Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Proton pompalama membran enzimler elektrokimya ve floresan mikroskopisi kullanılarak incelenmesi için tek lipozom ölçümleri

Published: February 21, 2019 doi: 10.3791/58896
Automatic Translation
1, 2, 1
1School of Biomedical Sciences & the Astbury Centre for Structural Molecular Biology, University of Leeds, 2Department of Chemistry and Nano-Science Center, University of Copenhagen

Summary

Burada, proton translocation moleküler mekanizması tek lipozomlar, lipid membranlar üzerinde çalışmak için bir protokol sitokrom bo3 örnek olarak kullanarak mevcut. Birleştirerek elektrokimya ve floresan mikroskopisi, lumen tek veziküller, tek içeren veya birden fazla enzim, pH değişiklikler algıladı ve ayrı ayrı analiz.

Abstract

Elektron, Proton pompa enzimler zincirleri çift Redoks reaksiyonları proton translocation için ATP üretimi için kullanılan bir proton-sebep kuvvet oluşturma membran arasında aktarın. Membran proteinlerinin amfifilik doğası kullandıklarında daha özel dikkat gerektirir ve membran taşıma işlemleri proton translocation gibi okurken sulandırma doğal lipid ortamına vazgeçilmezdir. Burada, biz Escherichia coli örnek olarak sitokrom bo3 alarak membran Redoks enzimler, proton pompa mekanizması soruşturma için kullanılan bir yöntem ayrıntılı. Elektrokimya ve floresan mikroskopi bir arada quinone havuzu ve monitör pH değişiklikleri Lümen Redoks durumunu kontrol etmek için kullanılır. Floresan mikroskopi Uzaysal çözünürlük nedeniyle, lipozomlar yüzlerce enzim içeriği bir tek enzim ya da ışınlama lipozom başına ölçeklendirilebilir iken aynı anda ölçülebilir. İlgili tek enzim analizi okuduğunuzda, aksi takdirde tüm popülasyon davranış tarafından gizlenmiş olabilir enzim fonksiyonel dinamiklerini ortaya çıkarabilir. Otomatik görüntü analizi için bir komut dosyası için bir açıklama içerir.

Introduction

Enzim mekanizmaları ve Kinetik hakkında bilgi genellikle nerede bir istatistiksel ortalama ölçümleri temsil topluluğu veya macroscale düzeyde moleküller, milyonlarca binlerce enzim nüfus ile elde edilir. Bu, ancak, enzim kompleksi oluştururlar heterojenite onların davranış görülebilir ve moleküler mekanizmaları topluluk düzeyinde gözlenen her molekül için mutlaka geçerli değildir bilinmektedir. Bu tür sapmalar bireysel molekül ölçekte kapsamlı çalışmaları tek enzimler tarafından son yirmi yılda1sırasında ortaya çıkan yöntemler ile onaylandı. Özellikle, Floresans algılama bireysel enzim aktivitesinin enzim aktivitesi2,3 heterojen araştırmak veya sözde hafıza etkisi (düşük noktalarla başarılı yüksek enzim etkinlik dönemleri keşfetmek için kullanılan etkinlik ve tersi)4,5.

Birçok tek enzim çalışmaları enzimleri yüzey veya yeterince uzun sürekli gözlem için görüş alanı içinde kalmak için başka bir şekilde dağınık şekilde sabit immobilize gerektirir. Enzim kapsülleme lipozomlar içine herhangi bir olumsuz etkisi nedeniyle yüzey-enzim veya protein-protein etkileşimleri6,7önleme sırasında enzim tutuklaması etkinleştirileceği gösterilmiştir. Buna ek olarak, lipozomlar tek zar proteinleri onların doğal lipid bilayer çevre8,9,10eğitim için benzersiz bir imkanı verir.

Membran proteinlerinin, taşıyıcı, sınıf bir yön translocation maddelerin hücre zarı, proteinler lipid bilayers (örneğin, lipozomlar)11yeniden yükleyen sadece okudu bir davranış karşısında egzersizleri, 12,13. Örneğin, proton translocation prokaryotik ve ökaryotik elektron taşıma zinciri, çeşitli enzimler tarafından sergilenen, ATP sentezi için kullanılan bir proton-güdü güç oluşturarak önemli bir rol hücresel solunum oynar. Bu durumda, her ne kadar bu işlem detaylı mekanizmasının kez zor kalır etkinlik pompalama proton elektron transferi için birleştirilmiştir.

Son zamanlarda, Escherichia coli (sitokrom bo3) terminal ubiquinol oksidaz tek enzim aktivitesi pompalama proton çalışmaya elektrokimya ile çift floresan algılama olasılığı gösterdi lipozomlar14' te yeniden düzenlendi. Bu bir pH duyarlı membran geçirimsiz floresan boya E. hazırlanan lipozomlar Lümen içine encapsulation sağlanır coli kutup lipidler (şekil 1A). Böylece çoğu lipozomlar ya yok ya da sadece bir Sulandırılan enzim molekül (göre Poisson dağılımı) içerdiği protein miktarı optimize edildi. Sitokrom bo3 iki yüzeylerde ubiquinone lipozomlar ve (ortam) oksijen çözümde oluşturulan lipid karışımı ekleyerek temin edilmiştir. Lipozomlar sonra seyrek 6-mercaptohexanol otomatik olarak birleştirilmiş bir monolayer ile kaplı bir yarı saydam yumușak altın elektrot üzerinde adsorbe. Son olarak, elektrot bir basit Spektroelektrokimyasal hücre (şekil 1B) altta monte edilir. Quinone havuzu Redoks durumu elektrokimyasal kontrol sağlar bir esnek tetiklemek için veya pH duyarlı boya proton translocation tarafından bir sonucu olarak lipozomlar Lümen içinde pH değişiklikleri izlemek için kullanıldığı gibi her an enzimatik reaksiyon durdurmak için enzimler. Bir ikinci, lipid bağlı floresan boya, boyutu ve bireysel lipozomlar hacmi floresan yoğunluğu belirlenebilir ve enzim proton pompalama aktivitesi miktar kullanılarak böylece. Bu tekniği kullanarak, sitokrom bo3 molekülleri hızla proton sebep kuvvet kalır bir spontan kaçak durumuna girebilmesi için özellikle bulduk. Bu makalenin amacı tek lipozom ölçümleri ayrıntılı teknik tanıtmaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bir Lipid/UQ-10/FDLL karışımı hazırlanması

Not: E. coli lipidler lipozomlar hazırlanması için kullanılan bölünmemeli ve iyice karışık ubiquinone-10 (enzim Substratı) ve uzun dalga boyu floresan boya etiketli lipidler (lipozomlar boyutu tayini için) önce olmalıdır sulandırma.

