Artigo de método

Estabelecimento do modelo humanizado duplo do rato de TK-NOG para a patogénese HIV-associada do fígado

DOI:

10.3791/58645

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11 de setembro de 2019

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1Department of Pharmacology and Experimental Neuroscience, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Pathology and Microbiology, University of Nebraska Medical Center

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo fornece um método confiável para estabelecer camundongos humanizados com o sistema imunológico humano e células hepáticas. Os ratos imunodeficientes reconstituídos duplos conseguidos através da injeção pseudoaneurysms de hepatócitos humanos e de pilhas de haste hematopoietic de CD34+ são suscetíveis à infecção do vírus-1 da imunodeficiência humana e recapitulam dano de fígado como observado em Doentes infectados pelo VIH.

Resumo

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Apesar da expectativa de vida aumentada dos pacientes contaminados com o vírus de imunodeficiência humana-1 (HIV-1), a doença de fígado emergiu como uma causa comum de sua morbosidade. A Imunopatologia hepática causada pelo HIV-1 permanece elusiva. Os modelos animais pequenos do xenograft com hepatócitos humanos e o sistema imunitário humano podem recapitular a biologia humana da patogénese da doença. Nisto, um protocolo é descrito para estabelecer um modelo humanizado duplo do rato com os hepatócitos humanos e o transplante de CD34+ hematopoietic/pilhas do progenitor (hspcs), para estudar a Imunopatologia do fígado como observado em pacientes HIV-contaminados. Para conseguir a reconstituição dupla, o macho TK-NOG (NOD. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Sug TG (ALB-tk) 7-2/shijic) os camundongos são injetados intraperitonealmente com doses de ganciclovir (GCV) para eliminar as células hepáticas transgênicas do camundongo, e com treosulfano para condicionamento não mieloablativo, ambos facilitar o desenvolvimento de hepatócitos humanos (HEP) e do sistema imunológico humano (HIS). Os níveis da albumina humana (ALB) são avaliados para o Engraftment do fígado, e a presença de pilhas imunes humanas no sangue detectado pela citometria do fluxo confirma o estabelecimento do sistema imunitário humano. O modelo desenvolvido utilizando o protocolo aqui descrito assemelha-se a múltiplos componentes de lesão hepática por infecção pelo HIV-1. Seu estabelecimento poderia revelar-se essencial para estudos da co-infecção do vírus de hepatite e para a avaliação de antivirais e de drogas antiretroviral.

Introdução

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Desde o advento da terapia antirretroviral, houve uma diminuição substancial nos óbitos relacionados à monoinfecção pelo HIV-1. Noentanto, adoença hepática surgiu como uma causa comum de morbidade em pacientes infectados pelo HIV1,2. Coinfecções de vírus da hepatite com infecção pelo HIV-1 são mais comuns, representando 10%-30% das pessoas infectadas pelo HIV nos Estados Unidos3,4,5.

A especificidade do hospedeiro do HIV-1 e dos vírus da hepatite limita a utilidade de pequenos modelos animais para estudar doenças infecciosas específicas do homem ou para investigar múltiplos aspectos da patogênese hepática associada ao HIV-1. Camundongos imunodeficientes que permitem o Engraftment de células humanas e/ou tecidos (denominados modelos humanizados do camundongo) são modelos animais aceitáveis para estudos pré-clínicos6,7,8. Desde a introdução de camundongos humanizados no início dos anos 2000, vários estudos pré-clínicos de toxicidade hepática humana colestática, patógenos específicos do homem, incluindo HIV-1 e distúrbios neurocognitivos associados ao HIV, vírus Epstein Barr, hepatite e outros doençasinfecciosas, foraminvestigadas nesses camundongos6,9,10,11. Os modelos múltiplos do rato para CD34+ hspcs e/ou a transplantação humana do hepatócito têm sido desenvolvidos por muito tempo e melhoraram sobre o tempo para estudar a patogénese da doença do vírus de hepatite B (HBV)-doença de fígado associada12, 13 anos de , 14. vários modelos para hspc e hepatócitos humanos (HEP) transplante são baseados em cepas, conhecido como Nog (Nod. CG-prkdcscid Il2rgtm1Sug/jictac)8,13, NSG (Nod. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj)15, Balb/C-Rag2-/- γc-/- (Rag2TM 1.1 FLV Il2rgTM 1.1 FLV/j)12, e Fah-/- Nod rag1-/- il2rγnull mouse16. No entanto, cada modelo tem suas próprias vantagens e limitações; por exemplo, AFC8 camundongos humanizados duplos para HEPs e células-tronco humanas (HSCs) em um Balb/C-Rag2-/- γc-/- background permite o bem sucedido Engraftment de células imunes e hscs, mas há uma ausência de um antígeno-específico T-e B-Cell resposta neste modelo12. As principais preocupações em reconstituir camundongos humanizados duplos incluem o Engraftment suboptimal, a falta de modelos adequados para suportar diferentes tecidos, condições incompatíveis, rejeição imune, ou doença do enxertocontrao hospedeiro (DECH), e técnicas dificuldades, como manipulações de risco com recém-nascidos e altas taxas de mortalidade devido a anormalidades metabólicas13.

