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qKAT: quantitativa coeficiente digitação de assassino-célula Genes de receptores de imunoglobulina-como

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DOI:

10.3791/58646

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6 de março de 2019

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1Department of Pathology, University of Cambridge, 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Cambridge School of Medicine, NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, 4Centre for Trophoblast Research, University of Cambridge, 5Department of Genetics & Evolution, University of Geneva, 6Royal Papworth Hospital, 7Department of Plant Sciences, University of Cambridge

Neste artigo

Resumo

Pilha de assassino quantitativa imunoglobulina-como receptor (KIR) semi-automático digitação (qKAT) é um método simples, alto rendimento e baixo custo para copiar números genes KIR de tipo para sua aplicação em estudos de associação de população e a doença.

Resumo

Receptores de imunoglobulina-like da pilha de assassino (KIRs) são um conjunto de receptores imunes inibitórios e ativando, assassinas naturais (NK) e células T, codificadas por um cluster polimórfico de genes no cromossomo 19. Seus ligantes mais bem caracterizadas são as moléculas de antigénios (HLA) de leucócito humano que são codificadas dentro o locus de (MHC) complexo principal de histocompatibilidade no cromossomo 6. Não há evidências substanciais de que desempenham um papel significativo na imunidade, reprodução e transplante de órgãos, tornando-se crucial ter técnicas que podem com precisão genótipo-los. No entanto, sequência de alta homologia, também como alélica e variação do número de cópia, dificultam ao genótipo e, eficientemente, métodos de projeto que podem com precisão todos os genes KIR . Os métodos tradicionais são geralmente limitados a resolução dos dados obtidos, produtividade, rentabilidade e o tempo necessário para configurar e executar os experimentos. Nós descrevemos um método chamado quantitativo KIR digitação semi-automática (qKAT), que é um método de reação em cadeia de polimerase em tempo real multiplex do elevado-throughput que pode determinar o número de cópias do gene para todos os genes no locus do KIR . qKAT é um método simples de alto rendimento que pode fornecer dados de alta resolução KIR cópia números, que podem ser mais usados para inferir as variações nos haplótipos estruturalmente polimórficas que eles englobam. Dados de número e haplótipo esta cópia podem ser benéficos para estudos sobre associações de doença em grande escala, genética de populações, bem como investigações sobre a expressão e interações funcionais entre KIR e HLA.

Introdução

Em humanos, os receptores de imunoglobulina-como assassino(KIR) locus é mapeado no braço longo do cromossomo 19 dentro o leucócitos do receptor complexo (LRC). Esse locus é cerca de 150 kb de comprimento e inclui 15 KIR genes arranjados cabeça a cauda. Os loci KIR que é atualmente conhecidos são KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3 KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, e dois pseudogenes, KIR2DP1 e KIR3DP1. Os genes KIR codificam para bidimensional (2D) e tridimensionais (3D) domínio de imunoglobulina-como receptores com short (S; ativando) ou longa (L; inibitório) cauda citoplasmática, que é expressos por células assassinas naturais (NK) e subconjuntos de T células. Variação de número de cópia exibiu dentro das formas de locus KIR diversos haplótipos com gene variável conteúdo1. Recombinação homóloga não-alélica (NAHR), facilitada por um arranjo de gene de cabeça-de-cauda estreita e sequência de alta homologia, é o mecanismo proposto para ser responsável para a variabilidade de haplotypic. Mais de 100 diferentes haplótipos foram relatados em populações em todo o mundo1,2,3,4. Todos estes haplótipos podiam ser divididos em dois grandes grupos: A e B haplótipos. O haplótipo A contém 7 genes KIR : KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1e KIR3DL2, que são inibitórios genes KIR e a activação KIR gene KIR2DS4. No entanto, até 70% de indivíduos de origem europeia que são homozigotos para KIR haplótipo A exclusivamente levar para uma forma de "exclusão" não-funcional de KIR2DS45,6. Todas as outras combinações de genes KIR formam grupo B haplótipos, incluindo pelo menos um dos genes KIR específicos KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, e KIR2DL5e tipicamente incluem dois ou mais genes KIR ativando.

