Microfluidic ensaio para a avaliação da adesão de leucócitos ao humano Induced Pluripotent células-tronco derivadas de células endoteliais (ECs-hiPSC)

Inflamação desempenha um papel central em muitas condições patológicas, incluindo cardiovasculares e as doenças neurodegenerativas, sepse e respostas adversas da droga (ADRs). Células endoteliais (ECs) desempenham um papel essencial na regulação da resposta inflamatória através da indução de pro-adesivo receptores, tais como a molécula de adesão intercelular, E-selectina-1 (ICAM-1) e células vasculares adesão molécula-1 (VCAM-1) na sua superfície ^{1 , 2}. ECs microvascular em tecidos diferentes são conhecidos por apresentar heterogeneidade nas respostas inflamatórias^3,4. Além disso, o fundo genético ou certas condições genéticas podem resultar em respostas inflamatórias as diferenças entre os indivíduos; Portanto, é importante ter acesso para ECs de indivíduos diferentes. Mais recentemente, humanas pluripotentes induzidas as células-tronco (hiPSCs)⁵, que pode ser derivado de virtualmente qualquer indivíduo, foram mostrados para servir como uma fonte confiável e renovável de ECs^{6,7,8, 9}. por conseguinte, a avaliação das respostas inflamatórias e recrutamento de leucócitos em hiPSC-ECs é valiosa, não só para a modelagem de certas doenças genéticas, mas também para fornecer indicações de variabilidade inter-individual e usar como uma ferramenta para medicina personalizada no futuro.

Ensaios de fluxo fornecem uma ferramenta útil para estudar a interação leucócito-endotélio. Avanços em dispositivos microfluídicos permitem a reprodução das condições de fluxo de fluido fisiológico com controle preciso dos níveis de tensão de cisalhamento vascular cama específicos. Imagem ao vivo permite o monitoramento da cascata de eventos de captura de leucócitos, rolando, rastejando, adesão e transmigração. Desenvolveram-se vários ensaios de fluxo para estudar a interação leucócito-endotélio, no entanto, todos eles utilizam primário ECs^10,11,12,13. Aqui, nós descreveremos detalhadamente o ensaio para a avaliação da adesão de leucócitos humanos para hiPSC-ECs sob fluxo fisiológico. Neste procedimento, descrevemos as condições otimizadas de estimulação hiPSC-CE com estímulos pró-inflamatórios, tais como o fator de necrose tumoral alfa (TNFa), dissociação, semeadura em um chip microfluidic com oito canais paralelos. Descrever um protocolo passo a passo para a perfusão de hiPSC-ECs com a suspensão dos leucócitos fluorescente etiquetadas em chips microfluídicos, vivemos a imagem latente da pilha e automatizado de contagem de leucócitos aderentes.

Este protocolo é útil para a avaliação das respostas inflamatórias em hiPSC-ECs na despistagem de drogas, modelagem de doença e medicina regenerativa personalizada.

1. preparação de soluções e reagentes

1. Preparar o meio humano Endothelial-SFM completo (CE-SFM completo) pela adição de soro de derivado de plasma pobre em plaquetas (1%), fator de crescimento fibroblástico básico (bFGF, 20 ng/mL) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF, 50 ng/mL) para humanos Endothelial-SFM (ver tabela de de Materiais). Filtrar o meio através de um filtro de porosidade de 0,22 µm e armazená-lo em 4 ° C por até 2 semanas.
2. Preparar o meio RPMI completo adicionando soro bovino fetal (10%), 2-mercaptoetanol (0.05 nM), L-glutamina (1%), penicilina-estreptomicina (25 U/mL) para meio RPMI (ver Tabela de materiais). Armazenar a 4 ° C por até 3 semanas.