Embora os camundongos humanizados tenham sido usados para a pesquisa por HIV há muitos anos17,18,19, o uso de camundongos humanizados para estudar os danos hepáticos causados pelo HIV-1 tem sido limitado20. Nós relatamos previamente o estabelecimento de um modelo humanizado duplo do rato de TK-NOG e de sua aplicação na doença de fígado HIV-associada8. Este modelo mostra o Engraftment robusto do fígado e das pilhas imunes e recapitula a patogénese da infecção do HIV. Esta discussão apresenta um protocolo detalhado, incluindo os passos mais críticos no transplante de hepatócitos humanos. Uma descrição dos HSPCs exigidos para um Engraftment bem sucedido dos HEPs e o estabelecimento de um sistema imune funcional em ratos de TK-NOG é apresentada igualmente. O uso destes ratos para estudar o imunopatogênese HIV-associado do fígado é detalhado. Os ratos masculinos de TK-Nog que carreg um tipo fígado-específico do vírus de palavra simples de herpes-1 transgene da quinase do timidina (HSV-tk) são usados. As células hepáticas do rato que expressam este transgene podem ser facilmente abladas após uma breve exposição a uma dose não tóxica de GCV. As pilhas de fígado humanas transplantadas são mantidas estàvel dentro do fígado do rato sem medicina exógena21. Os camundongos também são pré-condicionados com doses nonmyeloablative de treosulfan para criar um nicho na medula óssea do rato para células humanas8. Os camundongos imunodeficientes TK-NOG são injetados intrasplenicamente com HEPs e HSPCs multipotentes. Os ratos são monitorados regularmente para a reconstituição do sangue e do fígado pelo imunofenotipagem do sangue e pelas medidas de níveis da humano-albumina do soro, respectivamente. Camundongos com uma reconstituição bem-sucedida de mais de 15% para ambas as células imunes humanas e HEPs são injetados intraperitonealmente com HIV-1. O efeito do HIV no fígado pode ser avaliado tão cedo quanto 4-5 semanas pós-infecção. É importante notar que, porque o HIV-1 é usado, todas as precauções necessárias devem ser tomadas durante o manuseio do vírus e injetá-lo em camundongos.

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Protocolo

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Este protocolo foi aprovado pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) no centro médico da Universidade de Nebraska.

Nota: Obter a aprovação do IACUC local antes de realizar experimentos em animais.