  1. Cam kullanarak, kloroform stokunun polar lipit transfer 200 µL 5 mg aliquots yapmak için cam şişe Escherichia coli (25 mg/mL) ayıklayın.
  2. 1 mg/mL ubiquinone-10 50 µL ekleyin (UQ-10; kloroform) lipidler UQ-10 son oranı yapmak için: lipidler 1: 100 (% 1 w/w).
  3. 1 mg/mL (% 0,4 w/w) bir uzun dalga boyu floresan boya etiketli lipid (FDLL) 20 µL lipidler/UQ-10 karışıma ekleyin.
  4. Kloroform çözüm tarafından kısa vortexing homojenize ve nazik bir azot veya argon akışı altında kloroform çoğu buharlaşır. Kloroform izleri tamamen tarafından en az 1 h için vakum altında daha fazla buharlaşma.
    Not: Lipid aliquots-20 ° C'de inert bir atmosfer altında birkaç ay depolanabilir.

2. sulandırma sitokrom bo3

Not: sitokrom bo3 E. coliarıtma için protokol Rumbley ve arkizleyin. 15 yüksek saflıkta yerli katlanmış enzim örnekleri sağlamak için boyutu-dışlama Kromatografi Rumbley vd tarafından açıklanan benzeşme arıtma adım sonra ekleyin 15

  1. 4, pH 7.4, lipitler/UQ-10/FDLL kuru bir aliquot için (5 mg, adım 1.4) mix ve girdap ile mix lipit filmin tam 2 dk ultrasonik bir banyosu tedavisinin ardından resuspended kadar 40 mm paspaslar-KOH/60 mM K2312,5 µL ekleyin.
  2. 25 mM 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic asit (HPTS), lipozomlar içinde kapsüllü gereken bir pH duyarlı floresan boya 125 µL ekleyin.
  3. 250 mM n-Oktil β-D-glucopyranoside (OGP) yüzey aktif 137,5 µL eklemek, girdap kullanarak mix ve solüsyon içeren bir ultrasonik su banyosu için tüm lipidler yüzey aktif micelles çözündürüldükten emin olmak 10 dk temizleyicide. Dispersiyon 1,5 mL plastik tüpün içine aktarın.
    Not: Lipidler bulutlu süspansiyon ile yüzey aktif solubilization sonra şeffaf hale gelmelidir.
  4. Sitokrom bo3 gerekli miktarda ekleyin (aşağıdaki nota bakın) ve toplam hacmi 50 µL (sitokrom bo3 çözüm artı su) yapmak için ultrasaf su ekleyin. Bir silindir Mikser üzerinde 10 dk 4 ° C'de kuluçkaya.
    Not: Tipik tek enzim koşulları için 0,1-%0,2 miktardır (w/w protein lipid i.e. 5-10 µg protein), her ne kadar Eğer amaç sadece elektrokimyasal aktivite (aşağıya bakın) gözlemlemek için 1-%2 (50-100 µg protein) kadar artırılabilir. Bir negatif kontrol lipozomlar sitokrom bo3 olmadan hazırlanabilir.
  5. 2 x 50 mg ve 2 x 100 mg polistren lastikteki dört 1.5 mL-tüp kapakları tartmak ve kurutma önlemek için parafin film ile kapatın.
    Not: Kullanmadan önce polistiren lastikteki metanol, su ve Üretici kılavuzuna göre saklı içinde su ile yıkanmalıdır.
    Not: bir su/microbead karışımı kullanılırsa, polistren lastikteki elverişli bir konuma sahip geniş bir ipucu ile bir micropipette kapaklı aktarılabilir. Su sonra bir micropipette olan ince bir ipucu kullanarak lastikteki kaldırılabilir.
  6. Polistren lastikteki 1st50 mg dağılımı ile 1,5 mL-plastik tüp polistren lastikteki kapaklı koyarak ve kısa bir tur birkaç saniye sulandırma karışım (Adım 2.4) içine ekleyin. Yüzey aktif 30 dkiçin absorbe polistren lastikteki bir silindir Mikser üzerinde 4 ° C'de kuluçkaya.
    1. Polistren lastikteki ve incubations eklemeler aşağıdaki gibi yineleyin: 50 mg 60 dk , kuluçka; lastikteki Ekle 100 mg 60 dk , kuluçka için lastikteki ekleyin; ve 100 mg lastikteki 120 dk , kuluçka için ekleyin.
      Not: proteoliposomes oluşmuş gibi çözüm kapatılan lastikteki yukarıda adım 2.6 sırasında yarı saydam dönecek.
  7. Proteoliposome çözüm bir micropipette olan ince bir ipucu kullanarak polistren lastikteki ayırmak. 20 mM paspaslar-KOH/30 mM K290 ml dağılımı çok seyreltik4, pH 7,4 (MOPS arabellek) ve bir Ti45 ultracentrifuge tüp transferi.
  8. Ultracentrifuge dağılım türü 45 Ti kullanarak rotor 125.000 x g (at rmax) 1s proteoliposomes cips için de.
    Not: büyük arabellek birimindeki seyreltme sigara kapsüllü HPTS son süspansiyon konsantrasyon azaltmaya yardımcı olur, ancak daha küçük santrifüj tüpleri kullanılabilir.
  9. Süpernatant atmak,4, pH 7.4 arabellek böylece (Pelet resuspending olmadan) 20 mM paspaslar-KOH/30 mM K2ile granül durulayın. Durulama arabellek discarding sonra proteoliposomes BEZLERİ arabellek 500 µL içinde ileri geri ince uç micropipette ile pipetting tarafından yeniden askıya alma. Ardından 1.5 mL plastik tüp aktarın.
  10. Süspansiyon için enkaz kaldırmak için 12.000 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant (yeniden proteoliposomes) yeni bir şişe aktarın.
  11. Gecede Sulandırılan proteoliposomes dağılım 4 ° C'de depolayın ve 2 gün içinde kullanın.

3. fabrikasyon yarı saydam altın elektrot

Not: Şablon sıyırma yöntemi bir atomik yumuşak silikon gofret altından %99,99 30 nm-kalın tabakası pürüzsüz altın yüzey elde edilir. Floresans gözlem izin vermek için yarı saydam olmalı bu yana küçük altın katman kalınlığı önemlidir. Altın buharlaşma (fiziksel Buhar biriktirme, PVD) ayrıntılarını olmak bulabilirsiniz başka bir yerde16 ve tek şablon sıyırma kurtarıyorum. Alternatif olarak, ultra-yumuşak altın chips başka bir yerde ( Tablo malzemelerigörmek) satın alınabilir.

  1. BI-bileşen düşük-floresan epoksi kullanarak buharlaştırılmış altın yüzeyine kadar 9 cam kapak fişleri (0,17 mm kalınlığında) tutkal. 4 h için 80 ° C'de tutkal tedavi.
  2. Kendi kendine monte monolayer (Adım 4) ile sadece değişiklik önce cam kapak makbuzları silikon gofret üzerinden bir bıçak ile bağlantısını kesin. Kapak paket fişi zayıflık nedeniyle paket fişi değil çatlamak ya da cam slaytlar kırmak için kapak ayırma zaman dikkat et.