Moléculas de HLA classe I foram identificados como ligantes para determinados receptores inibitórios (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3e KIR3DL1), ativando os receptores (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5e KIR3DS1), e para KIR2DL4, que é um exclusivo KIR que contém um longo citoplasmático rabos como outros receptores KIR inibitórios, mas também tem um resíduo de carga positiva perto o domínio extracelular, que é um comum característica de outros receptores KIR ativando. A combinação de variantes dentro dos genes KIR e os genes HLA influencia a interação do ligante do receptor que formas potencial NK célula capacidade de resposta a nível individual7,8. Evidências de estudos genéticos Associação indicou que KIR desempenha um papel na resistência viral (ex.., vírus de imunodeficiência humana [HIV]9 e hepatite C vírus [HCV]10), o sucesso do transplante de 11, o risco de gravidez transtornos e sucesso reprodutivo12,13, a proteção contra a recaída após células-tronco hematopoéticas alogênico transplante (TCTH)14,15, 16e o risco de cancros17.

A combinação de sequência de alta homologia e alélica e haplotypic diversidade apresenta desafios na tarefa de genes KIR com precisão genotipagem. Métodos convencionais para digitar genes KIR incluem a primeira demão de sequência-específica (SSP) do polymerase reação em cadeia (PCR)18,19,20, sequência específica oligonucleotide sonda PCR (SSOP)21, e laser assistida matriz desorção ionização-tempo de voo de espectrometria de massa (MALDI-TOF MS)22. As desvantagens dessas técnicas são que eles só fornecem visão parcial sobre o genótipo de um indivíduo enquanto também ser trabalhoso executar. Recentemente, sequenciamento de próxima geração (NGS) tem sido aplicado para digitar o locus KIR especificamente. Enquanto este método é muito poderoso, pode ser caro executar, e é demorado para realizar verificações de dados e análise em profundidade.

qKAT é um método PCR quantitativo elevado-throughput. Enquanto os métodos convencionais são laborioso e demorado, este método torna possível executar quase 1.000 amostras de DNA (gDNA) genômicas em cinco dias e dá o genótipo KIR , bem como o número de cópia do gene. qKAT é composto por dez reações multiplex, cada um dos quais metas dois loci KIR e um gene de referência de um número fixo de cópia no genoma (STAT6) utilizado para a quantificação relativa do gene KIR copiar número23. Este ensaio tem sido usado com sucesso em estudos envolvendo painéis de grande população e doença coortes sobre doenças infecciosas como HCV, doenças auto-imunes, como diabetes tipo 1 e transtornos da gravidez como pré-eclâmpsia, bem como fornecendo uma genética na base de estudos que visa compreender o NK celular função1,4,24,25,26.

Protocolo

1. preparação e chapeamento do DNA

  1. Quantificar com precisão a concentração de gDNA usando um instrumento espectrofotométrico ou fluorométrica.
  2. Dilua o DNA a 4 ng / µ l em uma placa de 96 poços profundos-bem. Incluem pelo menos uma amostra de gDNA de controle com um número de cópia conhecida e um modelo de controle.
  3. Centrifugar as placas de 96 poços a 450 x g por 2 min.
  4. Usando um instrumento de manipulação de líquidos, dispensar cada amostra em quadriplicado nas chapas de qPCR 384-bem, para que cada poço tem 10 ng de DNA (2,5 µ l/poço). Prepare pelo menos dez chapas de 384-bem, uma para cada reação qKAT.
  5. Se gDNA fornecimento de mais de uma placa de 96 poços, realize uma lavagem de volume completo com 2% de lixívia e água ultrapura para limpar as agulhas do líquido sistema entre cada placa de 96 poços de gDNA amostras de manipulação.
  6. Secar o DNA por incubar as placas de 384-bem em uma área limpa, em temperatura ambiente pelo menos 24 h.

2. preparação das sondas e Primers

Nota: qKAT é composto por dez reações multiplex. Cada reação inclui três pares da primeira demão e três sondas de fluorescência-etiquetada que amplificam especificamente dois genes KIR e referência de um gene. As sondas que foram publicadas no Jiang et al.27 foram modificadas para que os oligonucleotides agora são rotulados com corantes ATTO desde que eles oferecem maior fotoestabilidade e vidas sinal longo. Cartilha pré-aliquotadas combinações são comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais).

  1. Prepare as combinações de cartilha para cada reação conforme as diluições indicado na tabela 1.
  2. Prepare sonda combinações para cada reação, conforme tabela 1. Teste cada sonda individual antes de fazer a combinação.

3. preparação do Master Mix

Nota Os volumes mencionados abaixo são para a realização de uma reação de qKAT em um conjunto de placas de 10 x 384-bem.