1. processamento de sangue do cordão umbilical e o isolamento de HSPCs humanos

  1. Realize todas as etapas do protocolo condições estéreis em armários de fluxo laminar.
  2. Tome o sangue do cordão umbilical (CB) coletado em tubos heparinizados e faça o volume até 35 mL adicionando soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS). Mergulhe a amostra em cima do meio de separação de linfócitos (LSM) como ilustrado na Figura 1 e Centrifugue o LSM com o CB em camadas em 400 x g por 35 min a 4 ° c sem freios.
    Nota: diluir o sangue com cuidado e suavemente para evitar a mistura na interface.
  3. Remova o LSM superior e a camada de plasma com cuidado e transfira a relação Buffy branca do revestimento a um tubo novo usando uma pipeta de transferência.
  4. Ressuscita o casaco Buffy em 30-40 mL de tampão gelo-frio (PBS + 0,5% de albumina sérica bovina [BSA] + 2 mM de ácido etilenodiaminotraacético [EDTA]). Usando uma pipeta, combine 20 μl da suspensão da pilha com 20 μl do azul do Tripan de 0,4% e pipeta 10 μL da mistura na abertura exterior de uma das duas câmaras de uma corrediça de contagem e insira a corrediça em um contador automatizado da pilha para contar as pilhas.
    Nota: Use o tampão Ice-Cold em todas as etapas, porque ajuda a manter as pilhas viáveis.
  5. Centrifugue as células a 300 x g durante 10 min a 4 ° c e aspire o sobrenadante com cuidado. Em seguida, adicione 300 μL de tampão gelo-frio.
  6. Adicionar 100 μL de reagente de bloqueio de receptores FC humanos e 100 μL de microgrânulos conjugados de anticorpo CD34 monoclonais de camundongo para até 1 x 108 células (ver a tabela de materiais). Incubar durante 30 min a 4 ° c, adicionar 10 mL de tampão gelado para lavar as células e centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° c.
    Nota: Escale isso de acordo com o número da célula se mais de 1 x 108 células estiverem presentes.
  7. Retire cuidadosamente o sobrenadante, resuma a pelota em 500 μL de tampão e prossiga com a etapa de separação magnética para enriquecer os HSPCs.
  8. Coloque uma coluna LS de seleção positiva (consulte a tabela de materiais) no campo de classificação de célula ativada por magnético e passe-a com 3 ml de buffer.
  9. Carregue a amostra para a coluna ls que pode Trap microesferas ligado ao humano CD34 + em amostras e permitir que ele flua a influência da gravidade no tubo de coleta.
  10. Lave a coluna 3x com tampão e colete o eluir no mesmo tubo da coleção do CD34- fração das pilhas.
  11. Mergulhe a coluna com 5 ml de tampão para eluir as pilhas de CD34+ em um tubo de coleção novo. Repita o procedimento para obter uma pureza de > 90%.
  12. Conte as pilhas CD34+ eluidas usando o corante azul de Tripan em um Hemocytometer. Após a contagem, Centrifugue as pilhas CD34+ em 300 x g por 5 min e descarte o sobrenadante.
  13. Resuspend as pilhas de CD34+ em 25 μL de PBS para que uma injeção seja usada imediatamente no transplante ou criopreservar as pilhas em uma concentração de 1-2 milhões/ml no meio de congelação (meio do Instituto do Memorial de Roswell Park [meio de RPMI 1640] + 50% fetal soro bovino (FBS) + 10% dimetil sulfóxido [DMSO]) para posterior utilização no transplante.
    Nota: Sempre recontar células viáveis antes de usá-los em transplante.
  14. Para verificar a pureza do CD34+ elute, tomar 50 μL da suspensão e incubar-lo com 10 ΜL de PE-conjugado anti-humano CD34 anticorpo para 30 min a 4 ° c. Após a incubação do anticorpo, lave as células manchadas com PBS, ressuscitem-as em 100 μL de PBS e, em seguida, proceder para realizar a citometria de fluxo. Adicione um tubo adicional das pilhas sem o anticorpo para projetar a porta no cytometer do fluxo.
  15. Após a aquisição, analise os dados selecionando a região de interesse em um gráfico de dispersão direta (FSC) e dispersão lateral (SSC), seguido de gating para células individuais em parcelas FSC-area e FSC-Height. Pilhas CD34-positive da porta em únicas pilhas no canal do PE e no lote da SSC-área.