4. kendi kendine monte Monolayer (SAM) ile altın yüzey modifikasyonu

  1. 5 mL su lik 1 mM 6-mercaptohexanol (6MH) hazırlayın.
  2. Taze müstakil altın kaplamalı kapak fişleri (Adım 3.1) 6MH çözüm daldırma ve 20-25 ° C'de gece bırakın (> 16 h) SAM oluşturmak için.
    Not: bir Kapalı potada altın kaplamalı kapak notu kuluçka kullanılmalıdır Thiol çözümleri hoş olmayan bir koku var.
  3. Ertesi gün, altın kaplamalı kapak notu 6MH eriyik--dan kaldırmak için kısaca su veya metanol ve sonra isopropanol ile yıkayın. Kuru bir yumuşak gaz akışı altında.

5. elektrokimyasal Proteoliposomes etkinliğini test

Not: Enzim elektrokimyasal aktivite ilk yakından paketlenmiş lipozomlar katmanda (5. adım) doğrulanır ve alt vezikül özel kapsamlı tek veziküller deneyde lipozomlar (adım 6) Lümen pH değişiklikleri ölçmek için kullanılır.

  1. Altın kaplamalı kapak notu spectro elektrokimyasal hücrede birleştirin (bkz. şekil 1). Yapmak bir lastik O-ring tarafından tanımlanan bir alanı dışında düz tel altınla ilgili kişi.
  2. 2 mL elektrolit tampon çözeltisi ekleyin ve başvuru ve yardımcı elektrotları hücreye yerleştirin.
    Not: Olarak daha fazla tartışma bölümünde ele, başvurular elektrotlar klorür olmadan Au (I) elektrokimya sırasında Cl oluşumunu önlemek için tercih edilmektedir. Burada, Hg/Hg2SO4 (oturdu. K2SO4) referans elektrot kullanılır ve potansiyelleri verilen standart hidrojen elektrodu (o) karşı 0.658 V vs o istimal için Hg/Hg2SO4 (uydu. K2kadar4).
  3. Elektrokimyasal empedans spektroskopisi (0.1 Hz-100 kHz) SAM kalitesini değerlendirmek için açık hücre potansiyel (OTM) potansiyel çalıştırın. Empedans değerlerini dönüştürmek için başvuruda ve ω frekans nerede bir Cole-Cole arsa arsa için 2πω tarafından bölmek (aşağıdaki başvuruları16,17,18 dönüştürme ve empedans yorumlama hakkında ayrıntılı bilgi için bkz: Spectra).
    Not: 6MH sık ve yoğun SAMs yakın bir yarı daire Cole-Cole arsa için vermek ve kapasite değerleri aralığında 2.5-3.0 µF/cm2 (şekil 2A) vermek gerekir. Yarı daire şekli veya aralık dışı kapasitans değerleri önemli sapma aldıysanız, elektrot değiştirin.
  4. Tarama gore 100 ve 10 mV/s-0.3-potansiyel bölgesinde boş çevrimsel voltammograms (CVs) çalıştırmak 0.8 V. Tipik bir CV (şekil 2Büzerinde Kesikli çizgi) gösterilir.
    Not: Bu neredeyse saf kapasitif davranış ve önemli faradaic akım, ortam oksijen koşulları altında bile olmayışı burada kullanıldığı şekliyle göstermelidir.
  5. Elektrokimyasal hücre proteoliposomes (0,5 mg/mL son lipidler konsantrasyon, sitokrom bo3 lipid oranı % 1-2 (w/w)) ekleyip biraz bir pipet ile karıştırın. Proteoliposomes elektrot yüzeyinde adsorpsiyon bitmiş (30-60 dakika oda sıcaklığında) tamamlanana kadar bekleyin.
    Not: 10 mV/s'de çevrimsel voltammograms (CVs) süreci takip etmek proteoliposomes adsorpsiyon sırasında çalıştırabilirsiniz. Ardışık CVs değiştirme durdurduğunuzda adsorpsiyon sona erdi. CV teknikler hakkında bilgi aşağıdaki kitaplarında bulunur. 19 , 20
  6. En az 10 kez arabellek çözüm değiştirerek hücre yıkayın ama elektrot yüzeyi tamamen kuru bırakarak kaçmak.
  7. Elektrokimyasal empedans spektroskopisi OCP (altın elektrot SAM değişmeden kalır onaylamak içinşekil 2A, mavi çizgi) çalıştırmak ve CVs ile oranları 10 ve 100 mV/s katalitik ubiquinol oksidasyon (ve oksijen azaltma) tarafından sitokrom gözlemlemek için tarama Bo 3 ' te elektrokimyasal quinone azaltma 0 V vs o hakkında potansiyelleri başlangıçlı) (şekil 2B).

6. Enzimatik Proton pompalama Floresans mikroskobu tarafından algılanması

  1. Adım 5 ancak 100 adım 5.5 (Yani, 5 µg/mL)'e göre daha az proteoliposomes x kullanarak altın elektrot değiştirin. Tek enzim çalışmaları için sitokrom bo3 için 0,1-0,2 lipid oranı azaltmak % (w/w).
    Not: Lipozomlar seyrek tek vezikül Floresans mikroskobu ile izlemeyi etkinleştirme elektrot yüzeyinde absorbe. Bu tek-enzim koşullar altında elektrot yüzeyinde immobilize enzim miktarda bir katalitik akım gözlem için yeterli değil.
  2. Elektrokimyasal hücre bir ters Floresans mikroskobu bir damla daldırma yağı ile yağ amacı (60 X) yerleştirin. FDLL floresan için uygun filtreleri kullanarak, elektrot yüzeyinde odaklan. Tek lipozomlar mikroskop/amaç kırınım limitte parlak noktalar olarak görünmesi gerekir. FDLL floresan görüntüsünü alın.
  3. Geçiş HPTS floresan filtre setlerinde HPTS floresan açıkça görünür ve arka plan ayırt olduğunu doğrulamak için mikroskop birine (seçilen çekim hızı adıma 6.4 bakın). Durumda ise ışık yoğunluğunu artırmak.
  4. HPTS filtre iki alternatif bir zamanlanmış resim alma gerçekleştirmek için belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı programı (menü uygulamaları | ND Alım Define/Run). En azından görüntü satın almalar arasında gecikme ayarlayın. Bu deneyde, 1 s pozlama ve 0.3 s gecikme (nedeniyle taret hareket) kullanın.
    Not: Bu iki kanal Koyulukları Floresans arasındaki oran pH, her zaman bir noktada lipozomlar içinde daha sonra dönüştürülür. Satın alma süresi beklenen pH değişim oranı göre değişebilir; 5 dk bu makalede kullanılır.
  5. Potansiyel resim alma sırasında değiştirmek için potansiyostat ayarlarını değiştirmek. Örneğin, bu denemede aşağıdaki sırayı kullanmanız: 0-60 s: hiçbir potansiyeli uygulanan (Yani OCP); 60-180 s-0.2 V (vs o); 180 – 300 s: 0,4 V (vs o). Bu durumda, yalnızca ikinci aşamasında uygulanan potansiyel (-0.2 V vs o) verimli bir şekilde quinone havuzu azaltmak için yeterli olur.
  6. Aynı anda zamanlý görüntüleri alımı (mikroskop) ve olası sıra (potansiyostat) el ile aynı anda her iki ölçümler başlatarak çalıştırın.
    Not: Deney aynı elektrot birkaç zaman mikroskop sahne farklı bir alana yüzeyinde hareket ettirerek tekrar edilebilir. Satın almalar arasında gecikme en az 5-10 lipozomlar yüzeyi tam pH denge sağlamak üzere min olmalıdır. Zaman Imaging Alım sırasında HPTS photobleaching nedeniyle sınırlı olmasına rağmen farklı süreleri ve potansiyel desenleri ihtiyaç bağlı olarak uygulanabilir.