  1. Certifique-se de que as amostras de gDNA chapeadas com as placas do 384-bem estão completamente secas. Realizar todos os passos no gelo e manter os reagentes cobertos da exposição à luz tanto quanto possível, desde que as sondas de fluorescência-etiquetada são foto - e termo-sensível.
  2. Degele o buffer de qPCR, primer e alíquotas de sonda a 4 ° C.
  3. No gelo, prepare uma mistura de mestre para placas de 10 x 384-bem adicionando 18,86 mL de água ultrapura, 20 mL de tampão de qPCR, 1.000 µ l de combinação preprepared cartilha e 180 µ l de combinação de sonda preprepared (tabela 2).
  4. Distribua uniformemente a mistura de mestre através de uma placa de 96 de profundidade bem usando uma pipeta multicanal, pipetagem 415 µ l em cada poço. Manter esta placa em uma caixa de gelo coberta de luz.
  5. Usando um instrumento de manipulação de líquidos, dispense 9,5 µ l do mix mestre em cada poço da placa 384-bem com gDNA seca. Selar o prato com uma folha e coloque-o imediatamente a 4 ° C. Repita este processo para as restantes placas, garantindo que as agulhas do líquido sistema de manipulação são lavadas com água entre cada prato.
  6. Centrifugar as placas de 384 poços a 450 x g por 3 min e incube-os a 4 ° C durante a noite ou entre 6-12 h para Ressuspender o DNA e para dissipar quaisquer bolhas de ar.

4. ensaio de qPCR

  1. Após a incubação durante a noite, centrifugar a 450 x g durante 3 min dissipar quaisquer bolhas de ar restantes.
  2. Para efeitos de automação, ligue a máquina de qPCR (por exemplo, LightCycler 480) a um manipulador de microplaca (ver Tabela de materiais). Programa manipulador de microplacas para colocar as placas na máquina qPCR de uma doca de armazenamento refrigerado protegido da luz.
    Nota os ensaios devem, em teoria, trabalhar em outras máquinas de qPCR com configurações de ópticas compatíveis.
  3. Use as seguintes condições de ciclismo: 95 ° C por 5 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C por 15 s e 66 ° C para 50 s, com coleta de dados a 66 ° C.
  4. Uma vez concluída a execução, tem o robô recolher a placa da máquina qPCR e colocá-lo no banco do réus de descarte.

5. após a execução da análise

  1. Após a amplificação, calcular os valores de ciclo (Cq) de quantificação usando o segundo método de máximo derivativo ou o método de pontos de ajuste com o software da máquina qPCR (ver Tabela de materiais), seguindo os passos abaixo.
  2. Abra o software de qPCR e, na aba do navegador , abra o arquivo de experimento de reação salvos para um prato.
  3. Para a análise usando o segundo método de máximo derivado, selecione a guia de análise e criar uma nova análise, usando o método Abs Quant/Second derivado Max.
    1. Na janela criar nova análise , seleccione o tipo de análise: o método Abs Quant/Second derivado Max, subconjunto: todas as amostras, programa: amplificação, nome: Rx-DFO (onde x é o número de reação).
    2. Selecione Filtro Comb e escolha VIC/HEX/Yellow555 (533-580). Isso garante que os dados coletados para STAT6 estão selecionados.
    3. Selecione cor compensação para VIC/HEX/Yellow555(533-580). Clique em calcular. Repita isto para Fam (465-510) e Cy5/Cy5.5(618-660). Clique em salvar arquivo.
  4. Para a análise usando o método de pontos de ajuste, selecione Abs Quant/Fit pontos na guia de análise.
    1. Na janela criar nova análise , seleccione o tipo de análise: o método Abs Quant/Fit pontos, subconjunto: todas as amostras, programa: amplificação, nome: RxF-DFO (onde x é o número de reação).
    2. Selecione os filtros corretos e compensações de cor para cada um dos genes KIR (Fam/Cy5) e o STAT6 . Na guia Noiseband , defina a banda ruído para eliminar o ruído de fundo.
    3. Na guia análise , definir os pontos de ajuste para 3 e selecione que mostrar pontos de ajuste. Clique em calcular. Clique em salvar arquivo.

