Estenose Atrial Esquerdo induzida Arterialization venoso pulmonar e hipertensão pulmonar do grupo 2 no rato

Resumo

Estenose atrial esquerdo (LAS) é uma nova técnica cirúrgica para estudar os mecanismos subjacentes arterialization venoso pulmonar e hipertensão pulmonar do grupo 2 (PH). Aqui, apresentamos um protocolo para contrair o átrio esquerdo usando um clipe de titânio para causar arterialization venoso pulmonar e moderar o PH em um rato.

Resumo

Desconhece-se o mecanismo de arterialization de venosa pulmonar induzida por estenose mitral e hipertensão pulmonar do grupo 2 (PH). Não há nenhum modelo de roedor do grupo 2 de PH, devido à estenose mitral (MS), para facilitar a investigação dos mecanismos da doença e possíveis estratégias terapêuticas. Apresentamos um modelo do rato de romance de pulmonar venosa induzida por congestão pulmonar venosa arterialization e grupo 2 PH causada por estenose atrial esquerdo (LAS). LAS é conseguida pela constrição do átrio esquerdo usando um clipe de titânio semi-cerrados. Após a cirurgia de LAS, um rato modelo com uma velocidade de fluxo transmitral maior que ou igual a 2,0 m/s na ecocardiografia se desenvolve gradualmente arterialization venoso pulmonar e grupo 2 PH ao longo de um período de 8 a 10 semanas. Neste protocolo, nós fornecemos o procedimento passo a passo de como realizar a cirurgia de LAS. O modelo de rato de LAS apresentado imita MS em humanos e é útil para estudar o mecanismo molecular subjacente de arterialization venosa pulmonar e para a avaliação pré-clínica de terapias para o grupo 2 PH.

Introdução

O objetivo deste artigo é demonstrar o procedimento passo a passo de como realizar a cirurgia de LAS em ratos. Cirurgicamente induzido LAS estreitamente imita MS e cor triatriatum em seres humanos, que envolvem a criação de uma obstrução mecânica no átrio esquerdo¹. Obstrução da afluência de (LV) ventricular esquerda muitas vezes faz com que uma congestão da circulação venosa pulmonar, e os pacientes desenvolvem gradualmente o PH. A Organização Mundial de saúde classifica o PH devido a doenças do coração esquerdas no grupo 2, que é o grupo mais prevalente de PH^2,3,4. O diagnóstico de PH em pacientes com doenças do coração esquerdos é associado com um maior do que um aumento de sete vezes na mortalidade padronizada de 1 ano⁴. Atualmente, não há nenhuma terapia aprovada para o grupo 2 PH além de tratamento à base deixou de doenças do coração (por exemplo, cirurgicamente, substituindo a válvula mitral estenóticas). No entanto, nem eficaz da válvula mitral substituição não resolver PH totalmente em até a metade dos pacientes com MS⁵. Este PH persistente é devido adverso pulmonar vascular remodelação, que é mal compreendido. Portanto, modelos animais são importantes para melhorar a nossa compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes de adversos remodelamento vascular pulmonar no grupo 2 PH.

Existem alguns modelos animais do grupo 2 pH arterial coronariana ligadura^6,7 e transversal da aorta faixas^8,9,10 em roedores são os mais usados modelos animais do grupo 2 PH. A grande desvantagem destes modelos é o envolvimento de LV, que faz com que o resultado dos estudos de PH do grupo 2 difíceis de interpretar. Em contraste, a LV permanece intacta no modelo de LAS. Além disso, o modelo de LAS é clinicamente relevante, porque resulta na evolução lenta e progressiva do PH durante um período de 10 semanas¹¹. Em humanos, MS é considerada significativa se a velocidade de fluxo Doppler transmitral for superior a 2,0 m/s¹¹, e também utilizamos este número como um disco de corte para determinar se a cirurgia de LAS produziu estenose significativa. Além disso, embora o modelo de LAS gera PH ligeira ou moderada, ele demonstra alterações histológicas características, semelhantes em pacientes humanos, nomeadamente o desenvolvimento de arterialization venoso intrapulmonar¹¹. O modelo do rato de LAS é um modelo de PH clinicamente relevante grupo 2 com função preservada de LV e romance. É apropriado para o estudo da fisiopatologia de remodelamento vascular pulmonar persistente, identificando alvos moleculares e testes de novas terapias para o grupo 2 PH.

Protocolo

O protocolo experimental de LAS foi aprovado pelo Jikei University escola de medicina Animal conta Comité e a pesquisa universitária e o Comitê de ética (protocolo #2015-118).

1. pré-operatório preparação

1. Depois de chegar à instalação de animais, fornecem ratos Sprague Dawley masculinos de 5 semanas entre 150 a 200 g com 1 semana se adaptar à sua nova casa antes da operação.
2. Preparar os seguintes equipamentos antes da cirurgia em autoclave: 1) é um pequeno animal respirador 2) uma máquina de anestésica, 3) um kit de intubação (composto por um par de pinças pinça hemostática, abaixador de língua e um angiocatheter de 18g), instrumentos 4) cirúrgicos (que incluem um par de pinças curvas, um par de pinças reta, um condutor de agulha, um afastador de tórax, um par de tesouras, uma sutura de monofilamento de 5-0, um aplicador de clip, clipes de médio-grande e um tubo de 23 G).
3. Tenho estéril cotonetes e gaze pronto para lidar com sangramento.
4. Use uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo animal em torno de 37 ° C durante a cirurgia.

2. anestesia e intubação endotraqueal

1. Anestesia o rato em uma câmara de indução com 5% de isoflurano misturado com o ar do quarto de 2 L/min.
2. Antes da intubação, raspar os pelos do peito do rato com um barbeador cabelo e aplicar o creme depilatório para remover pelos finos.
3. Verifica o reflexo de pedal para confirmar o sucesso anestesia antes da intubação.
4. Ligar os dentes da frente com uma sequência de caracteres e fixar a sequência com dois pinos.
5. Abra a boca do rato com o fórceps hemostático e insira o abaixador de língua na boca.
6. Levante o abaixador de língua para visualizar as cordas vocais.
   Nota: É útil brilhar uma luz forte sobre a região da cabeça do rato para ajudar a visualizar as cordas vocais.
7. Inserir o angiocatheter de 18 G como um tubo endotraqueal na traqueia e em seguida, rapidamente, se conectar o cateter para o respirador.
8. Defina o volume corrente de 10 µ l por grama, com uma frequência respiratória de 100 respirações por minuto.
9. Manter a anestesia com isoflurano 2% misturado com o ar do quarto de 2 L/min.

3. preparação do local cirúrgico

1. Prepare o local cirúrgico com a alternância de esfoliantes de clorexidina e álcool x3.
2. Dar a buprenorfina 0,01 mg/kg por via subcutânea.
3. Cobrir o rato com um pano estéril.
4. Verifica o reflexo de pedal para confirmar uma intubação bem sucedida e a manutenção da anestesia.

4. esquerdo estenose Atrial cirurgia

1. Marca o local da incisão de 2 cm abaixo da axila esquerda do rato com uma regra.
2. Faça um cm 2 deixou a incisão de parede lateral no peito com uma tesoura.
3. Separe os músculos intercostais entre a quarta e a quinta costela, usando o reto e a pinça curvada, até entrar na cavidade do peito.
4. Inserir o afastador de tórax na cavidade torácica. Continue a usar a pinça de reta e curva para separar o músculo intercostal para obter uma visualização directa do Timo e o coração.
5. Levante o Timo com um par de pinças reta. Remova o Timo cobrindo o coração com um par de tesouras. Evite cortar ou picar em quaisquer vasos sanguíneos.
6. Passe cuidadosamente uma sutura de monofilamento de 5-0 através da superfície do ventrículo esquerdo, logo abaixo do apêndice atrial esquerdo. Evite passar a agulha através das artérias coronárias principais.
7. Após a sutura está no lugar e não há nenhum sangramento significativo, um nó solto.
8. Puxe o fio de sutura e para frente para levantar o coração fora do peito.
9. Uma vez que o coração é levantado fora do peito, aplica rapidamente um clipe de médio-grande para o átrio esquerdo, logo acima da válvula mitral.
   Nota: O clipe é meio fechado, com a ponta do clipe beliscar o átrio esquerdo, causando estenose atrial esquerdo.
10. Rapidamente colocar o coração no peito. Certifique-se de coração não é fora do peito por mais de 30 s.
11. Remova a sutura de estadia usada para levantar o coração.
12. Feche o peito com uma sutura de monofilamento de 5-0, usando um padrão simples interrompido.
13. Inserir um tubo de 23 G, ligado a uma seringa de 10 mL no peito e em seguida, prosseguir com um fecho no peito parede músculo e pele com suturas interrompidas simples.
14. Tirar qualquer ar, sangue e derrame pleural através do tubo inserido no peito, usando a seringa de 10 cc anexado e, puxe o tubo.
15. Feche a camada de pele com uma sutura de monofilamento de 5-0, usando um padrão simples interrompido.
16. Dar a buprenorfina 0,01 mg/kg por via subcutânea.
17. Desligue o isoflurano.
18. Desligar o respirador após observa-se respiração espontânea.
19. Mantenha o rato intubado e deixe-o recuperar na rampa de aquecimento até que acorde.
20. Com segurança os tubos o rato depois de um ou mais dos seguintes sinais são observados: o rato começa a se mover seus quatro membros, recupera seu braço endireitante reflex, recupera a sua ânsia de vômito ou exibe da micção espontânea.