2. preparação de hepatócitos humanos para transplante

  1. Retire os hepatócitos criopreservados do nitrogênio líquido, mergulhe rapidamente o frasco no banho de água e descongele por aproximadamente 90-120 s.
  2. Retire a tampa do frasco para injetáveis e despeje os hepatócitos descongelados no tubo cônico de 50 mL do meio de descongelar aquecido.
  3. Suspenda as células balançando o tubo 50 mL com a mão por alguns segundos.
    Nota: Não vórtice o tubo.
  4. Pellet as células em 100 x g por 8 min à temperatura ambiente. Lave as células peletizadas em PBS com 0,1% de BSA e a piscina com HSPCs frescos ou descongelados (razão 10:1) em PBS em um volume final de 80 μL/mouse.

3. manipulação animal, triagem, genotipagem e tratamento para HSPC humano e transplante de hepatócitos

  1. Manuseio de animais
    1. Como resultado de imunodeficiência grave, raça, casa, e lidar com camundongos TK-NOG condições assépticas.
    2. Sempre use um jaleco, luvas, capas de sapato e uma máscara facial para prevenir a infecção com microrganismos potencialmente patogênicos.
    3. Use luvas estéreis e instrumentos para a cirurgia e manuseie os animais assepticamente durante toda a cirurgia.
  2. Selecionando camundongos TK-NOG para o experimento
    1. Manter a colônia de estirpe TK-NOG através da criação de camundongos fêmeas TK-NOG com littermates masculinos não-TK-NOG e selecionar descendentes transgênicos por genotipagem.
      Nota: Realize a genotipagem (ver etapa 3,3) para determinar a presença ou ausência do transgene em camundongos machos e fêmeas recém-nascidos no momento do desmame.
    2. Machos seletos em 6-8 semanas da idade para a transplantação devido a sua sensibilidade elevada à depleção GCV-negociada de HSV-TK transgene-expressando hepatócitos21.
    3. Ear-tag os ratos no momento do desmame ou cirurgia para facilitar a identificação. Anote o peso e o estado de saúde dos animais.
  3. Genotyping para a presença do transgene de HSV-TK usando a reacção em cadeia quantitativa do polymerase do tempo real
    1. Realize a genotipagem no momento do desmame (geralmente às 3-4 semanas de idade). Para Genotyping, corte uma parte da orelha de rato em um armário de segurança biológico do fluxo laminar para manter a esterilidade e extraia o ADN genomic usando um jogo genomic do isolamento do ADN.
    2. Amplificar o DNA genómico extraído da peça de orelha em uma mistura de reação de 20 μL para a tela para HSV-TK transgene o controle do promotor de albumina humana, adicionando 1 μL de primer dianteiro 5 '-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3 ', 1 μL de primer reverso 5 '-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3 ', 0,5 μL de FAM Probe 5 ′-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3 ', e 10 μL de Master Mix em um instrumento de reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR)22.
    3. Ajuste os ajustes do PCR do tempo real como segue: 60 ° c para 30 s (estágio do preread), 95 ° c por 10 minutos (estágio da preensão), 40 ciclos de 95 ° c para 15 s e 60 ° c para 1 minuto (estágio do PCR), e 60 ° c para 30 s (estágio do postread).
      Nota: Um ciclo de limiar (TC) abaixo de 22 é considerado positivo para o transgene HSV-TK.
  4. Tratamento com ganciclovir e treosulfan
    1. Usando a agulha de 27 G, injete os camundongos TK-NOG com injeções intraperitoneal de GCV (6 mg/kg) 2x por dia no dia 7 e no dia 5 em 100 μL de soro fisiológico antes da cirurgia para esgotar as células parenquimatosas transgênicas dos camundongos (como mostrado na estratégia experimental na Figura 2)23 .