7. floresan görüntü analizi

Not: Tipik bir deney her iki kanal, Yani, için bir saat adım (Örneğin, 2.6 s) ile görüntüleri bir dizi üretir (süresi * 2 / 2.6) görüntüler. Bir tek enzim deneme sırasında kaydedilen ayarla gibi görüntü örneği araştırma veri Leeds depo21erişilebilir. Bir görüntü tedavi Fiji (ImageJ) ve üst düzey matematik analiz programlama dili yazılım (yazılım komut dosyası olarak Tablo reçetesi ayrıntılarını görmek için bundan böyle adlandırılır) kullanarak birkaç adımdan oluşur.

  1. Fiji, görüntüleri hizalamak zaman atlamalı dosya ayırmak ve ayrı kanalları ve zaman dilimleri kaydetmek için kullanın.
    1. Fiji içinde sağlanan Bioformats İthalatçı kullanarak açık zaman atlamalı dosyası (makro komutu: ("biyo-biçimleri İthalatçı") çalıştırmak).
    2. Her çerçeve için olası sahne hareketleri için hesap için birinci hizalamak için eklenti StackReg kullanın veya termal drift satın alma sırasında oluştu (makro komutu: çalıştırmak ("StackReg", "dönüşüm çeviri =")).
    3. Her kanal ve her saat adım için ayrı sıkıştırılmamış görüntü dosyaları TIFF biçiminde tek bir klasöre kaydedin.
    4. Her karenin tam zaman damgalarını zaman atlamalı dosya meta verileri ayıklamak ve görüntüleri aynı klasörde bir CSV dosyası olarak kaydedin. Alternatif olarak, satın alma yazılımı kullanarak zaman damgaları ayıklamak ve el ile bir elektronik tablo yazılımı kullanarak bir CSV dosyasını kaydedin.
      Not: Zaman damgaları ve görüntü klasör şimdi komut dosyası yazılım tarafından çözümlenmesi hazır olur. Adımları 7.1.1. -7.1.4. Fiji komut dosyası kullanarak automatized (zaman atlamalı dosyaları toplu işleme sağlanan için Python ile yazılmış bir komut dosyası kullanarak "Ctrl-üst karakter-N" (içinde pencere eşiği), sonra dosya | Açık komut dosyası yüklemek için).
  2. Komut dosyası yazılım automatized görüntüleri işleme için kullanın. Yazılım verilen kodu yük ve Bitiş için Çalıştır' ı tıklatın. Sorulduğunda, adım 7.1 görüntüleri içeren klasörü seçin.
    Not: Bir komut dosyası çözümleme için tek lipozomlar belirlemek, bunları 2D-Gauss işlevine uygun, onları filtre ve zaman her noktada pH değerleri ölçmek için geniş yorum ile mlx formatlı canlı komut dosyası olarak sağlanır. Aşağıdaki alt adımları otomatik olarak komut dosyası tarafından yürütülür.
    1. Tüm zamanların çerçeveler görüntüleri tek bir deneme için belleğe yüklemek.
    2. Tüm resimler tek kanal (seçim en yüksek floresan yoğunluğu ile kanal) için ortalama ve ortalama görüntü tek lipozomlar karşılık gelebilir tüm en yüksek değerler tanımlamak için kullanın.
    3. 2D-Gauss için ortalama resme saptanan en yüksek değerler işlev ve sonuçlandı kaydetmek uygun uygun her lipozom için parametreleri ( şekil 4A için donatılmış lipozom örneğe bakın).
    4. En yüksek değerler boyutu, Döngüsellik ve yoğunluğu gibi beklenen tek lipozomlar ölçütlere göre filtre uygulayın. Düşük sinyal gürültü nedeniyle kötü donatılmıştır lipozomlar reddetmek, yakından lipozom komşu veya olmak da görüntü kenarına yakın.
    5. Zaman damgaları dış dosyadan yüklemek ve filtre uygulanmış her lipozom 2D-Gauss işlev her zaman dilimi görüntü üzerinde ayrı ayrı uygun.
      Not: Paralel programlama ve çok çekirdekli CPU kullanımı önemli ölçüde bu aşamada hesaplama hızı artırabilir.
    6. Lipozomlar tekrar adım 7.2.4 uygulanan ama her zaman dilimi için olduğu gibi benzer ölçütlere göre filtre uygulayın.
    7. Her zaman basamakta bir lipozom floresan yoğunluğu oranı monte 2D-Gauss işlev, iki kanal tarafından kapalı birimler oranını tanımlamak için kullanılır. İki HPTS kanalı tespit ve bir kalibrasyon eğrisi (Adım 8) kullanarak yoğunluklarını oranı düşük pH değerleri hesaplar. Elde edilen pH-zaman eğrileri lipozomlar için arsa ve potansiyel uygulandığında değiştirmek onların pH gözlemlemek.

8. HPTS floresan bir kalibrasyon eğrisi gerçekleştirme

Not: Bir intravesicular pH HPTS floresan oranı dönüştürmek için bir kalibrasyon eğrisi ilk deneyler altın geçirgenliği, filtreler kalite, vbgibi belirli koşullar dikkate oluşturulmuş olmalıdır. Bu adım yalnızca bir veya iki kez yapılması gerekiyor ve kurulum ve ölçüm parametreleri adım 6 aynı olduğu sürece kalibrasyon verileri kullanılabilir.

  1. Bir elektrot seyrek adsorbe lipozomlar (olmadan adım 5 ve 6.1 bölümünde açıklandığı gibi sitokrom bo3 ) ile hazırlayın.
  2. 0.1 mg/mL gramisidin çözüm 2 µL konsantrasyon 100 ng/mL oluşturmak için arabellek için 2 mL etanol ekleyin.
  3. İki HPTS kanallar için iki floresan görüntü yakalama.
  4. Buna ek olarak 1 M HCl veya 1 M H2küçük aliquots tarafından çok hücrenin pH değiştirmek4. Standart pH metre ile pH arabelleği ölçmek ve iki HPTS kanallar için iki floresan görüntü yakalama.
  5. PH aralığı için 6 ile 9 arasındaki adımları 8.4 yineleyin.
  6. 7.2'den algoritması kullanarak, uygun, filtre ve her pH bireysel lipozomlar ortalama HPTS floresan oranını hesaplamak. HPTS oranı tüm lipozomlar ortalama almak.
  7. Elde edilen pH oranı bağımlılığı aşağıdaki denklemi için uygun:
    Equation, nerede pKbir, Rbir ve Rbuygun parametreleri.
  8. PKbir, Rbir ve Rbadımda 7.2.7 bireysel lipozomlar HPTS oranı dönüştürmek için kullanın. pH değerleri için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Altın-modified kapak notu (elektrot) kalite 6MH SAM ile elektrokimyasal empedans spektroskopisi ile her deneme önce kontrol edilir. Şekil 2A önce ve sonra lipozomlar adsorbe elektrokimyasal empedans Spektroskopi kullanarak ölçülen temsilci Cole-Cole araziler gösterir. SAM kalitesi yeterli değilse, empedans spektroskopisi yarı daire Cole-Cole mezarlığına çıkan hemen hemen saf bir kapasitif davranış göstermesi gerekmektedir. Cole-Cole arsa yarım dairenin çapı 2.5-3.0 µF/cm2 aralıkta olmalıdır elektrot yüzeyi çift katmanlı kapasite eşittir. Kapasitans önemli ölçüde lipozomlar adsorpsiyon kapasite içinde hafif bir artış olsa değiştirmemeniz gerekir Not (yüksek lipozomlar kapsamı, şekil 2A, alt) gözlenen veya empedans hafif bir kayma düşük görülebilir Frekanslar (düşük lipozom özel kapsamlı, şekil 2A, üst).

