Escherichia coli-baseado sem célula de síntese de proteínas: protocolos para uma tecnologia de plataforma robusta, flexível e acessível

Max Z. Levine; Nicole E. Gregorio; Michael C. Jewett; Katharine R. Watts; Javin P. Oza

doi:10.3791/58882

Artigo de método

Escherichia coli-baseado sem célula de síntese de proteínas: protocolos para uma tecnologia de plataforma robusta, flexível e acessível

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DOI:

10.3791/58882

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25 de fevereiro de 2019

Max Z. Levine^*¹^,² , Nicole E. Gregorio^*²^,³ , Michael C. Jewett⁴^,⁵^,⁶^,⁷ , Katharine R. Watts²^,³ , Javin P. Oza²^,³

¹Department of Biological Sciences, California Polytechnic State University, San Luis Obispo, ²Center for Applications in Biotechnology, California Polytechnic State University, San Luis Obispo, ³Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University, ⁴Department of Chemical and Biological Engineering, Northwestern University, ⁵Chemistry of Life Processes Institute, Northwestern University, ⁶Center for Synthetic Biology, Northwestern University, ⁷Interdisciplinary Biological Sciences Program, Northwestern University

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo detalha as etapas, custos e equipamentos necessários para gerar Escherichia coli-com base em extratos de células e implementar em vitro reações de síntese de proteínas dentro de 4 dias ou menos. Para aproveitar a natureza flexível desta plataforma para aplicações de amplas, podemos discutir as condições de reação que podem ser adaptadas e otimizadas.

Resumo

Nos últimos 50 anos, a síntese de proteína sem célula (CFPS) emergiu como uma poderosa tecnologia para aproveitar a capacidade transcricional e translacional de células dentro de um tubo de ensaio. Por obviating a necessidade de manter a viabilidade da célula e eliminando a barreira celular, CFPS tem sido fundamental para aplicações emergentes em biomanufacturing de proteínas tradicionalmente desafiadores, bem como aplicações em prototipagem rápida para engenharia metabólica e genômica funcional. Nossos métodos para implementar um Escherichia coli-baseado em plataforma CFPS permitir que novos usuários acessar muitos desses aplicativos. Aqui, descrevemos os métodos para preparar o extrato com o uso de meios enriquecidos, frascos perplexos e um método reprodutível de lise celular baseado em sonication ajustáveis. Este extrato pode ser usado na expressão de proteínas capaz de produzir 900 µ g/mL ou mais de proteína fluorescente verde super pasta (sfGFP) em apenas 5 h de instalação experimental para análise de dados, dado que os estoques de reagentes apropriados foram preparados antecipadamente. O custo estimado de inicialização de obtenção de reagentes é $4.500 que sustentarão milhares de reações em um custo estimado de US $0,021 por µ g de proteína produzida ou $0,019 por µ l de reação. Além disso, os métodos de expressão de proteínas espelham a facilidade da instalação do reação vista em sistemas comercialmente disponíveis devido à otimização de misturas prévias de reagente, em uma fração do custo. A fim de habilitar o usuário alavancar a natureza flexível da plataforma para aplicações de amplas CFPS, nós identificamos uma variedade de aspectos da plataforma que pode ser ajustado e otimizado dependendo dos recursos disponíveis e os resultados da expressão da proteína desejado.

Introdução

Síntese de proteína sem célula (CFPS) surgiu como uma tecnologia que desbloqueou uma série de novas oportunidades para a produção de proteína, genómica funcional, engenharia metabólica e muito mais no âmbito do último 50 anos¹^,². Comparado ao padrão na vivo plataformas de expressão de proteínas, CFPS fornece três vantagens principais: 1) a natureza sem célula da plataforma permite a produção de proteínas que seriam potencialmente tóxicos ou estrangeiros para a célula³^,⁴ ^,