    2. Nos dias 3, 2 e 1 antes da cirurgia, camundongos pré-condicionantes com doses intraperitoneal nonmyeloablative do treosulfan (1,5 g/kg/day) em 100 μL do soro fisiológico, usando uma agulha de 27 G.
    3. Um dia antes da cirurgia, desenhe duas a três gotas (~ 100 μL) de sangue da veia submandibular, picando-a com uma lanceta de 5 mm, e isolar o soro por centrifugação (1.500 x g por 10 min a 4 ° c) para o ensaio de alanina AMINOTRANSFERASE (Alt) para avaliar o degr de danos hepáticos.
  5. Preparação para a cirurgia
    1. Use Clippers para raspar a pele do mouse em torno do local da incisão (à esquerda da parede peritoneal) antes da cirurgia.
    2. Ajuste o fluxo de oxigênio para 1 L/min e o fluxo de isoflurano para 3%-5% em uma câmara de indução usando uma máquina de anestesia do mouse. Coloque um rato de cada vez na câmara de indução para anestesia.
    3. Fixar a extremidade de um tubo de extensão estéril (com uma capacidade de retenção de 550 μL de suspensão; ver a tabela de materiais para especificações) a uma agulha de 30 G e a outra extremidade a uma seringa de 1 ml.
    4. Encha a seringa com a suspensão (80 μL/rato) de HEPs e HSPCs agrupados (ver secção 2), encaixe a seringa no entalhe de uma pipeta de dosagem repetitiva e ajuste o dispensador para dispensar 10 μL em cada prensa.
    5. Uma vez que os camundongos são anestesiados (geralmente após 3-4 min), alterne o fluxo de isoflurano para o cone do nariz e reduza a vazão de isoflurano para 2%-3%.
  6. Transplante intrasplenic de HSPCs humanos e hepatócitos em camundongos
    1. Realize todas as etapas da cirurgia em um armário do fluxo laminar circunstâncias estéreis.
    2. Coloc um Drape estéril limpo sobre a superfície de funcionamento e esfregue o lado esquerdo do corpo de cada rato com o Povidone-Iodo de 10% seguido pelo álcool do isopropílico de 70%, antes de fazer uma incisão.
    3. Faça uma pequena incisão (~ 1-1,5 cm de comprimento e 5 mm de profundidade) na pele, músculo e peritônio à esquerda da parede peritoneal com a tesoura tipo Vanna para entrar na cavidade peritoneal aproximadamente 5 mm abaixo da borda inferior da caixa torácica.
    4. Localize o baço, puxe-o ligeiramente com fórceps para a área de operação para facilitar o acesso, e insira a agulha de 30 G no pólo inferior do baço.
    5. Desbloqueie o êmbolo da pipeta doseadora e dispense 10 μL do volume de cada vez, com um limite de 60-80 μL por baço. Retraia a agulha lentamente e grampeie o baço com grampos de ligação usando um aplicador de ligadura.
    6. Empurre o baço de volta para a cavidade do corpo com os aplicadores com ponta de algodão umedados com PBS estéril.
    7. Feche a camada muscular da parede abdominal usando uma sutura absorvível padrão de sutura interrompida (não contínua). Realize o fechamento da pele com um padrão de sutura interrompido usando suturas não absorvíveis.
    8. Use almofadas de circulação da água morna para proteger os ratos da hipotermia após a cirurgia.
    9. Remover suturas não absorvíveis 10-14 dias após a cirurgia.
  7. Cuidados pós-operatórios
    1. Quando o animal transplantado acordar, injete a buprenorfina analgésica (0,1 mg/kg) intraperitonealmente, 2x por dia durante 3 dias consecutivos.
    2. Observe os animais pelo menos 1x por dia até que retornem às condições físicas normais.
      Nota: Verifique o peso corporal de cada animal, uma vez que alguns camundongos podem perder peso pós-cirurgia. Os camundongos normalmente recuperam seu peso original em 1 a 2 semanas.