6. exportação dos resultados

  1. No software qPCR, abra o navegador Tab. Selecione Exportar de lote de resultados.
  2. Abra a pasta na qual os arquivos do experimento são salvos em transferir os arquivos para a seção do lado direito da janela. Clique em seguinte. Selecione o nome e o local do arquivo de exportação.
  3. Selecione o tipo de análise o método Abs Quant/Second derivado Max ou Abs Quant/Fit pontos. Clique em seguinte. Verifique se o nome do arquivo, a pasta de exportação e o tipo de análise estão correto e clique em próximo para iniciar o processo de exportação.
  4. Espere até que o Status de exportação é Okey. A tela automaticamente se moverá para o próximo passo. Verifique que todos os arquivos selecionados foram exportados com sucesso para que o número de arquivos falhou = 0. Clique em concluído.
  5. Use scripts split_file.pl e roche2sds.pl para dividir as placas exportadas em reações individuais para cada placa.
    Nota os scripts são fornecidos na solicitação/GitHub.

7. Copie o número de cálculos

  1. Abra o software de análise número da cópia (por exemplo, CopyCaller). Selecione Importar arquivo de resultados PCR em tempo real e carregar arquivos de texto criados pelo roche2sds.pl.
  2. Selecione analisar e realizar a análise ou selecionando amostra Calibrador com número de cópia conhecida ou selecionando o número mais frequente de cópia. Ver tabela 5 para o número mais frequente de cópia de genes KIR tipicamente observada em populações de origem europeia.

8. qualidade dos dados verifica

  1. Use script de R KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R para combinar dados de número de cópia de todas as placas em uma planilha.
    Nota os scripts são fornecidos na solicitação/GitHub.
  2. Verifique novamente os dados brutos sobre o software de análise de número de cópia para amostras que não estão em conformidade com o desequilíbrio de ligação conhecida (LD) para genes KIR (quadro 6).

Resultados

Análise do número de cópia pode efectuar exportando os arquivos para o software de análise número de cópia, que fornece o número de cópia previsto e estimado baseado no método ΔΔCq.

O número de cópia pode ser previsto com base no número de amostras de DNA de controle na placa ou inserindo o número de cópia de gene mais frequente (tabela 5) cópia conhecida. A Figura 1 mostra os resultados de uma placa para uma reação que tem como alvo KIR2DL4 e KIR3DS1, bem como o gene de referência STAT6. O número de cópia mais frequente para KIR2DL4, um gene de quadro no locus KIR , é duas cópias, Considerando que o número de cópia mais frequente para KIR3DS1, um gene de activação, é uma cópia. Os resultados na figura mostram as parcelas de amplificação do PCR observadas sobre o software de qPCR e os dados de número de cópia gerados a partir dos dados de qPCR. Como mostrado, o ensaio é capaz de distinguir entre 0, 1, 2, 3 e 4 número de cópias do gene de KIR . O software de análise de número de cópia também permite uma visualização da distribuição do número de cópia através da placa como um gráfico de pizza ou um gráfico de barras. A eficácia da previsão de número de cópia é inferior para amostras com um número maior de cópia.

A qualidade de todos os materiais usados nas reações gDNA, tampão, primers e sondas, pode afetar a precisão dos resultados obtidos. No entanto, a discordância nos resultados é mais provável ser causado devido a variação na concentração de DNA através de uma placa. A pureza do gDNA extraído, o que pode ser medido usando a 260/280 e 260/230 rácios, também pode ter um efeito sobre a qualidade. Um rácio de 260/280 cuja relação 1,8-2 e 260/230 2-2.2 são desejáveis. Um concentrações de intervalo irregular de DNA através de uma placa podem levar a uma alta variabilidade no ciclo de limiar (Ct) entre amostras e discordância no intervalo do número estimado de cópia. Os resultados na Figura 2 mostram o efeito que a disparidade entre os valores det C através de uma placa pode ter sobre a exactidão na predição do número de cópia. A linha vermelha indica o intervalo do número estimado de cópia para uma amostra e, idealmente, deveria ser mais próximo de um número inteiro possível.

Os dados de número de cópia, uma vez analisados, podem ser exportados como um arquivo de planilha em um formato de 96 poços. Usamos um script de R (disponível quando solicitado) para combinar os dados de número de cópia de todos os 10 placas que são executados como um conjunto em uma planilha. Os dados publicados sobre KIRs de populações de origem europeia na maior parte permite a previsão de regras de LD que existem entre os vários genes no complexo KIR 1. Estas previsões são usados para conduzir verificações a jusante na cópia números resultados obtidos (tabela 6). Amostras que não estão em conformidade com o previsto LD entre os genes podem conter incomum polimorfismo ou variações estruturais de haplotypic. Um fluxograma descrevendo o protocolo é mostrado na Figura 3.