Elektrokimya, nerede katalitik akımları ile çevrimsel voltammetry ölçülen ubiquinol-oksijen oxidoreductase etkinliği yansıtan proteoliposomes, sitokrom bo3 katalitik aktivitesini test etmek için kullanılabilir. Ancak, önemli katalitik akımları sadece adsorbe proteoliposomes yüksek miktarlarda tespit edilebilir ve proteoliposomes altın-modified kapak notu üzerindeki yakından paketlenmiş tabakası gereklidir. Şekil 2B temsilcisi çevrimsel voltammograms (CVs) elektrot önce ve sonra her iki düşük veya yüksek lipozom kapsama lipozomlar adsorpsiyon gösterir. Oksijen azaltma çıplak altın elektrot tarafından SAM tarafından engellendiği için faradaic hiçbir geçerli boş CV görülmektedir. Ne zaman yüzey doymuş lipozomlar yüksek sitokrom bo3 içerik (% 1.3 (w/w) bu durumda), oksijen azaltma nedeniyle net katalitik bir dalga ile 0 V, Yani, bir başlangıçlı potansiyeli ile ubiquinone potansiyelini görülmektedir azaltma (şekil 2B, mavi çizgi). Ubiquinone havuzun hem doğal substrat enzim için hem elektron enzim elektrot yüzeye aktarma bir elektron arabulucu olarak davranır. Biz yüksek lipozom kapsamı altında bireysel veziküller hiçbir ayrım mikroskobu tarafından mümkündür ve alt kapsamı tek lipozom çalışmaları için gerekli unutmayın. Düşük lipozom kapsama (ama lipid oranı yüksek protein), katalitik geçerli önemli ölçüde, zar zor ayırt arka plan (şekil 2B, kırmızı çizgi) azalır. Not tek enzim koşullarda (lipid oranı düşük protein) katalitik geçerli daha düşük olduğunu ve güvenilir bir şekilde ölçülemez.

Şekil 3 üç farklı özel kapsamlı, elektrotlar üzerinde adsorbe lipozomlar Floresans görüntüleri gösterir. Tüm görüntüleri aynı ışık ve pozlama koşullarda alındı ve onların parlaklık eşit doğrudan karşılaştırma etkinleştirmek için ayarlandı. Boya-içeren-lipozomlar parlak noktalar görüntülerde görülebilir. Görüntü orta kesiminde birkaç dakika arka plan Floresans düzeyi (biz FDLL nispeten photostable ve photobleached şekil 3' te tamamen değildir unutmayın) ortaya çıkarmak için photobleached içindi. İki HPTS kanal görüntülerde superimposable, nerede iki kanal arasındaki oran (410/535 ve 470/535) pH 7.4 bu deneyde kullanılan karşılık gelir. Lipozomlar daha çok sayıda kapsüllenmiş yok HPTS var lipozomlar varlığını gösterir FDLL kanal ile görülebilir. Yüksek lipozom kapsama, lipozomlar patlama ya da yüzeyde sigorta olasılığı daha yüksektir çünkü HPTS ve FDLL kanalları arasındaki fark daha yüksek özel kapsamlı muhtemelen telaffuz edilir.

Görüntü analizi ImageJ, eklenti StackReg kullanarak çerçeveler (karşı ilk kare) hizalama gerektiriyorsa. Hizalama çoğu durumda vazgeçilmez olduğu için hafif bir termal drift örnek genellikle lipozom koordinatları değiştirme deneme, zaman ölçeği içinde oluşur. Tüm daha fazla çözümleme bir kodlama yazılım kodu kullanılarak gerçekleştirilir. Bu kod otomatik lipozom kimlik gerçekleştirir. Abbe kırınım sınırın altına lipozomlar boyutu olduğu gibi işlev gerçek lipozom çapı daha (4A rakam) çok daha büyük bir noktası yayıldı gibi onların Floresans görülür. Kodu ve bir 2D-Gauss işlev (şekil 4A) için iki kanaldaki her vezikül floresan yoğunluğu uygun pH kalibrasyon eğrisi kullanma-ebilmek var olmak değiştirmek onların hacimsel yoğunluk oranı hesaplar. Tüm zamanların çerçeveler üzerinde bu eylemleri gerçekleştirerek, pH deneyi (film 1) Zaman ölçeğini içinde her vezikül içinde elde edilir. Sitokrom bo3 içeriği % 1,3 ise şekil 4B medians tüm vezikül pH değişiklikleri tek bir görüntü içinde gösterilir. (Proton pompa) pH artışı ne zaman açıkça görülmeye başlıyor bir potansiyel-0.1 ve-0.3 V arasında uygulanan, ancak 0 V beri ikinci için değil quinone havuzu azaltmak yeterli değildir. Sitokrom bo3 içeriği ne zaman çok daha düşük (protein lipid oranı % 0.1, şekil 4 c), medyan eğrileri haline bu boş lipozomlar (şekil 4 d) neredeyse ayırt edilemez. Farkı dikkate alınarak rasgele lipozomlar (şekil 5, 6 ve 7) bireysel pH izleri belli olur. Lipozomlar sitokrom bo3 olmadan gürültü (Şekil 7) ile ilgili olarak hiçbir önemli pH değişiklikleri görüntülemek iken, lipozomlar yelpazesi göstermek bir artış (baskın) veya o aktif bir potansiyel olduğunda pH azalması uygulanan sitokrom bo3 (rakamlar 6, gri bölge). PH-izleri belirgin fark lipozomlar arasında nerede sitokrom bo3 sadece lipozomlar etkinlik küçük bir alt mevcuttur düşük protein lipid oranı ile tutarlıdır. Bir pH artış azalış yaygınlığı enzim molekülleri (ca. %75) bir "dış" yönünü iyilik sulandırma yöntemi tarafından açıklanmıştır. Sitokrom bo3 lipid oranı daha yüksek (şekil 5) olduğunda bir pH değişimi görüntüler lipozomlar kısmını artar. Ayrıca bazı lipozomlar proton pompalama durdurmak ve olası uygulama sonundan önce proton dağılımı moduna girin unutmayın. Bu davranış "proton geri lipozom Lümen14akışı sağlayan bir kaçak durumuna", girmesini sitokrom bo3 moleküllere özniteliği.