4. validação do Engraftment do fígado humano por ELISA e pelo sistema imunitário humano pelo fluxo cytometry

Nota: Avalie a reconstituição do fígado humano e do sistema imunológico mensalmente, iniciando 1 mês pós-transplante por ensaio imunoenzimático (ELISA) e citometria de fluxo, respectivamente.

  1. Colete amostras de sangue da veia submandibular usando lancetas em tubos de EDTA, e Centrifugue a 1.500 x g por 10 min a 4 ° c. Isolar o soro para verificar os níveis de albumina humana para avaliar a eficiência do Engraftment do fígado do rato para hepatócitos humanos transplantados, utilizando um conjunto de quantificação ELISA de albumina humana (ver a tabela de materiais) seguindo o Instruções.
    Nota: Não descarte o pellet e use as células peletizadas para uma análise de citometria de fluxo para avaliar a reconstituição do sistema imunológico humano.
  2. Ressuscitem o pellet celular sem soro em 35 μL de tampão FACS (PBS + 2% FBS) e corados com 5 μL de CD45 (concentração 0,5 mg/mL), 5 μL de anticorpos humanos específicos CD45 (0,1 mg/mL), CD3 (0,2 mg/mL), CD8 (0,1 mg/mL) e CD19 (0,5 mg/mL) , e 20 μL de CD4 (0,25 mg/mL) e CD14 (0,25 mg/mL) cada um por 30 min a 4 ° c, para verificar o desenvolvimento de um sistema imunológico funcional de CD34+ hspcs.
    Nota: Considere adicionar um tubo adicional de células não manchadas para determinar a gating das células manchadas.
  3. Após a incubação, transfira a suspensão manchada (~ 100 μL) em um tubo de citometria de fluxo de fundo redondo de poliestireno e use 2 mL de tampão de Lise 1x (veja a tabela de materiais) diluindo 1 parte do tampão de Lise 10x com 9 partes de água destilada e incubando 10- 15 min para lyse glóbulos vermelhos.
    Nota: observar a turbidez para avaliar a Lise das células vermelhas do sangue. Uma vez que a amostra se torna desobstruída, o lysis está completo.
  4. Após o lysis, adicione 3 mL do tampão de FACS no tubo e Centrifugue -o em 300 x g em 4 ° c por 5 minutos para começ um pellet. Repita a lavagem adicionando 3 mL de tampão FACS ao pellet e Centrifugue a 300 x g a 4 ° c por 5 min.
  5. Fixar as células na recém-feita 1% paraformaldeído (PFA) e adquirir células manchadas no citometro de fluxo, analisado com software de fluxo.
  6. Para a análise, selecione os linfócitos que gating em um lote de FSC/SSC, seguido pela única-pilha que gating na FSC-área/FSC-altura.
  7. Promova, porta para o CD45 humano-específico (hCD45) na população da único-pilha e inclua o rato-específico CD45 (mCD45) para a exclusão das pilhas da origem murino. Strategize a gating da população manchada baseada no gating de pilhas unmanchadas.
  8. Porta hCD45+ Cells para determinar a frequência de células T CD3+ e células CD19+ B. Células T da porta para determinar os subconjuntos CD4 e CD8. Para avaliar monócitos, portão em hCD45 para determinar CD14+ monócitos.

5. infecção por HIV de camundongos TK-NOG e seu efeito sobre o fígado humano e sistema imunológico

  1. Manuseie o vírus HIV-1 e todos os camundongos infectados em uma instalação de nível 2 de biossegurança designada.
    Atenção: Autoclave e descarte todos os resíduos infectados pelo HIV em sacos de dupla Biohazard. Por razões de segurança, use luvas resistentes ao corte ao entregar camundongos infectados pelo HIV.
  2. Use equipamentos de proteção individual (EPI), incluindo um vestido de Coverall descartável, capas de sapato, uma máscara facial, e luvas duplas em todos os momentos enquanto trabalhava com o vírus.
  3. Selecione camundongos com uma reconstituição de mais de 15% das células CD45+ humanas (testadas na etapa 4,7) e com a presença de albumina humana no soro para infecção pelo HIV-1 (testado na etapa 4,1).
  4. Injete os camundongos com 1 x 103 a 1 x 104 cultura do tecido doses infecciosas 50 (TCID50) HIV-1ADA em um volume de 100-200 μl por rato, intraperitoneally.
  5. Eutanizar os camundongos infectados pelo HIV 5 semanas após a infecção pelo uso de isoflurano (com uma concentração de vapor de isoflurano de > 5%).
  6. Após a eutanização dos camundongos, coletar sangue em tubos de EDTA por uma punção cardíaca para o isolamento do soro, para ver o efeito do HIV-1 no fígado, avaliando os níveis de albumina específicos do homem por ELISA (ver passo 4,1) e células sanguíneas para verificar se há alterações no imune humano células utilizando citometria de fluxo (ver passos 4,2-4,8).
    Nota: Avalie a carga viral periférica 5 semanas pós-infecção em um bioanalisador para confirmar se os camundongos estão infectados.
  7. Depois de extrair sangue, extirpar o fígado dos ratos eutanasiados.
  8. Para a excisão do fígado, expor a cavidade abdominal, fazendo uma incisão de 1,5-2 cm de comprimento e 0,5 cm de profundidade na pele, músculos e peritônio, a partir do xyphoid. Faça um corte perpendicular à coluna vertebral entre o fígado e o diafragma. Levante o fígado e cortar todas as membranas anexá-lo ao estômago e intestinos.
  9. Coletar e fixar o fígado em 4% paraformaldeído durante a noite e seguir um protocolo imunoistoquímico padrão para avaliar o efeito do HIV em CK18+ hepatócitos, usando o anticorpo humano-específico CK188.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O estabelecimento de um modelo humanizado duplo do rato com fígado humano e pilhas imunes pode facilmente ser monitorado em cada etapa com ELISA muito simples e cytometry do fluxo, respectivamente. A citometria de fluxo é realizada regularmente para avaliar o desenvolvimento de um sistema imunológico funcional e para ver o efeito da infecção pelo HIV nas células imunes. Em camundongos humanizados duplos, o desenvolvimento de células imunes funcionais pode variar de 15% a 90% da porta do l...