2. revestimento de Microfluidic fichas

1. Coloque um biochip que estéril em um prato de Petri estéril de 10 cm.
2. Prepare a solução de trabalho de fibronectina, reconstituir a solução estoque em tampão fosfato salino (PBS) sem Ca^{2 +}/ mg^{2 +} para uma concentração final de 50 µ g/mL. Estime a 80 µ l da solução de trabalho por biochip.
3. Injecte 10 µ l da solução de trabalho de fibronectina em cada canal do biochip. Usar uma pipeta com pequenas dicas de 10 µ l e certifique-se de formar um contato firme entre a entrada do canal e a ponta da pipeta (Figura 1, à esquerda).
4. Feche a tampa da caixa de Petri contendo o biochip e colocá-lo em uma câmara umidificada (Figura 2B). Armazene a câmara a 4 ° C durante a noite. Para umidificar a câmara, coloque um papel de tecido limpo na parte inferior da câmara umidificada e adicionar 5 mL de estéril H₂O.
5. No dia seguinte, antes do ensaio, pré-aquecer o biochip a 37 ° C na incubadora.

3. preparação do hiPSC-ECs

Nota: O protocolo descrito aqui, hiPSC-ECs foram diferenciadas, purificados, criopreservadas e descongelados como descrito anteriormente⁸.

1. Degelo e placa hiPSC-ECs no CE-SFM completo completo aferido um 0,1% gelatina-revestido T75, três ou quatro dias antes do ensaio.
2. A noite antes do ensaio, estimular hiPSC-ECs com TNFa adicionando CE-SFM completo suplementado com 10 ng/mL TNFa e incubar durante a noite (~ 12 h) a 37 ° C, como descrito anteriormente, ⁷.

4. hiPSC-ECs dissociação e semeadura em Microfluidic Chip

1. No dia do ensaio, retirar o balão de hiPSC-ECs da incubadora e examinar as células sob o microscópio. Assegure que hiPSC-ECs são 80 – 100% de confluencia e têm uma morfologia típica de CE-como.
2. Transferi o balão ao subúrbio de cultura de células.
3. Aspire o meio do recipiente de hiPSC-ECs.
4. Brevemente, lave a cultura de células, adicionando 10 mL de PBS sem Ca^{2 +}/ mg^{2 +}. Aspire a PBS.
5. Adicione 4 mL por frasco de enzima de dissociação de 1x. Incube durante 5 min à temperatura ambiente (RT) (figura 1B).
6. Pare a reação de dissociação, adicionando 8 mL de meio de SFM-Endothelial humana por balão. Suavemente, destacar e recolher a suspensão hiPSC-ECs em um tubo cônico de 15 mL com uma pipeta de 5 mL.
7. Conte o número total de células em suspensão.
8. Centrifugar as células em 300 x g durante 3 min à RT
9. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o celular na CE-SFM completo para uma concentração final de 1,5 x 10⁷ células/mL.
10. Retire a placa de Petri com o biochip da incubadora e transferi-lo para o capô de cultura de células.
11. Aspire a solução de todos os canais do chip microfluidic fibronectina.
12. Injete 6 µ l de suspensão de células em cada canal usando uma pipeta com uma ponta pequena 10 µ l (Figura 1, médio). Certifique-se que a suspensão de eritrócitos é misturada bem antes da injeção e evitar a precipitação de célula.
13. Examinar o biochip sob o microscópio e certifique-se que as células estão uniformemente distribuídas, e a densidade celular é alta (Figura 2).
14. Incubar o biochip por 15 min a 37 ° C.
15. Adicione 40 µ l de CE-SFM completo em reservatórios do médios de ambos os lados de cada canal.
16. Incube o biochip para 1 h a 37 ° C (Figura 1, direito).
17. Adicione outro 50 µ l de CE-SFM completo em reservatórios de ambos os lados de cada canal.

5. preparação dos leucócitos humanos

Nota: O protocolo descrito aqui, foi usada uma linha de celular monocítica comercialmente disponíveis (THP-1). Alternativamente, podem ser usados células mononucleares de sangue periférico ou neutrófilos. Isolamento de sangue periférico monócitos e neutrófilos pode ser executado usando o procedimento padrão¹¹. Execute todas as etapas descritas neste parágrafo em uma capa de cultura de células.