Onların uygun ve proton pompa/sızıntı gore belirlenmesi de dahil olmak üzere pH izleri daha fazla çözümleme yapılabilir biz daha önce14,22 yayınlandı ve araştırma veri Leeds deposundan elde edilebilir bir komut dosyası kullanarak 23 , 24.

Figure 1
Şekil 1: yönteminin prensibi. (A) prensibi tek enzim etkinliğini izleme ve (B) bu iş bir kesit ile hücrenin iç bir bölümünü göstermek için kullanılan deneysel kurulum programı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: lipozomlar elektrokimyasal tepki. (A) Cole-Cole araziler ölçülen OCP (0,22 V vs o; siyah kare çizgi) önce ve sonra lipozomlar (%1,3 w/w sitokrom bo3) adsorpsiyon 5 µg/mL (kırmızı daire satır) ve 500 µg/mL (mavi daire satır) konsantrasyonlarda çözümlerinden. (B) çevrimsel voltammograms 100 mV/s (sol paneli) ve 10 mV/s (doğru kapı aynası) Au-Sam (siyah Kesikli çizgi) önce ve sonra lipozomlar (%1,3 w/w sitokrom bo3) adsorpsiyon çözümleri konsantrasyonları 5 µg/mL (kırmızı çizgi) ve 500 µg/mL (mavi çizgi). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: lipozomlar Floresans mikroskobu. Farklı yüzey özel kapsamlı, lipozomlar görüntülerini floresan: yüzeyler için 5 µg/mL (üst satırı), 20 µg/mL (orta sıra) ve 500 µg/mL (alt satır) 30 dk lipozomlar çözüm ile inkübe. Sol sütun karşılık gelen 470/535 nm uyarma/emisyon filtre kurulumu (1st HPTS kanal); Orta sütunda - 410/535 nm (2nd HPTS kanal); sağ sütun - 560/645 nm (FDLL kanal). Görüntüleri büyütmede 90 X (60 X objektif ve kamera önce mikroskop tarafından 1.5 X büyütme) 1 s pozlama ve benzer ışık şiddeti alındı. Ölçek çubukları karşılık 50 µm. için Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: lipozom kimlik ve değiştirmek pH. (A) 3D-görünümü floresan görüntü tipik bir tek lipozom içeren bir parçası. Bir noktaya yayılmış bir 2D-Gauss işlev (siyah mesh) ile donatılmış bir işlev (renk yüzey) floresan şiddeti görülür. (B-D) pH, farklı uygulanan potansiyelleri tek bir görüntü alanı (genellikle birkaç yüz) içinde tüm veziküller ortancası olarak görüntülenir. 0-60 s, hiçbir potansiyeli uygulanır (OTM). 60 ve 180 s (gri bölge) arasında farklı potansiyeller uygulandı: 0 V (siyah),-0.1 V (kırmızı),-0.2 (yeşil), V-0.3 V (mavi). 180 ve 300 arasında s, 0,4 V vs. O uygulandı. Lipid oranlarına sitokrom bo3 idi (B) % 1,3, (C) % 0.1, (D) % 0. İzlerini netlik için mahsup edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: %1,3 enzim içeren lipozomlar pH izleri. PH izleri ölçülen ve bir deneme sırasında analiz sitokrom bo3 (% 1.3 w/w) içeren rasgele seçilmiş, 72 tek lipozomlar, değişikliği. 0-60 s, hiçbir potansiyeli olduğunu (OTM) uygulanan; 60 ve 180 s (gri bölge) arasında-0.2 V vs. O; 180 ve 300 arasında s, 0,4 V vs. O uygulandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: pH %0,1 enzim içeren lipozomlar izleri. PH izleri ölçülen ve bir deneme sırasında analiz sitokrom bo3 (% 0,1 w/w) içeren rasgele seçilmiş, 72 tek lipozomlar, değişikliği. 0-60 s, hiçbir potansiyeli olduğunu (OTM) uygulanan; 60 ve 180 s (gri bölge) arasında-0.2 V vs. O; 180 ve 300 arasında s, 0,4 V vs. O uygulandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: pH lipozomlar enzim olmadan izleri. Rasgele seçilmiş, sitokrom bo3 ölçülen ve bir deneme sırasında analiz olmadan 72 tek lipozomlar pH değişikliği izleri. 0-60 s: hiçbir potansiyeli olduğunu (OTM) uygulanan; 60 ve 180 s (gri bölge) arasında-0.2 V vs. O; 180 ve 300 arasında s, 0,4 V vs. O uygulandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Movie 1
Film 1: animasyon tek lipozom pH değişikliği. (üst panel) Lipozom floresan (karşılık gelen alan 3D-yüzey komplo olarak gösterilen) iki HPTS kanaldaki 300 sırasında değişiklik s deneme. İndirgeyici potansiyel 60 arasında uygulanan s ve 180 s. (alt paneli) sorumlu arsa hacimsel yoğunluğu oranı iki HPTS kanalları saat karşı. İndirgeyici potansiyel uygulama bölgesi gri gölgeli. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Ek dosyaları. Dosyaları indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Açıklanan yöntemi tarafından lipozomlar yeniden solunum membran proteinlerinin pompalama proton çalışmaya uygundur ve quinone havuzu ile elektron alış verişi edebiliyoruz. Proton pompalama aktivitesi, lipozom Lümen (şekil 1A) kapsüllenmiş pH-duyarlı (ratiometric) boyalar kullanılarak tek-enzim düzeyinde izlenebilir.

Yöntemi ile bir SAM18değiştiren elektrotlar ile elektron alışverişi için yeteneğine ubiquinone (veya diğer quinones), lipid bilayer dahil dayalı. Çok özel bir SAM ile modifiye altın elektrot özelliklerdir. Lipozomlar SAM ve SAM hızlı elektrokimyasal oksidasyon ve lipozomlar quinone havuzunda azalma sağlamak için ince olması gereken absorbe gerek. Önemlisi, lipozom ve elektrot arasındaki etkileşimi lipid membran bütünlüğü zarar değil için zayıf olması gerekir. SAM altın katalize yan tepkileri, oksijen azaltma gibi engelliyorsa Ayrıca, deneysel sistem ayrıntılarını bağlı olarak, bu arzu edilir. Son olarak, SAM kullanılan potansiyel penceresi içinde kararlı olması gerekir. 6MH yüksek kaliteli SAM'le değiştiren Ultra düz altın elektrot kullanımı sitokrom bo3olması durumunda bu gereksinimleri yerine getirir. Atomik düz silikon gofret üzerinden altın elektrotlar sıyırma çok daha düzgün bir altın yüzey çevre ideal SAM'le empedans spectra tarafından belirtildiği şekilde oluşturur. Unutmayın ki biz 6MH suda SAM'den oluşturur. Biz daha önce 6MH isopropanol16ile SAMs üzerinde rapor ama bu SAMs sergi daha yüksek çift katmanlı kapasite değerleri ve daha heterojen bir yüzey göstermek empedans spectra (i.e., daha fazla kusurları) daha düşük direnci ile. Ne zaman SAMs 6MH gelen bir su çözümden hazır mısın, Ayrıca, daha az arka plan oksijen azaltma (nedeniyle altın katalize oksijen azaltma) SAMs için karşılaştırıldığında görülmektedir bir etanol/isopropanol eriyik--dan oluşur. Bu gözlemler SAMs 6MH su çözümleri üzerinden daha az kusurları ile daha yüksek bir kalite gösteriyor. Yüksek-nitelik SAMs de thiol-bileşikler uzun Alkan zincirleri (Örneğin, 1-hidroksi-decane-thiol) üzerinden bir araya gelebilir ama elektron transferi Kinetik haline SAM kalınlığı arttıkça daha yavaş.