Uma ferramenta chamada KIR haplótipo identificador (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) foi desenvolvida para facilitar a imputação de haplótipos do conjunto de dados. A imputação funciona com base numa lista de haplótipos de referência observadas em uma população de origem europeia1. No entanto, a ferramenta também permite um conjunto personalizado de haplótipos de referência a ser usado em vez disso. Três arquivos separados são gerados; o primeiro arquivo lista todas as combinações de haplótipo para uma amostra, o segundo arquivo fornece uma lista aparada as combinações de haplótipos que têm as mais altas frequências combinadas, e o terceiro arquivo listas de exemplos que não podem ser atribuídos haplótipos. Non-atribuição de haplótipos poderia ser usado como um indicador de haplótipos de romance.

figure-results-1
Figura 1: número de resultados representativos de uma placa para a reação 5. (A), este painel mostra amplificação parcelas. (B), este painel mostra copiar números parcelas. (C), este painel mostra a distribuição do número de cópia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: número de resultados representativos de uma placa com uma concentração variável de DNA pela reação 5. (A), este painel mostra amplificação parcelas. (B), este painel mostra copiar números parcelas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: fluxograma do protocolo qKAT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

EnsaioGenesPrimers para a frenteConcentração (nM)Primers reversosConcentração (nM)SondasConcentração (nM)
N º 13DP1A4F250A5R250P4a150
2DL 22DL2F4400C3R2600P5B150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
N º 22DS2A4F400A6R400P4a200
2DL 3D1F400D1R400P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
N º 33DL 3A8F500A8R500P4a150
2DS4Del2DS4Del2502DS4R2250P5B150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
N º 43DL1e4B1F250B1R125P4b150
3DL1e9D4F250D4R2500P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
N º 53DS1B2F250B1R250P4b150
2DL 4C1F200C1R200P5B - 2DL 4150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
N º 62DL 1B3F500B3R125P4b150
2DP1D3F250D3R500P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
N º 72DS1B4F500B4R250P4b150
2DL 5D2F500D2R500P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
N º 82DS3B5F250E55250P4b150
3DL2e9D4F250C55125P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
N º 93DL2e4A1F200A1R200P4a150
2DS4FL2DS4FL2502DS4R2500P5B150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
N º 102DS5B6F2200B6R3200P4b150
2DS4C5F250C5R250P5B150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150

Tabela 1: combinação e concentração de primers e sondas utilizadas em cada reação de qKAT 27 .

ReaçãoPrimeira demão alíquotas (µ l)Alíquotas de sonda (µ l)
R13DP1A4FA5R2DL2F4C3R2ÁGUASTAT6FSTAT6RP4AP5BPSTAT6
2DL 21001001602402008080606060
R22DS2A2FA6RD1FD1RÁGUASTAT6FSTAT6RP4AP9PSTAT6
2DL 31601601601601608080806060
Nota: preciso de 20 µ l de menos água no MasterMix
R33DL 3A8F A8FBA8R2DS4DELF2DS4R2ÁGUASTAT6FSTAT6RP4AP5BPSTAT6
2DS4DEL100 1002001001002008080606060
R43DL1E4B1FB1RD4FD4R2ÁGUASTAT6FSTAT6RP4BP9PSTAT6
3DL1E9100501002003508080606060
R53DS1B2FB1RC1FC1RÁGUASTAT6FSTAT6RP4BP5B - 2L 4PSTAT6
2DL 410010080804408080606060
R62DL 1B3FB3RD3FD3RÁGUASTAT6FSTAT6RP4BP9PSTAT6
2DP1200501002002508080606060
R72DS1B4FB4RD2FD2RÁGUASTAT6FSTAT6RP4BP9PSTAT6
2DL 52001002002001008080606060
R82DS3B5FE55D4FC55ÁGUASTAT6FSTAT6RP4BP9PSTAT6
3DL2E9100100100504508080606060
R93DL2E4A1FA1R2DS4WTF2DS4R2ÁGUASTAT6FSTAT6RP4AP5BPSTAT6
2DS4WT80801002003408080606060
R102DS5B6F2B6R3C5FC5RÁGUASTAT6FSTAT6RP4BP5BPSTAT6
2DS4TOTAL80801001004408080606060

Tabela 2: Volumes (µ l) da cartilha de 100 µM/ponta de estocam soluções para fazer a primeira demão e sonda alíquotas de combinação.