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Discussão

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O fígado está comprometido e danificado em pacientes infectados pelo HIV24. Modelos experimentais de animais pequenos para o estudo de doenças hepáticas humanas na presença de HIV-1 é extremamente limitado, apesar da disponibilidade de alguns modelos animais cotransplantados com CD34+ hspcs e hepatócitos7,12, a 25. Em experimentos in vitro, os hepatócitos são mostrados para ter infecção por HIV...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de saúde conceder R24OD018546 (para L.Y.P. e SG). Os autores gostariam de agradecer a Weizhe li, Ph.D., pela ajuda em procedimentos cirúrgicos, Amanda Branch Woods, B.S., Yan Cheng para imunohistologia, membros da unidade de pesquisa de citometria de fluxo da UNMC diretor Phillip Hexley, Ph.D., Victoria B. Smith, B.S., e Samantha Wall, B.S., UNMC avançada microscopia membros do núcleo da instalação Janice A. Taylor, B.S., e James R. talaska, B.S., para o apoio técnico. Os autores reconhecem os Drs. Mamoru Ito e Hiroshi Suemizu da CIEA por fornecerem camundongos TK-NOG e o Dr. Joachim Baumgart por fornecerem treosulfan. Os autores agradecem ao Dr. Adrian Koesters, UNMC, por sua contribuição editorial para o manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
27 agulhas G1/2"BD biosciences305109
30 agulhas G1/2"BD biosciences305106
5 mL de poliestireno  tubo de fundo redondo 12 mm x 75 mm estiloCorning352054
BD 1 mL Seringa Tuberculina Sem AgulhaBD biosciences309659
BD FACS array bioanalyzer BD BiosciencesPara verificação de pureza de células CD34+ eluídas 
Software de matriz BD FACSSoftware BD Biosciencespara análise de células CD34+ adquiridas na matriz FACS
BD FACS solução de liseBD Biosciences349202Para lisar glóbulos vermelhos
BD LSR IIBD BiosciencesInstrumento para aquisição de amostras de citometria de fluxo
BD  Tubo de Coleta de Sangue de Plástico VacutainerBD biosciencesBD 367874Para coletar Sangue do Cordão Umbilical
Albumina de Soro BovinoSigma-aldrichA9576
BuprenorfinaSubstância controlada e analgésico
CD14-PEBD Biosciences555398Específico para
CD19-BV605humano BD Biosciences562653Específico para CD34 humano
Kit MicroBead, humanoMiltenyi Biotec130-046-702Para isoação de    CD34+ HSPC
CD34-PE, humanoMiltenyi Biotec130-081-002Anticorpo usado para verificação de pureza de células CD34+ eluídas 
CD3-AF700BD Biosciences557943Específico para humanos
CD45-PerCPCy5.5BD Biosciences564105Específico para humanos
CD4-APCBD Biosciences555349Específico para
humanos CD8-BV421BD Biosciences562428Específico para
humanos Lâminas de contagem de célulasBio-rad1450015
Kit de Tecido Mini gDNA ChargeSwitchThermofisher CS11204 científicopara extração de DNA genômico do fone de ouvido
Sistema Cobas Amplicor v1.5 Bioanalisador Roche Molecular Diagnosticspara medir a carga viral
Aplicadores com ponta de algodão   McKesson24-106-2S