5. no pós-operatório cuidados

1. Cada 8-12 h, dar buprenorfina 0,01 mg/kg por via subcutânea. Carprofeno 5 mg/kg é dada por via subcutânea em uma base diária, para 2 dias e, em seguida, conforme necessário, se o rato não está se movendo bem e parece que está a sofrer.
2. Dê 5 mL de solução salina por via subcutânea logo após a cirurgia, como o rato pode ter dificuldade em beber da torneira de água, imediatamente no pós-operatório.

6. confirmação do sucesso da estenose Atrial Esquerdo com ecocardiografia

1. Execute uma ecocardiografia transtorácica 2 semanas após a cirurgia para determinar a velocidade de entrada de LV.
2. Anestesia o rato seguindo as etapas descritas na seção 1.
3. Após a indução da anestesia, manter a anestesia, usando um cone de nariz com 2% de isoflurano misturado com o ar do quarto de 2 L/min.
4. Raspar a parede do peito do rato com um barbeador cabelo e usar creme depilatório para remover os pelos restantes.
5. Coloque a sonda de ultra-som no ápice do coração, que é em torno do quinto espaço intercostal no lado esquerdo do peito. Deslocar a sonda nesta região até à obtenção de uma boa visão de quatro câmaras.
6. Medir a velocidade de entrada de LV usando o modo de onda pulsada Doppler logo acima do anel da válvula mitral.
7. Uma velocidade de influxo de LV superior a 2,0 m/s é necessária para o desenvolvimento de hipertensão pulmonar moderada na cirurgia de 8-10 semanas pós-LAS.

7. operação sham

1. Exceto para aplicar o clipe (etapa 4.9), execute todas as etapas acima para criar ratos idade-combinada, operação de controle (SOC).

Resultados

A eficácia da LAS é confirmada usando a Ecocardiografia, 2 semanas de pós-operatório. Ratos com uma velocidade de influxo de LV superior a 2,0 m/s, medidos com uma visão de quatro câmaras, são considerados desenvolveram estenose significativa (Figura 1) e confiantemente desenvolver PH moderado e a arterialization venosa pulmonar 8-10 semanas pós-LAS cirurgia.

Cirurgia pós-LAS de dez semanas, os rato...

Discussão

O rato-LAS é um modelo de PH de romance grupo 2 que já recebeu um interesse substancial de pesquisadores no campo^12,13. Comparando com os dois modelos de grupo 2 existentes, nomeadamente a veia pulmonar estenose (PVS) modelo¹⁴, usando leitões e a supracoronary da aorta bandas (SAB) rato modelo^8,9,10, o modelo do rato de LAS tem vários vantagens. C...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
5-0 Sutura de Prolene	Johnson & Johnson - Ethicon	8725H	Sutura de polipropileno com tecnologia HEMO-SEAL
Máquina de anestesia	Wakenyaku Co., Ltd.	BRTK-100A	Bomba de ar e máquina de anestesia
Fio-guia de angiocateter	Fio-guia de		colado a uma seringa de 1 cc
Afastador de tórax	Natsume Seisakusho Co., Ltd.	F-2
Tubo torácico 23G	Seringa de	10 cc de fabricação própria presa a uma agulha 23G mais tubo de plástico
		A-14
Almofada de aquecimento	Vivaria	MP-916-NV	Mantenha a temperatura corporal a 37 graus Celsius
Horizon Ligating Clips	Teleflex	REF 003200	Tamanho Médio-Grande
Horizon Manual-Load Ligating Clip Applier Para Tamanho Médio-Grande Horizon	Teleflex	REF 337085	Clips de Ligadura Anglada, (20cm)
Porta-agulha	Natsume Seisakusho Co., Ltd.	MC-40
Respirador para roedores	CWE Inc	SAR-830 / P	Tesoura para ventilador para pequenos animais
	Natsume Seisakusho Co., Ltd.	B-12	Tesoura reta idealmente com pontas redondas
Pinça reta	Natsume Seisakusho Co., Ltd.	A-7
Abaixador de língua	Uchida Yoko Co., Ltd.	8-615-2417	Use a extremidade larga

10 cm feito por ele mesmo Pinça curva Natsume Seisakusho Co., Ltd.