NomeDireçãomodificação de 5´modificação de 3´Sequência (5' →3')ComprimentoTM% DE GCExãoPosição
P4aSentidoFAMBHQ-1TCATCCTGC
AATGTTGGT
CAGATGTCA		276044,44425-451
P4bAntisentidoFAMBHQ-1AACAGAACC
GTAGCATCT
GTAGGTCCC
T		2862504576-603
P5BSentidoATTO647NBHQ-2AACATTCCA
GGCCGACT
TTCCTCTG		2560525828-852
P5B - 2DL 4SentidoATTO647NBHQ-2AACATTCCA
GGCCGACT
TCCCTCTG		2561565828-852
P9SentidoATTO647NBHQ-2CCCTTCTCA
GAGGCCCA
AGACACC		246062,591246-1269
PSTAT6ATTO550BHQ-2CTGATTCCT
CCATGAGCA
TGCAGCTT		266250

Tabela 3: lista das sondas utilizadas em qKAT 1, 27. os corantes fluorescentes usados na extremidade 5' das sondas oligo P5b, P5b - 2 DL 4, P9 e PSTAT6 foram modificados para corantes ATTO.

GenePrimeiras demãoDireçãoSequência (5´-3´)ComprimentoTM% DE GCExãoPosiçãoAmplicon (bp)Alelos podem ser desperdiçados.
3DL2e4A1FPara a frenteGCCCCTGCTGAA
ATCAGG		185261.14399-4161793DL 008 * 2, * 021, * 027, * 038.
A1RInverterCTGCAAGGACAG
GCATCAA		195352,6559-5773DL 2 * 048
3DP1A4FPara a frenteGTCCCCTGGTGA
AATCAGA		194952,64398-416112Nenhum
A5RInverterGTGAGGCGCAAA
GTGTCA		185255.6492-509Nenhum
2DS2A2FPara a frenteGTCGCCTGGTGA
AATCAGA		194952,64398-416111Nenhum
A6RInverterTGAGGTGCAAAG
TGTCCTTAT		215142,9488-508Nenhum
3DL 3A8FaPara a frenteGTGAAATCGGGA
GAGACG		185055.64406-423139Nenhum
A8FbPara a frenteGGTGAAATCAGG
AGAGACG		195052,6405-4233DL 3 * 054, 3DL 3 * 00905.
A8RInverterAGTTGACCTGGG
AACCCG		185161.1526-543Nenhum
3DL1e4B1FPara a frenteCATCGGTCCCAT
GATGCT		185155.64549-566853DL 1 * 00505, 3DL 1 * 006, 3DL 1 * 054, 3DL 1 * 086, 3DL 1 * 089
B1RInverterGGGAGCTGACAA
CTGATAGG		205255614-6333DL 1 * 00502
3DS1B2FPara a frenteCATCGGTTCCAT
GATGCG		185155.64549-566853DS1 * 047; pode pegar 3DL 1 * 054.
B1RInverterGGGAGCTGACAA
CTGATAGG		205255614-633Nenhum
2DL 1B3FPara a frenteTTCTCCATCAGT
CGCATGAC		2052504544-563962DL 1 * 020, 2DL 1 * 028
B3RInverterGTCACTGGGAGC
TGACAC		185061.1622-6392DL 1 * 023, 2DL 1 * 029, 2DL 1 * 030
2DS1B4FPara a frenteTCTCCATCAGTC
GCATGAA		195147,44545-563962DS1 * 001
B4RInverterGGTCACTGGGAG
CTGAC		174964,7624-640Nenhum
2DS3B5FPara a frenteCTCCATCGGTCG
CATGAG		185361.14546-56396Nenhum
E55InverterGGGTCACTGGGA
GCTGAA		185161.1624-641Nenhum
2DS5B6F2Para a frenteAGAGAGGGGACG
TTTAACC		195052,64475-493173Nenhum
B6R3InverterTCCAGAGGGTCA
CTGGGC		185366,7630-6472DS5 * 003
2DL 4C1FPara a frenteGCAGTGCCCAGC
ATCAAT		185255.65808-82583Nenhum
C1RInverterCCGAAGCATCTG
TAGGTCT		195252,6872-8902DL 4 * 018, 2DL 4 * 019
2DL 22DL2F4Para a frenteGAGGTGGAGGCC
CATGAAT		195257.95778-7961512DL 2 * 009; 782G mudado para r.
C3R2InverterTCGAGTTTGACC
ACTCGTAT		205145909-928Nenhum
2DS4C5FPara a frenteTCCCTGCAGTGC
GCAGC		175770.65803-819120Nenhum
C5RInverterTTGACCACTCGT
AGGGAGC		195257.9904-9222DS4 * 013
2DS4Del2DS4DelPara a frenteCCTTGTCCTGCA
GCTCCAT		195457.95750-768203Nenhum
2DS4R2InverterTGACGGAAACAA
GCAGTGGA		205350933-952Nenhum
2DS4FL2DS4FLPara a frenteCCGGAGCTCCTA
TGACATG		195357.95744-762209Nenhum
2DS4R2InverterTGACGGAAACAA
GCAGTGGA		205350933-952Nenhum
2DL 3D1FPara a frenteAGACCCTCAGGA
GGTGA		174858,891180-1196156Nenhum
D1RInverterCAGGAGACAACT
TTGGATCA		2050451316-13352DL 3 * 010, 2DL 3 * 017, 2DL 3 * 01801 e 2DL 3 * 01802
2DL 5D2FPara a frenteCACTGCGTTTTC
ACACAGAC		20525091214-12331202DL5B * 011 e 2DL5B * 020
D2RInverterGGCAGGAGACAA
TGATCTT		194947,41315-1333Nenhum
2DP1D3FPara a frenteCCTCAGGAGGTG
ACATACGT		20535591184-1203121Nenhum
D3RInverterTTGGAAGTTCCG
TGTACACT		2050451285-1304Nenhum
3DL1e9D4FPara a frenteCACAGTTGGATC
ACTGCGT		195252,691203-1221933DL 1 * 061, 3DL 1 * 068
D4R2InverterCCGTGTACAAGA
TGGTATCTGTA		235343,51273-12953DL 1 * 05901, 3DL 1 * 05902, 3DL 1 * 060, 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 064, 3DL 1 * 065, 3DL 1 * 094N, 3DL 1 * 098
3DL2e9D4FPara a frenteCACAGTTGGATC
ACTGCGT		195252,691203-1221156Nenhum
D5RInverterGACCTGACTGTG
GTGCTCG		195463,21340-1358Nenhum
STAT6STAT6FPara a frenteCCAGATGCCTAC
CATGGTGC		205460129.
STAT6RInverterCCATCTGCACAG
ACCACTCC		205460

Tabela 4: sequências dos primers utilizados em qKAT 1, 27.

KIR gene 3DL 32DS22DL 22DL 32DP12DL 13DP12DL 43DL 1
EX9		3DL 1
EX9		3DS12DL 52DS32DS52DS12DS4
Total		2DS4
FL		2DS4
DEL		3DL 2
EX4		3DL 2
EX9
Número de cópia mais frequente21122222221111121122

Tabela 5: Número de cópia mais frequente para KIR genes comumente observados em amostras de origem europeia.

Regras de desequilíbrio de ligação para qKAT com base em populações europeiasVerificação do número de cópia
1 KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 e KIR3DL2 são quadro genes presentes em ambos os haplótipos. KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 e KIR3DL2 = 2
2 KIR2DS2 e KIR2DL2 são em LD uns com os outros 2DS2=2 DL 2
3 KIR2DL2 e KIR2DL3 são alelos de um mesmo gene 2 DL de 2+2 DL 3= 2
4 KIR2DP1 e KIR2DL1 são em LD uns com os outros 2DP1=2 DL 1
5Exon 4 de KIR3DL1 e KIR3DL2 é igual a exon 9 de KIR3DL1 e KIR3DL2 respectivamente. 3DL1ex4=3DL1ex9 e 3DL2ex4=3DL2ex9
6 KIR3DL1 e KIR3DS1 são alelos 3 DL 1+3DS1= 2
7 KIR2DS3 e KIR2DS5 estão em LD com KIR2DL5 2DS3+2DS5=2 DL 5
8 KIR3DS1 e KIR2DS1 estão em LD 3DS1=2DS1
9Presença de KIR2DS1 e KIR2DS4Tvirgula é mutuamente exclusiva em um haplótipo 2DS1+2DS4TOTAL= 2
10 KIR2DS4FL e KIR2DS4del são variantes de KIR2DS4TOTAL 2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL

Tabela 6: desequilíbrio de ligação entre KIR os genes comumente observados em populações de origem Europeia podem ser usados para verificar os dados de número de cópia 1,27.

Discussão

Nós descrevemos um método de alta produtividade semi-automatizadas romance, chamado qKAT, que facilita a digitação de número cópia dos genes KIR . O método é uma melhoria sobre os métodos convencionais como SSP-PCR, que são de baixo rendimento e só podem indicar a presença ou ausência destes genes altamente polimórficos.