1. Recolha os leucócitos em um tubo cónico de 50 mL.
2. Lave os leucócitos com 10 mL de PBS sem Ca^{2 +}/ mg^{2 +}. Centrifugar as células em 300 x g durante 3 min à RT (Figura 1).
3. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de PBS com tintura DiOC6 (λ_ex = 485 nm, λ_em = 501 nm) (1:5, 000). Incube as celulas no escuro por 10 min a RT
4. Lave os leucócitos com 10 mL de PBS sem Ca^{2 +}/ mg^{2 +}. Centrifugar as células a 300 x g por 3 min em RT. repetir a etapa de lavagem mais uma vez.
5. Conte o número total de células em suspensão.
6. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em meio RPMI completo para uma concentração final de 2,5 x 10⁶ células/mL.

6. preparação da bomba Microfluidic

1. Monte a bomba microfluidic com um tubo de 8 canais.
2. Conecte a bomba para um PC com o software instalado e operacional.
3. Inicie o software microfluídicos e carregar o protocolo clicando em Protocolo aberto e navegar no PC para selecionar o protocolo microfluidic.
4. Ligue a bomba e o software selecionando a pasta de instalação e clicando em Executar a etapa de ensaio.
5. Definir a geometria dos canais para o controle de taxa de fluxo correto: selecione Atualização geometria na pasta de Instalação de geometria e clique em Executar a etapa de ensaio.
   Nota: Certifique-se que os detalhes de geometria correspondem a seringa e canais a ser utilizado (geometria ID = 1, o número de canais = 8, largura do canal = 800.0 µm, profundidade de canal = 120,0 µm, volume de seringa = 250 µ l) e a viscosidade da amostra (viscosidade do líquido = 1.0).
6. Lave a bomba, colocando o cabo de entrada (laranja) no tubo cónico de 50 mL contendo 80% de etanol. Coloque o cabo da tomada (verde) no tubo cônico vazio de 50 mL (recipiente de resíduos).
7. Selecione a pasta de Washout Washout/bomba e clique em Executar a etapa de ensaio (lavar volume = 2000 µ l, a etapa de lavagem volume = 250 µ l, direção de Washout = saída). Repita a etapa de lavagem mais uma vez.
8. Repita a bomba lavagem passos (6.6 – 6,7) com água de grau de cultura de células e o meio de cultura humana Endothelial-SFM.
9. Continue com a etapa de lavagem do colector de.
10. Abra manualmente a válvula entre a seringa e o colector, colocando o adaptador de 3 vias para a posição correta (indicador OFF é virado para a esquerda).
11. Selecione Set Current Channel/abrir passo na pasta Lavagem lavagem/colector e clique em Executar a etapa de ensaio para abrir todas as válvulas do colector de.
12. Lave o colector manualmente empurrando-se 5 mL de etanol a 80% da seringa, seguida por 5 mL de água de grau de cultura de células.
13. Lave o colector empurrando-se 5 mL de meio de cultura humana SFM-Endothelial da seringa.
14. Remova todas as bolhas de ar grandes que estão presos em um tubo de. Para fazer isso, coloque o adaptador de pino 8 poços o cm 10 placa de Petri com o meio e realizar empurrar/puxar com a seringa, até todas as bolhas de ar grandes sumiram (pequenas bolhas não são um problema).
15. Selecione Set Current Channel/próximo passo na pasta Lavagem lavagem/colector e clique em Executar a etapa de ensaio para fechar todas as válvulas do colector de.
16. Conecte o cabo de saída verde da bomba ao adaptador do colector.
17. Trocar a válvula de 3 vias para a posição OFF para fechar bem a seringa.
18. Selecionar pasta de Washout Washout/cabo e clique em Executar a etapa de ensaio para lavar cada porta com meio RPMI individualmente, garantindo que todas as bolhas são removidas de cada cabo (distribuir volume = 100 µ l).
    Nota: Cada válvula do colector de é aberto um por um, 1 a 8 e 100 μL de médio porte é dispensado através de cada canal individual enquanto manter os outros canais fechados. Certifique-se de que o líquido seja executado de cada pino. Se não há nenhum líquido saindo, é uma indicação de uma bolha de ar ou uma obstrução.

