciones y combinaciones si TCGF no se utiliza con los ejemplos enumeran10,11.
  4. Lavar y enriquecer la aAPC y mezcla de células T CD8 +.
    1. Lave la aAPCs partículas magnéticas como se describe en el paso 2. Sin embargo, lavar primero usando el tampón PBS con 0,5% BSA y 2 mM de EDTA, utilizando segundo complementa los medios de comunicación y utilizando tercera suplido medios con 1% TCGF.
    2. Eluir la aAPCs y enriquecida de células T CD8 + en 500 μl de medio suplementado con 1% TCGF.
    3. Contar las células en un hemocitómetro y una placa, una placa con fondo de U 96 160 μl por pocillo de medios complementados con 1% TCGF en una concentración de 2,5 x 105 T CD8 + células/mL.
    4. Si aislar usando aAPCs con sólo péptido cargado MHC-Ig en la superficie (sin señales coestimuladoras), luego completa paso 4.5. Si aislar con aAPCs ambos cargados de péptido MHC-Ig en las señales de superficie y coestimuladoras, proceda al paso 5.
  5. Las partículas magnéticas recubiertas con las señales coestimuladoras en la superficie de la fracción enriquecida y añadir un campo magnético para co se agrupan las señales estimulantes en la superficie de las células T.
    1. A las fracciones enriquecidas, añadir una equimolar (o mayor dependiendo de la aplicación consulte la sección acerca de las propiedades de la aAPC control) del anticuerpo estimulante a la cantidad de carga de péptido MHC-Ig en la partícula.
    2. Permitir que las partículas magnéticas coestimuladoras enlazar a enriquecido de células T CD8 + por 1 h a 4 ° C.
    3. Añadir campo magnético mediante la colocación de la placa de cultivo entre dos imanes del disco del neodimio N52 de 1,9 cm (0,75 pulgadas) en longitud.
      Nota: N52 disco imanes tienen un campo extremadamente fuerte. Debe tenerse cuidado para almacenarlos con espaciadores entre los imanes, ya que es difícil de quitar uno del otro y al poner en las placas de cultura. Para reducir al mínimo los imanes se adhieran a las piezas metálicas de la incubadora, colocarlos en recipientes de espuma de poliestireno de tubo cónico de 50 mL en la parte inferior y la parte superior.

5. ampliar y detección específica de antígeno CD8 + células de T con el antígeno Artificial preparado nanopartículas células presentadoras.

  1. Agregar la placa bien fondo U 96 con aAPCs y células T CD8 + en humidificado 5% CO2, incubadora de 37 ° C durante 3 días. El día 3, alimentar las células con 80 μl por pozo de medios complementados con 2% TCGF y lugar en la incubadora hasta el día 7.
  2. En el día 7, cosechar las células estimuladas en 5 mL tubo inferior para contar.
  3. Una vez todos los de solución se cosecha, rotación de las células cosechadas a resuspender en 0.5 mL de PBS con azida sódica al 0.05% y 2% FBS. Contar las células viables por tinción con azul de tripán y contando con un hemocitómetro.
  4. Eliminar las células contadas 50.000-500.000 en dos nuevos 5 mL alrededor de tubos para la tinción específica de antígeno. Se utilizará un tubo para la mancha cognado péptido-MHC, y el otro tubo se utilizará para la mancha no cognado para determinar tinción de fondo.
  5. Añadir 1 μg de biotinilado MHC-Ig (usando la técnica descrita en el paso 2) para los respectivo cognado y no cognado en 100 μl de PBS con azida sódica al 0.05% y 2% FBS con allophycocyanin (APC)-anti-ratón conjugado rata CD8a, clon 53-6.7 (relación de dilución de 1: 100) por 1 h a 4 ° C.
  6. Añadir streptavidina secundaria y vivir muertos de la mancha. Lavar exceso biotinilado MHC-Ig con PBS por centrifugación. Luego la mancha todas las muestras con una proporción de 1: 350 de ficoeritrina (PE)-etiquetado cociente estreptavidina y 1: 1000 de una tinción de células muertas verde vivo o muertos fijable por 15 min a 4 ° C.
  7. Leer todas las muestras en un citómetro de flujo para determinar la especificidad y el número de células específicas de antígeno.
    1. Lavar exceso secundaria y vivo o muertos de la mancha por centrifugación y resuspender con 150 μL de tampón PBS con azida sódica al 0.05% y 2% de SBF en un citómetro de flujo.
  8. Determinar el número y porcentaje de células antígeno específicas con software de análisis de datos.
    1. Para determinar el porcentaje de células antígeno específicas, utilizar las puertas siguientes en el orden respectivo vivo + linfocitos + (dispersión hacia adelante por dispersión de lado), CD8 + y dímero +. Determinar el dímero + puerta comparando el no cognado a la mancha cognada.
    2. Determinar el porcentaje de células específicas de antígeno en una muestra al restar el porcentaje de dímero + la mancha MHC-Ig cognado de la mancha de MHC-Ig no cognado.
    3. Con este porcentaje de células específicas de antígeno, se multiplican por el número de células contadas, dando el número de células específicas de antígeno resultantes del enriquecimiento y de expansión.
      Nota: Compensación tendrá que configurar en el citómetro de flujo puesto que hay superposición espectral con los fluoróforos en este panel.

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Representative Results

Para completar una exitosa enriquecimiento y expansión de linfocitos T antígeno específicos, la carga de péptido MHC-Ig y moléculas coestimuladoras deben con éxito acoplarse a la partícula de la aAPC. Basado en los 3 métodos de fijación de la partícula, proporcionamos algunos datos representativos para un resultado de procedimiento verbal exitosa (figura 5a). De hecho, si la densidad del ligando es demasiado baja, entonces no habrá efectiva estimulación de células de T CD8 + específica de antígeno cuando se produzca alrededor de espacio lineal entre los ligandos por encima de 100 nm en nuestra experiencia (figura 5b)7.

Además tanto lecturas cuantitativa de anticuerpos fluorescentes y transgénicos expansiones de células T CD8 +, aAPCs nanopartículas puede ser verificada control de calidad por dopaje en cognado transgénicas células de T CD8 + específica de antígeno. Esto puede hacerse por aislamiento de células T CD8 + de un ratón transgénico como un ratón de Pmel que tiene células de T CD8 + específica de antígeno gp100 específicos y doping en un fondo de B6 en una proporción de 1: 1000. Recuento y tinción antes y después de enriquecimiento permiten la enumeración del enriquecimiento de doblez (Figura 6a) y porcentaje recuperación (figura 6b)6. En estos resultados representativos, demostramos que señal-1 sólo aAPCs proporcionan más enriquecimiento eficiente (casi 10 veces) y alrededor del 80% de la célula de recuperación, que se realza sobre aAPCs tradicional señal 1 y 2 que no específica anti-CD28 en la partícula tan bien.

Una vez se han caracterizado suficientemente aAPCs partículas y calidad controlada, entonces puede ser utilizados en el enriquecimiento y expansión de células de T CD8 + específica de antígeno raras de los ratones de tipo salvaje. Para resultados exactos, es crítico contar con reactivos de detección funcional, como el dímero biotinilado. Sobre transgénicos de células T CD8 + para verificar la coloración también puede hacer el control de calidad del dimer biotinilado. Aquí, resultados representativos muestran la coloración positiva con gp100 específicos de células CD8 + T con células T CD8 + B6 como un control de fondo (figura 7). Figura 7 también se demuestra que si hay demasiado alto de los niveles del dimer biotinilado, entonces disminuirá su avidez competir con sí mismo y exhiben enlace mono-Valente.

Después del enriquecimiento y expansión de células T CD8 + de ratón durante siete días, uno podría esperar entre 5 y 50 por ciento específica de antígeno CD8 + las células de T, con casi 20.000 a 200.000 células de T CD8 + específica de antígeno después de comenzar con 5 x 106 células de T CD8 + por condición (Figura 8) 6. específicamente, cuando la coloración de las células de T de CD8 + específica de antígeno, es fundamental conocer la coloración de fondo del dimer biotinilado, donde en este caso es 4,15%; cualquier porcentaje inferior al este de la mancha cognada se considera un resultado negativo (figura 8a). Además, mostrará donde sacar las puertas de la citometría de flujo para determinar el porcentaje real de las células de T de CD8 + específica de antígeno. Esto es importante en casos donde las células de T de CD8 + específica de antígeno no tienen poblaciones distintas (como se muestra en la figura 8a) pero pueden aparecer como un borrón de transferencia amplia.

El mismo proceso puede utilizarse para aislar y estimulan células de T CD8 + específica de antígeno humanas. Control de calidad y resultados similares puede considerarse donde se observan aumentos importantes en los porcentajes y el número de células de T CD8 + específica de antígeno después de sólo una semana de extensión después de la de enriquecimiento (figura 9)5.

Figure 1
Figura 1 : Esquema del proceso de enriquecimiento específico de antígeno y expansión utilizando células de antígeno-presentación de nanopartículas artificiales. En primer lugar, realizar un aislamiento de células T CD8 + no-touch. Luego, añadir aAPCs nanopartículas a las células T CD8 +. Enriquecer con un campo magnético, la cultura y estimular con aAPCs. Por último, detectar células de T CD8 + específica de antígeno enriquecidas y ampliadas por citometría de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: esquema para conjugar cargado de péptido MHC-Ig y moléculas coestimuladoras en la superficie de las partículas magnéticas recubiertas de Amina. Brevemente, Sulfo-SMCC crosslinker se utiliza para funcionalizar la superficie de la partícula magnética con grupos funcionales de maleimida. Ig de MHC y moléculas coestimuladoras simultáneamente son funcionalizadas con reactivos de Traut para producir grupos de tiol funcionales. Las partículas activadas y las señales de la proteína son reaccionó juntos y luego se lava para producir antígeno específica artificial presentadoras de antígeno célula nanopartículas magnéticas. Esta figura ha sido modificada desde material suplementario de la publicación de nuestro laboratorio en Nano Letras7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: esquema para conjugar cargado de péptido MHC-Ig y moléculas coestimuladoras en la superficie de las partículas magnéticas recubiertas de NHS. Brevemente, las partículas recubiertas de NHS son reaccionó junto con cargado de péptido MHC-Ig y moléculas coestimuladoras y luego se lava para producir antígeno específica artificial presentadoras de antígeno célula nanopartículas magnéticas. Esta figura ha sido modificada desde material suplementario de la publicación de nuestro laboratorio en Nano Letras7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Manual de reparacion para conjugar cargado de péptido MHC-Ig y moléculas coestimuladoras en la superficie de las partículas magnéticas anti-biotin-revestido. Ig de MHC y moléculas coestimuladoras son funcionalizadas con NHS-biotina para producir grupos funcionales de biotina. Entonces las partículas recubiertas de biotin anti están reaccionadas junto con el funcionalizados cargado de péptido MHC-Ig y moléculas coestimuladoras. Luego, estas partículas se lavan para producir antígeno específica artificial presentadoras de antígeno célula nanopartículas magnéticas. Esta figura ha sido modificada desde material suplementario de la publicación de nuestro laboratorio en Nano Letras7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Eficiencia verbal es fundamental para el enriquecimiento y expansión de linfocitos T antígeno específicos. (a) base de datos representantes de eficiencia verbal con los métodos tres verbal a tres diferentes partículas magnéticas descritas en el documento: partículas recubiertas de Amina, partículas recubiertas de NHS y revestido de biotin anti partículas. Cada punto de datos representa una técnica de preparación de diferentes partículas y barras de error representan SEM (b) Cómo afecta la densidad del ligando transgénicos CD8 + estimulación de la célula de T, donde se representa la densidad del ligando como espacio lineal entre ligandos en nanómetros en 600 nm y 50 nm aAPCs (n = 5 y barras de error representan SEM). Esta figura ha sido modificada desde la publicación de nuestro laboratorio en Nano Letras7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Control de calidad de enriquecimiento aAPC. Transgénico Pmel gp100-T CD8 + las células específicas fueron dopadas en una proporción de 1: 1000 en wildtype de células T CD8 + B6. (a) doblez enriquecimiento fue medido mediante citometría de flujo tras el enriquecimiento por el marcador de congenic la coloración Thy1.1 y CD8. Aquí fue una comparación entre partículas única señal 1 o Db-Ig cargado con gp100, tradicional señal 1 y 2 partículas o Db-Ig con gp100 y anti-CD28 y partículas no cognado señal 1 y 2. (b) las células se contaron también antes y después medir la recuperación de la célula por cada uno de los métodos. Datos representan tres experimentos independientes y representan barras de error SEM datos combinados se midió por ANOVA unidireccional con post-test de Tukey (*p< 0.05, **p< 0.01). Esta figura ha sido modificada desde la publicación de nuestro laboratorio en Nano Letras6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7 : Control de calidad de dimer biotinilado. Gp100-específicos de células T CD8 + fueron aisladas de un ratón transgénico de Pmel y teñidos en 100 μl de PBS con tres concentraciones de biotinilado Db-Ig cargado con gp100 y APC anti-CD8a, utilizando células de T CD8 + B6 tipo salvaje como control negativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8 : Enriquecimiento y expansión de antígenos específicos de células CD8 + T. B6 wildtype de células T CD8 + fueron enriquecidas con cualquier señal de sólo 1 (cargado con TRP2 Kb-Ig) o la señal 1 y 2 (Kb-Ig con TRP2 y anti-CD28 conjugado a la superficie de la partícula). Señal 2 entonces fue agregado a la fracción enriquecida de aAPCs única señal 1 y todas las células fueron cultivadas durante 7 días. (a) de células T CD8 + se tiñen gated en una mancha fluorescente de vivo/muerto, entonces residencial CD8 + y KbTRP2 + y en comparación con un no cognado Kb-Ig para detectar antígenos específicos de células CD8 + T. (b) porcentaje y (c) el número de células T CD8 + específicos TRP2 así podría ser determinado, donde un mayor porcentaje y el número de antígenos específicos de células CD8 + T pudo detectarse desde el enfoque de enriquecimiento sólo de señal 1 (n = 7, barras de error representan la desviación estándar, prueba de dos colas apareadas t *p < 0.05, **p < 0.01). Esta figura ha sido modificada desde la publicación de nuestro laboratorio en Nano Letras6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9 : Enriquecimiento y expansión de células de T CD8 + específica de antígeno humanas. (a) representante flujo cytometry parcelas en el día 0 antes de que el enriquecimiento y el día 7 muestran los efectos dramáticos de enriquecer y expandir células de T CD8 + específica de antígeno de donantes sanos con nanopartículas tradicional aAPCs donde Ig A2 cargado de ESO1 NY y A2-Ig cargados de MART1 antígenos aparecen. (b) esto genera altos porcentajes (~ 10-20%) y números (0.5-1 x 106) de las células de T de CD8 + específica de antígeno por día 7 (n = 3 de donantes independientes, barras de error representan SEM). Esta figura ha sido modificada desde la publicación de nuestro laboratorio en ACS Nano5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Hemos creado una tecnología de aislamiento de novela células de T específicas de antígeno basada en nanopartículas artificiales antígeno que presenta las células (aAPCs). Nanopartícula aAPCs péptido-carga del MHC en la superficie que permite la Unión de células de T específicas de antígeno y activación junto con activación coestimuladoras. aAPCs también son paramagnéticos y así se puede utilizar para enriquecer raros antígenos específicos de células T mediante un campo magnético. Hemos optimizado y estudió las propiedades clave de nanopartículas de tamaño, densidad de ligando y opción de ligando y su influencia en enlace, enriquecimiento, activación y enriquecimiento de la célula (Archivo complementario 1-caja 1).

Así, los resultados de procedimiento de enriquecimiento y expansión en la expansión de células de T de CD8 + específica de antígeno de varios co-participan produciendo antígeno-específica porcentajes tan alto como 60% y puede ser utilizados en configuraciones murinos y humanos (Archivo suplementario 2-caja 2 ). Tales altos números y porcentajes de linfocitos T antígeno específicos permiten la caracterización de la respuesta inmune de las enfermedades (por ej., cáncer, autoinmunes, etc.), permiten el descubrimiento de nuevas dianas inmunes y mecanismos y ofrecen la oportunidad de ser utilizan en inmunoterapia adoptiva. Un ejemplo de una aplicación específica es secuencia del tumor de un paciente, identificar mutaciones, localizar posibles MHC-aglutinantes de las secuencias mutantes, producir aAPCs con esos antígenos candidato superior y luego utilizar la aAPCs para determinar si el paciente tiene alguna neoantígenos tumorales.

De hecho, las limitaciones metodológicas han sido una barrera clave para estudiar e identificar las respuestas específicas de antígeno. Las técnicas actuales (a) requieren procedimientos de intensidad substancial de tiempo y trabajo, (b) presente dificultad en el mantenimiento de líneas celulares tales como la necesidad de recoger las células dendríticas autólogas, (c) requieren semanas de expansión de la célula de T antes de obtener resultados, (d) resultado baja especificidad (1-2%) y números bajos de T CD8 + específica de antígeno las células, (e) a menudo con la señal de fondo significativo, (f) los T CD8 + las células y que se producen a menudo no puedan utilizarse o estudiado en otros ensayos. Uno de los métodos requiere inmunización con el antígeno antes de ELISPOT para caracterizar la presencia de respuesta antígeno específica14,15,16,17. Otro método utilizando plásmidos de expresión de gene de mini tandem para transfectar las células presentadoras de antígeno requiere multiplexación manchas tetrámero con citoquinas + respuestas como IFNγ para aumentar la sensibilidad18. Incluso péptido pulsación endógena presentadoras de antígeno las células en cultivo en vitro , sólo resulta en un aumento de 0,5% en especificidad de antígeno15.

Nuestro enfoque soluciona estas limitaciones metodológicas y por lo tanto puede actuar como una herramienta diagnóstica y terapéutica. Pasos críticos para asegurar el enriquecimiento de la célula de T de CD8 + específica de antígeno y la expansión son a carga MHC-Ig con antígeno péptido 1) efectivamente, 2) conjugado señales estimulantes a la superficie de las nanopartículas, 3) las partículas se unen a las células T, 4) enriquecer las células atadas las nanopartículas con un campo magnético, 5) ampliar eluídas enlazado a nanopartículas células de T en la cultura y 6) detectar antígeno específico T CD8 + las células en el día 7 con biotinilado, cargado de péptido MHC.

Los principales problemas que surgen en el protocolo de enriquecimiento y expansión surgen de producción inadecuada o reactivos de detección caducado o nanopartículas aAPCs. Asegúrese de que el dímero biotinilado puede manchar las células de T CD8 + específica de antígeno con las pruebas en células de T CD8 + específica de antígeno transgénicas. Si el péptido-MHC-CI no tiene un modelo de ratón transgénico correspondiente, puede ser útil cargar un péptido control positivo y el control positivo para verificar carga de la prueba. Sin embargo, algunos péptidos no pueden cargar en el MHC-Ig; Esto puede ser simulado con algoritmos de carga de MHC como Net-MHC, o experimentalmente con RMA-celular basado en análisis13. estabilidad de partículas aAPC puede disminuir después de 6 meses, por lo que si hay cierta variabilidad en los resultados de enriquecimiento y expansión, luego otro fluorescente se pueden realizar análisis de lector de la placa para verificar la estabilidad.

En un futuro trabajo, nuestro objetivo es ampliar la capacidad, la amplitud y la profundidad del ensayo. Estamos trabajando en aumentar el rendimiento y la capacidad de multiplexar con múltiples antígenos investigados en una vez en un formato de placa de 96 pocillos. Actualmente, la principal limitación es que sólo unos pocos antígenos pueden ser investigados al mismo tiempo. Estamos trabajando esto al investigar cómo influye el tamaño de la aAPC y ligando la densidad de la partícula en enriquecimiento. Además, estamos estudiando cómo diversa célula composiciones efecto T CD8 + células extensión dentro de la cultura. Finalmente, pretendemos imitar esta tecnología dentro de la clase de MHC II para poder enriquecer y ampliar las células de CD4 + T antígeno-específica.

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Disclosures

Los autores declaran la siguiente competencia interest(s) financieros: bajo un acuerdo de licencia entre NexImmune y la Universidad Johns Hopkins, Jonathan Schneck tiene derecho a una cuota de regalías recibidas por la Universidad en las ventas de los productos descritos en este artículo. Él era también un fundador de NexImmune y posee acciones en la empresa. Se desempeña como miembro de Junta Directiva y Consejo Asesor científico de NexImmune. Los términos de estos acuerdos han sido revisados y aprobadas por la Universidad Johns Hopkins con arreglo a sus políticas de conflicto de intereses.

Acknowledgments

J.W.H. agradece el centro de entrenamiento de NIH cáncer nanotecnología en el Instituto de Johns Hopkins la nanobiotecnología, la nacional Science Fundación graduados beca de investigación (DGE-1232825) y la Fundación de arcos para apoyo de becas. Este trabajo fue financiado por el apoyo de los institutos nacionales de salud (R21 P01-AI072677, R01-CA108835,-CA185819), iniciativa de innovación TEDCO/Maryland y la Fundación de Coulter (JPS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein BD Biosciences 551263
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig BD Biosciences 551323
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein BD Biosciences 550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932257
Purified Human Beta 2 Microglobulin Bio-Rad PHP135
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles Micromod 79-01-102
Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm Ocean Nanotech SN0200 
Anti-Biotin MicroBeads UltraPure Miltenyi 130-105-637
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217
Sulfo-SMCC Crosslinker  ProteoChem c1109-100mg
2-Iminothiolane hydrochloride Sigma-Aldrich I6256 Sigma 
96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene Corning 3875
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain  Clone  R26-46   BD Biosciences 553434
FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG  Clone  G192-1 BD Biosciences 554026
B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice Jackson Laboratory 005023
C57BL/6J (B6 wildtype) mice Jackson Laboratory 000664
CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse Miltenyi 130-104-075
MS Columns Miltenyi 130-042-201
LS Columns Miltenyi 130-042-401
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE Biolegend 405203
N52 disk magnets of 0.75 inches  K&J Magnetics DX8C-N52
APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 Biolegend 100711
LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation  ThermoFisher L-34969

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References

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