A precisão dos dados cópia números obtidos é dependente de vários fatores, incluindo a qualidade e uniformidade-concentração de amostras gDNA e a qualidade dos reagentes. A qualidade e a precisão das amostras gDNA através de uma placa são extremamente importantes, uma vez que as variações na concentração do outro lado da placa podem resultar em erros no cálculo do número de cópia. Desde os ensaios foram validados utilizando conjuntos de exemplo de origem europeia, dados de coortes de outras partes do mundo exigem verificações mais minuciosa. Isto é para garantir que instâncias do abandono do alelo ou ligação não-específica da primeira demão/sonda não são mal interpretadas como variação de número de cópia.

Enquanto os ensaios foram projetados e otimizados para rodar como alta produtividade, eles podem ser modificados para executar amostras menos. A métrica de confiança no software de análise do número cópia é afectada quando analisando amostras de menos, mas isso pode ser melhorado se amostras de DNA genômicas controle com um número de cópia de gene conhecido do KIR estão incluídas na placa e repetições de exemplo adicionais são incluído.

Para os laboratórios sem líquido/placa-manipulação de robôs, mistura de mestre pode ser dispensada usando pipetas multicanais e chapas podem ser carregadas manualmente dentro do instrumento qPCR.

O principal objetivo por trás do desenvolvimento de qKAT foi criar um simples, alta produtividade, alta resolução e econômica método genótipo KIRs para doença estudos de associação. Isto foi conseguido com sucesso desde que qKAT tem sido empregado em investigar o papel do KIR em vários estudos de associação grande doença, incluindo uma variedade de doenças infecciosas, doenças auto-imunes e distúrbios de gravidez4, 24 , 25 , 26.

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

O projeto recebido financiamento do Conselho de pesquisa médica (MRC), o Conselho Europeu de investigação (CEI) sob o programa União Europeia do Horizonte 2020 pesquisa e inovação (grant acordo n. º 695551) e a National Institute of Health (NIH) Cambridge Biomedical Research Centre e sangue de pesquisa de NIH e Transplant Research Unit (NIHR BTRU) na transplantação e na Universidade de Cambridge e em parceria com o sangue de NHS e transplante (NHSBT). As opiniões expressadas são as dos autores e não necessariamente aqueles de NHS, o NIHR, o departamento de saúde ou o NHSBT.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
REAGENTS
OligonucleotídeosSigmaOrdem personalizadaSEQUÊNCIAS: Listado na Tabela 4
Sondas rotuladas com corantes ATTOSigmaOrdem personalizadaSEQUÊNCIAS: Listado na Tabela 3
Sonda SensiFAST No-ROX KitBiolineBIO-86020−
Água MilliQ−&menos;&menos;
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
EQUIPAMENTO
Centrífuga com rotor de caçamba oscilanteEppendorf(ou equivalente)Eppendorf 5810R ou sistema
NanoDropThermo Fluorômetro ScientificND-2000
OR
QuBitLife TechnologiesQ33216
Matrix HydraThermo Scientific109611
LightCycler 480 II InstrumentoManipulador05015243001
com Mé Empilhador de Placas Térmicas Cour (Mé Cour)Caliper Life Sciences204135
Misturador VortexBiosanBS-010201-AAA
Pipetas de canal único (faixa de volume: 0.5– 10 µ L, 2– 20 µ L, 20– 200 µ L, 200– 1.000 µ L; 1-10 mL)Gilson (ou equivalente)F144801, F123600, F123615, F123602, F161201
pontas de pipeta livres de RNase e DNase filtradas (10 µ L, 20 µ L, 200 µ L, 1.000 µ L, 10 mL)Starlab (ou equivalente)S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001
Reservatório de reagente StarTub PS, 55 mLSTARLABE2310-1010
Tubo de centrífuga de 50 mLSTARLABE1450-0200
Placa de poço profundo de 96 poçosFisher Scientific12194162
LC480 384 Placas de vários poçosRoche04729749001
Folha de vedação LightCycler 480Roche04729757001
NomeEmpresa<strong>Número de catálogoComentários
SOFTWARE
Roche LightCycler 480 Software v1.5
Software CopyCaller da Applied Biosystems v2.1https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html
identificadorde haplótipo KIR
equivalente de Microplacas Roche Twister II de 384 poços http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/

Referências

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