7. preparação do Chip Microfluidic para viver de imagem

1. Garantir que as configurações microfluidic estão prontas e a câmara ao vivo de imagens é pre-equilibrada a 37 ° C e o nível de CO₂ atinge 5% (Figura 3A, B).
2. Pegue o biochip da incubadora e posicioná-lo no suporte da microplaqueta do microscópio. Monte o titular do chip no microscópio de imagem de palco (Figura 3).
3. Para conectar o biochip da bomba através do colector, coloque o adaptador de 8 pinos perto dos reservatórios de tomada do chip e aprofundar todos os pinos no meio (mas não conectar completamente).
4. Selecione o esmaecimento de | Conectar-se ao Chip pasta e clique em Executar a etapa de ensaio para dispensar o meio RPMI antes de conectar o chip (distribuir volume = 30 mL). Uma vez que o meio é dispensado, insira o adaptador de 8 pinos na tomada do biochip.
   Nota: Durante esta etapa, todos os canais são definidos como em (abrir) e 30 µ l do meio é dispensado através de cada canal e em seguida situam-se os canais para fora (fechado). Isso garante que nenhum ar bolhas serão introduzidas nos circuitos do chip microfluidic.
5. Manualmente, Aspire o meio em todos os reservatórios da entrada o biochip com uma pipeta.
6. Selecione o esmaecimento de | Esmaecimento da microplaqueta pasta e clique em Executar a etapa de ensaio para perfundir 40 mL do meio CE-SFM completo através de cada um dos canais um por um para se livrar dos escombros/células mortos do canal (volume de Washout = 40 µ l, máximo esmaecimento de cisalhamento = 40 Dinas/cm²).

8. fluxo ensaio de adesão e aquisição de imagem

1. Manualmente, Aspire o meio do reservatório de entrada do canal de interesse com uma pipeta.
2. Adicione 100 µ l de leucócitos de passo 5.6 para o reservatório de entrada do canal de interesse.
   Nota: Misture suavemente as células para fazer uma suspensão de célula única.
3. No ensaio de célula de | Passo Descrição pasta, selecione a Descrição do conjunto corrente canal/etapa e, na lista de canais, selecione apenas o canal atual de interesse e definido para On (aberta) e definir todos os outros sete canais para fora (fechado).
4. Selecione o ensaio de pilha de | Passo Descrição pasta e clique em Executar a etapa de ensaio.
   Nota: Certifique-se que Taxa de fluxo variável distribuição aplica-se pressão negativa constante para puxar a suspensão de leucócitos do reservatório de entrada através do canal por 5 min (conjunto de cisalhamento = constante, a tensão de cisalhamento =-0,50 Dina/cm², duração = 00:05:00, Varredura de atraso = 00:00:00). O valor negativo da tensão de cisalhamento garante a direção correta do fluxo.
5. Aspire os leucócitos restantes do reservatório de entrada.
6. Adicione 100 µ l de meio RPMI completo para o reservatório de entrada. Selecione pasta de Descrição da célula de ensaio/etapa e clique em Executar a etapa de ensaio para perfundir o canal por 5 min com meio RPMI para lavar todos os leucócitos não-aderente (conjunto de cisalhamento = constante, a tensão de cisalhamento =-0,50 Dina/cm², duração = 00: 05:00, Scan delay = 00:00:00).
7. Adquira imagens de pelo menos três ou quatro diferentes posições do canal a imagem aderidos leucócitos (para garantir que áreas representativas são capturadas).
8. Repita as etapas 8.1 – 8,7 para avaliação funcional de todo o resto dos canais.
   Nota: É possível executar vários canais ao mesmo tempo. Para fazer isso, abra todos os canais de interesse durante a etapa de 8.3. e executar todos os acima mencionados etapas 8.4 –8.7 para múltiplos canais de interesse.

9. completar o ensaio e limpar a bomba Microfluidic

1. Depois de completar a experiência, exportar e salvar todas as imagens em formato RAW.
2. Ao salvar os resultados, execute a bomba microfluídicos e colector de protocolo de limpeza.
3. Para a bomba microfluídicos, execute a pasta de Washout/bomba Washout primeiro por perfusing 4 mL de água de grau de cultura celular, seguido de 4 mL de 80% etanol como descrito nos passos 6.6 – 6,7 seco a bomba executando ar por vários minutos.
4. Para limpar o colector, execute a etapa de Lavagem lavagem/Manifold com a seringa. Siga as etapas para abrir a seringa e as válvulas manifold que está descrita em etapas 6.10 – 6.11 lavar primeiro com 80% de etanol e próximo com água de grau de cultura de células. Seca o distribuidor empurrando o ar através da seringa. Feche a válvula da seringa e as válvulas manifold conforme descrito nas etapas 6.10 e 6.15.

10. contagem de leucócitos aderentes

1. Baixe e instale a software¹⁴ de http://cellprofiler.org de processamento de imagem.
   Nota: Imagem de processamento neste estudo foi realizada utilizando o software versão 2.1.1. Se usando uma versão mais recente, o gasoduto pode exigir adaptação menor.
2. Baixar o pipeline Count_leukocytes.cpipe. Clique em arquivo de | Importação | Pipeline de do arquivo e navegue no PC para escolher o oleoduto Count_leukocytes.cpipe.
3. Arrastar e soltar uma pasta com imagens RAW adquiridas de leucócitos aderentes para a janela de lista de arquivo nos módulos entrada | Imagens seção para análise.
4. Especificar o tamanho típico de leucócitos através de módulos de análise de | IdentifyPrimaryObjects. Especifica o diâmetro mínimo e máximo de leucócitos aderentes em pixels.
5. Selecione os critérios de filtragem através de módulos de análise de | FilterObjects. Especifica a área minimamente aceite de objetos em pixels.
6. Inicie a análise, premindo o botão analisar imagens .
   Nota: Todas as imagens RAW serão processadas, e os resultados serão salvos em uma pasta de saída padrão. O arquivo de saída de Image.txt contém o número de leucócitos aderentes em cada imagem processada (cada número corresponde a uma imagem, ou seja, cada adquirida campo de visão).

Em primeiro lugar, a resposta do hiPSC-ECs à estimulação com agente pro-inflamatórios TNFa deve ser analisada, como descrito anteriormente7. Tratamento de TNFa para 12h aciona o upregulation de E-selectina com o pico a 6 h após início do tratamento. Além disso, o ICAM-1 é upregulated 6-12 h pós-tratamento. Embora nós não observaram o esperado upregulation de VCAM-1, é normalmente observada em células endoteliais da veia umbilical humana primária (HX). Encontramos o tratamento de TNFa (12 h) durante a noite para ser o mais conveniente para o ensaio de adesão de leucócitos.

Dissociação hiPSC-ECs ideal deve resultar em uma suspensão de célula única livre de aglomerados de células. A Figura 2 ilustra a densidade ideal hiPSC-CE logo após a injeção. Normalmente, 15 min após a injeção, hiPSC-ECs anexar para o fundo do canal e começarem a se espalhar (Figura 2D). 1 h após a injeção, hiPSC-ECs formar uma monocamada bem distribuída ao longo do canal e estará prontos para começar o ensaio de fluxo (Figura 2E).

Rotulagem de leucócitos com marcador fluorescente é benéfico para fase automatizado de imagens de contraste na quantificação de imagem, como facilita a etapa de identificação de célula, especialmente porque os leucócitos aderirem a monocamada de ECs e é frequentemente difícil software distinguir diferentes tipos de células.

Livre open source software processamento de imagem é muito útil para a quantificação automatizada dos leucócitos aderentes. O pipeline descrito no protocolo aqui baseia-se na identificação do objeto primário usando limiarização adaptativa de imagens fluorescentes de leucócitos (Figura 4A). Filtragem de identificados objetos com base em uma área mínima adicionalmente filtra falsamente identificados objetos, tais como os restos celulares, autofluorescência ou qualquer outro específico fluorescente sinal (Figura 4 C, D).

Um único chip microfluidic com oito canais paralelos permite a comparação de dois grupos independentes, por exemplo, a ECs diferenciada de hiPSCs independentes, tais como doadores saudáveis ou pacientes com desordens genéticas. Controles adicionais, tais como a ECs não tratada, ou tratamento prévio com um anticorpo de bloqueio de ICAM-1 podem ser incluídos como bem10,11. Dois ou três chips de microfluidic podem ser processados em um momento. Para a solidez das conclusões, é recomendado um mínimo de três experimentos biológicos independentes realizada no dias independentes.

Figura 1 : Preparação de hiPSC-ECs e leucócitos para o ensaio de fluxo. (A) pré-tratamento da hiPSC-ECs com o estímulo pro-inflamatórios (TNFa). (B) representação esquemática de dissociação enzimática hiPSC-ECs, centrifugação e ressuspensão. (C) representação esquemática de revestimento dos canais (C, à esquerda), injeção de suspensão de hiPSC-CE (C, médio) e adição de meio de cultura após fixação hiPSC-ECs no chip microfluidic da pilha. (D) representação esquemática da etapa de lavagem de leucócitos, etiquetando com corante fluorescente DiOC6 e ressuspensão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Microfluidic chip com ECs-hiPSC. (A) Microfluidic chip em uma placa de Petri de 10 cm. (B) a câmara umidificada usada para incubação. (C, D, E) Imagens representativas de hiPSC-ECs no microfluidic canal 0 min (C), 15 min (D), 1 h (E) após a injeção. Barra de escala = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Instalação experimental célula viva imagem e leucócitos perfusão do ensaio de. (A, B) Foto (A) e esquema de representação (B) da instalação experimental do ensaio ao vivo celular imagem e fluxo: (1) - microscópio fluorescente invertido com montada ao vivo de imagens câmara (5% CO2, 37 ° C, umedecido), (2) - microfluidic a bomba, (3) - 8 canais Manifold, (4) PC - PC para aquisição controle e imagem de microscópio, (5) - para controle de bomba microfluidic. (C) Microfluidic chip com o tubo inserido de um tubo de 8 canais fixos em um suporte de placa e montado na fase motorizada do microscópio. (D) representação esquemática das principais etapas do ensaio do fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Imagem de análise e detecção automática de leucócitos aderentes. (A) a janela de diálogo da imagem processamento software com configurações especificadas para a identificação de leucócitos. (B) a janela de diálogo do software de processamento de imagem com filtragem especificado critérios dos objetos identificados com base em minimamente aceitaram a área de superfície (SAmin = 70 px). (C) exemplo de correta identificação de leucócitos e filtragem de objetos de não-específica da área de superfície pequena (SA) (diâmetro típico em pixel (Min, Max) = (9, 15); Filtragem de critérios SAmin = 70 px). Aceitados objetos são representados em verde e objetos descartados são descritos em violeta. (D) exemplo de identificação incorreta de leucócitos devido à variedade incorreta de diâmetro típico (diâmetro típico em pixel (Min, Max) = (3, 15); Filtragem de critérios SAmin = 70 px). Aceitados objetos são representados em verde e objetos descartados são descritos em violeta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada para divulgar.