Citoqueratina-18 (CK18)DAKOM7010Específico para DMSO humano
(Dimetil sulfóxido)Sigma-aldrichD2650-5X5ML
Conjunto de extensão Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 pol L: 152 cm PV: 0,55 mL Caminho do Fluido EstérilBD biosciences30914Anexado ao pipeta dispensador e à carga com HSPC e suspensão HEP
FACS Diva versão 6Software de citômetro de fluxo BD Biosciences
Soro Fetal Bovino (FBS)Gibco10438026
software de análise FLOWJO
v10.2		FLOWJO, Softwarede análise de citometria de fluxo
GanciclovirAPP Pharmaceuticals, Inc.315110Medicamento de prescrição
Greiner MiniCollect Tubos EDTAGreiner bio-one450475
Hepatócitos meio de descongelamento Triangle Research Labs MCHT50
Horizon Open Ligating Clip AppliersTeleflex537061Para segurar os clipes de ligadura
Hospira Sterile Water for InjectionACE surgical supply co. Inc.001-1187Para diluição de Buprenorfina (analgésico) Conjunto de
Quantificação ELISA de Albumina HumanaBethyl laboratoriesE80-129Para avaliar os níveis de albumina humana em soro de camundongo
Hepatócitos humanosTriangle Research Labs HUCP1  Hepatócitos humanos criopreservados, qualificados para indução 
Tesoura de íris, retaTed Pella, Inc.13295
LancetMEDIpointGoldenrod 5 mm
LS colunas Miltenyi Biotec130-042-401Usado para capturar microesferas CD34+ (seleção positiva)
Meio de Separação de Linfócitos (LSM)MP Biomedicals50494Para isoação de    linfócitos do sangue periférico
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303contém separador Qudro MACS e colunas LS
McPherson-Vannas Micro Tesoura de Mola de DissecaçãoRoboz Surgical Instrument Co.RS-5605Usado para fazer uma incisão na pele para expor o baço
Micro Dissecação FórcepsRoboz Surgical Instrument Co.RS-5157para segurar e retirar o baço da cavidade peritoneal
camundongo CD45-FITCBD Biosciences553080específico para camundongos
PBS (Phosphate Buffered Saline)HycloneSH30256.02
Qudro MACS separador Miltenyi Biotec130-090-976comporta quatro colunas LS
RPMI 1640 mediumGibco11875093
StepOne Plus PCR em Tempo Real Instrumento usado pela Applied Biosystemspara genótipo
Pipeta de Dispensação Repetitiva Série Stepper 1mlDYMAX CORPT15469Usada para dispensar Suspensão HSPC e HEP de maneira controlada
Suturevet PGA sutura absorvente sintéticaHenry Schein Saúde Animal41178Sutura da pele e peritônio
TaqMan Expressão Gênica Master MixThermofisher scientific4369016
contador celular automatizado TC20Bio-rad1450102
camundongos TK-NOG Fornecido pelo Instituto Central de Animais Experimentais (CIEA, Japão; Drs. Mamoru Ito e Hiroshi Suemizu)
TreosulfanMedac GmbHFornecido pelo  Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) 
Tesoura Micro Tipo TrypanBio-rad1450022
Vannas, Reta, 80mm LTed Pella, Inc.1346Usado para fazer uma incisão na pele para expor o baço
Weck hemoclip clipes tradicionais de ligação de titânioEsuturas523700Para ligar o baço pós-injeção
necessário para aquisição de amostra deLLC

Referências

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