Onlar yüksek potansiyelleri, muhtemelen SAM kalitesi kötüleşen altın yüzeyi Tarih chemosorb bu yana (spectro) elektrokimya sırasında klorür iyonları arabellek çözümde kaçınılmalıdır. Aynı nedenle, klorür-Alerjik referans elektrot tercih edilmelidir.

Başka bir önemli nokta lipozomlar proton birikimi sonucu olarak enzimatik proton translocation deney ölçeğinde izin vermek için düşük olmalıdır proton için arka plan geçirgenliği olduğunu. Tam lipid kompozisyon bu geçirgenliği etkileyebilir. Çalışmamızda, kutup E. coli kullandığımız lipid özleri ubiquinone-10 ile desteklenmiştir. Her ne kadar bu çalışmalar daha karmaşık lipit kompozisyonları26ile çelişki proton geçirgenliği güçlü yağ asidi zincir uzunluğu25, bağlı olduğu gösterilmiştir. İlginçtir, ubiquinone son zamanlarda membran istikrar27artırmak için gösterilmiştir. Son olarak, protein sulandırma yordamdan gelen kalıntı deterjanlar proton sızıntı etkileyebilir ve bu nedenle deterjanlar hidrofobik polistren lastikteki, seyreltme Santrifüjü tarafından takip kullanarak mümkün olduğunca tamamen kaldırmak önemlidir ve elektrokimyasal hücre ayrıntılı proteoliposomes yüzeyinde adsorbe sonra durulama. Eğer şüpheli, lipozom geçirgenliği yanıt olarak bir dış faz atlama28(via HPTS) Lümen pH değişikliği takip ederek doğrulanabilir.

Tek enzim ölçüm gerektirir unilamelar lipozomlar ve daha küçük lipozomlar lumen'ın hacmi azalır olarak daha hızlı veya daha yüksek pH değişiklikleri göstermek için bekleniyor. Polistren lastikteki bunu başarmak için yavaş yavaş küçük miktarlarda lipozomlar oluşumu yavaş hızı için önde gelen eklenir. Bu şartlar altında homojen boyutunun küçük lipozomlar 70 bir ortalama çapı ile oluşmuş nm ve 0,24, bizim büyük-14bir polydispersity dizin. HPTS da polistren lastikteki üzerinde deterjan absorbe için polistren lastikteki kapasitesini azaltarak adsorbs. Bu nedenle, aşırı polistren lastikteki için onun kaybı telafi etmek için eklenmelidir. Polistren lastikteki ile tedavi HPTS konsantrasyonu yaklaşık dörtte tarafından lipid-protein süspansiyon (3-4 mM 5 mM) azaltmak için gözlendi. Lipozomlar erken tedavi ile polistren lastikteki oluşturulur ancak, lipozom'ın Lümen gerçek HPTS konsantrasyon daha yüksek olabilir. HPTS yerine, diğer pH duyarlı boyaları kullanılabilir. Ancak, bu boya membran geçirimsiz önemlidir ve ratiometric. İkinci photobleaching ve kapsüllenmiş boya değişen miktarlarda nedeniyle deneysel hataları önler.

Stochastically, boş olmayan lipozomlar çoğunu tek bir enzim molekülü içeren olup olmadığını, tahmin etmek için basit hesaplamalar yapılabilmektedir. Bir ortalama lipozom çapı 70 varsayarak nm, 750 Da bir lipid molekül ağırlığı ve lipid alanı 0.65 nm2 verir bize 5.2x10-17 g, Yani, 9.6x1013 lipozomlar hazırlık (lipid 5 mg) başına bir lipozom kitle. %0,1 sitokrom bo3 (MW = 144 kDa), 2 x 1013 enzim molekülleri mevcut, bir 0.2 protein: lipozom oranına karşılık gelen. Poisson dağılımı kullanarak, bir daha da bu hesaplayabilir bir enzim molekül (% 17) bulmak için olasılık lipozom birden fazla molekül (% 1.7) bulmak için olasılık on kat daha yüksek. Enzim ve lipidler ilgili deneyleri belirlenen sulandırma sırasında zararları dikkate alınırsa daha hassas hesaplamalar yapılabilmektedir. İkinci bir protein tahlil ve hazırlanan lipozomlar FDLL floresan ölçme tahmin edilebilir.

Protokolü kurulduktan sonra tek enzim izlemeler kaydedilir, daha fazla değişiklikler yönteminin amacı bağlı olarak uygulanabilir. Bir enzim inhibitörü ekleme ya da bir ionophore giriş içine belgili tanımlık sistem hakkında düşünebilirsiniz. Çözücü ilavesi ionophore hazırlamak için kullanılan ya da inhibitörü stok değil SAM durumunu veya lipozomlar geçirgenliği etkileyen doğrulamak için özen gösterilmelidir.

Burada açıklanan tekniği membran proton taşıyıcılar ve quinone dönüştürme enzimler belirli bir gruba sınırlıdır. Ekipman ve deneysel koşullar burada kullanıldığı şekliyle sitokrom bo3enzimatik aktivite için optimize. Burada, zaman çözünürlüğü 2-3 saniye, çekim hızı ve taret filtreleri değiştirmek gereken süreyi belirler. Deneme süresi floresan boya photobleaching tarafından ve böylece, ışık şiddeti ile sınırlıdır. Biz daha önce ortalama proton translocation oranı 73 ± 2.2 proton/sn bu tekniği kullanarak olmasa da 20 proton/s aşağı faaliyetleri tespit edildi, sitokrom- bo3 bulduk. Bu teknikler enzimler ya az ya da aktivite ile kullanmak için görüntü edinme parametreleri adapte gerekir (i.e., ışık yoğunluğu, çekim hızı ve deneme süresi). Gelecekte, bu yöntem uzatılabilir enzimler, mitokondrial kompleksi olan bir örnek pompalama proton sürüş diğer elektron taşıma doğru ben. Diğer enzimler farklı sulandırma protokolleri gerektirebilir ve bu her farklı ışınlama için optimize edilmiş olması gerekir. Quinone dönüştürme değildir proton pompa enzimler de olabilir, Örneğin, ATP tahrik29, her ne kadar bu durumda proton translocation mamüllerinin tetikleyen olamaz ama bir başlatıcı (Örneğin, ATP) eklenmesi gereklidir okudu. İkinci durumda, bir altın-modified kapak notu kullanmak için gerek yoktur. Ayrıca, uygun bir membran geçirimsiz ve iyon duyarlı floresan boya kullanılır olması koşuluyla, bu yöntem diğer iyonik Pompalar, Örneğin, sodyum ve potasyum uzatılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar mali destek için BBSRC (1/P005454/BB) kabul etmiş oluyorsunuz. NH VILLUM Vakfı genç araştırmacı programı tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-Mercapto-1-hexanol (6MH) Sigma 451088 97%
8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS) BioChemika 56360
Aluminium holder (Electrochemical cell) Custom-made 30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm
Auxiliary electrode platinum wire
Chloroform VWR Chemicals 83627
E.coli polar lipids Avanti 100600C 25 mg/mL in chloroform
Epoxy EPO-TEK 301-2FL low fluorescence epoxy
Fiji (ImageJ 1.52d) Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)
Filter cube ("ATTO633") Chroma Technology Corporation Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm
Filter cube ("HPTS1") Chroma Technology Corporation Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm
Filter cube ("HPTS2") Chroma Technology Corporation Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm
Filter cube ("Texas Red") Chroma Technology Corporation Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm
Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) ThermoFisher Scientific T1395MP TexasRed-DHPC was used in this work (λexc 595 nm; λem 615 nm)
Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative) ATTO-TEC AD 633-161 ATTO633-DOPE can be used as alternative (λexc 630 nm; λem 651 nm)
Gel filtration column GE Healthcare 28-9893-33 HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification
Glass coverslips VWR International 631-0172 No 1.5
Glass syringe Hamilton 1725 RNR 250 µL
Glass vials Scientific Glass Laboratories Ltd T101/V1 1.75 mL capacity
Gold GoodFellow 99.99%
Gramacidin Sigma G5002
Mercury sulfate reference electrode Radiometer (Hash) E21M012
Microcentrifuge Eppendorf Minispin NL040
Microscope Nikon Eclipse Ti
Microscope Camera Andor Zyla 5.5 sCMOS
Microscope Lamp Nikon Intensilight C-HGFI
NIS-Elements AR 5.0.2 Nikon Microscope acquisition software
n-Octyl β-D-glucopyranoside Melford Laboratories B2007
Nova 1.10 Metrohm Potentiostat control software
Objective Nikon Plan Apo λ 60x/1.4 oil
OriginPro 2017 OriginLab Plotting software
O-ring (Electrochemical cell) Orinoko Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm
Plastic tubes Eppendorf 3810X 1.5 mL
Polystyrene microbeads Bio-RAD 152-3920 Biobeads, 20-50 mesh
Potentiostat Metrohm Autolab PGSTAT 128N
Potentiostat CH Instruments CHI604C
Scripting software Matlab R2017a Required toolboxes: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox'
Silicon wafers IDB Technologies LTD Si-C2 (N<100>P) Ø 25 mm, 525 um thick
Teflon cell (Electrochemical cell) Custom-made Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm
Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces Platypus Technologies AU.1000.SWTSG Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand)
Thin micropipette tips Sarstedt 70.1190.100 or similar gelloader tips 200 µL
Ubiquinone-10 Sigma C-9538
Ultracentrifuge Beckman-Coulter L-80XP with Ti 45 rotor
Ultrasonic bath Fisher Scientific FB15063

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Claessen, V. I., et al. Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme. Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).
  2. Rojek, M. J., Walt, D. R. Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activity States upon Heating. PLoS ONE. 9 (1), e86224 (2014).
  3. Velonia, K., et al. Single-Enzyme Kinetics of CALB-Catalyzed Hydrolysis. Angewandte Chemie International Edition. 44 (4), 560-564 (2005).
  4. Lu, H. P., Xun, L., Xie, X. S. Single-molecule enzymatic dynamics. 282 (5395), Science. New York, N.Y. 1877-1882 (1998).
  5. Engelkamp, H., Hatzakis, N. S., Hofkens, J., De Schryver, F. C., Nolte, R. J. M., Rowan, A. E. Do enzymes sleep and work? Chemical Communications. 9 (9), 935-940 (2006).
  6. Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
  7. Hsin, T. -M., Yeung, E. S. Single-Molecule Reactions in Liposomes. Angewandte Chemie International Edition. 46 (42), 8032-8035 (2007).
  8. García-Sáez, A. J., Schwille, P. Single molecule techniques for the study of membrane proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (2), 257-266 (2007).
  9. Onoue, Y., et al. A giant liposome for single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (6), 1332-1340 (2009).
  10. Jefferson, R. E., Min, D., Corin, K., Wang, J. Y., Bowie, J. U. Applications of Single-Molecule Methods to Membrane Protein Folding Studies. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 424-437 (2018).
  11. Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. BBA - Bioenergetics. 1231 (3), 223-246 (1995).
  12. Jesorka, A., Orwar, O. Liposomes: Technologies and Analytical Applications. Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 801-832 (2008).
  13. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  14. Li, M., et al. Single Enzyme Experiments Reveal a Long-Lifetime Proton Leak State in a Heme-Copper Oxidase. Journal of the American Chemical Society. 137 (51), 16055-16063 (2015).
  15. Rumbley, J. N., Furlong Nickels, E., Gennis, R. B. One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1340 (1), 131-142 (1997).
  16. Jeuken, L. J. C., et al. Phase separation in mixed self-assembled monolayers and its effect on biomimetic membranes. Sensors and Actuators, B: Chemical. 124 (2), 501-509 (2007).
  17. Barsoukov, E., Macdonald, J. R. Impedance Spectroscopy Theory, Experiment, and Applications. , John Wiley & Sons. Chapters 1-2 (2005).
  18. Jeuken, L. J. C., Connell, S. D., Henderson, P. J. F., Gennis, R. B., Evans, S. D., Bushby, R. J. Redox Enzymes in Tethered Membranes. Journal of the American Chemical Society. 128 (5), 1711-1716 (2006).
  19. Compton, R. G., Banks, C. E. Chapter 4. Understanding voltammetry. , World Scientific Publishing Europe Ltd. Singapore. (2018).
  20. Girault, H. H. Chapter 10. Analytical and Physical Electrochemistry. , EPFL Press. Lausanne. (2004).
  21. Mazurenko, I., Jeuken, L. J. C. Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application. , (2018).
  22. Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).
  23. Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. MATLAB code for the analysis of proton transport activity in single liposomes. , (2017).
  24. Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity. , (2017).
  25. Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness. Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).
  26. Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).
  27. Eriksson, E. K., Agmo Hernández, V., Edwards, K. Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).
  28. Seneviratne, R., et al. A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability. Methods. , 1-8 (2018).
  29. Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1-6 (2016).

Tags

Biyokimya sayı: 144 sitokrom bo3 tek enzim proteoliposomes pH-duyarlı boya proton translocation bioelectrochemistry
Proton pompalama membran enzimler elektrokimya ve floresan mikroskopisi kullanılarak incelenmesi için tek lipozom ölçümleri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mazurenko, I., Hatzakis, N. S.,… More

Mazurenko, I., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy. J. Vis. Exp. (144), e58896, doi:10.3791/58896 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter