Aqui, apresentamos um protocolo para estudar o mecanismo molecular de translocação de prótons através das membranas lipídicas de lipossomas único, usando citocromo bo3 como exemplo. Combinando a eletroquímica e microscopia de fluorescência, mudanças de pH no lúmen do única vesículas, contendo uma única ou várias enzimas, podem ser detectados e analisados individualmente.
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Artigo de método
Medições de lipossoma único para o estudo das enzimas de membrana de bombeamento de prótons usando microscopia fluorescente e eletroquímica
Neste artigo
Resumo
Resumo
Bombeamento de prótons enzimas de elétron transferir reações de redox de duas cadeias de translocação de prótons através da membrana, criando uma força motriz protónica usada para a produção de ATP. A natureza anfifílica das proteínas de membrana requer especial atenção ao seu manuseamento e reconstituição no ambiente natural de lipídios é indispensável ao estudar os processos de transporte da membrana como translocação de prótons. Aqui, detalhamos um método que foi usado para a investigação do mecanismo de bombeamento de prótons de enzimas redox de membrana, tomando citocromo bo3 de Escherichia coli , por exemplo. Uma combinação de eletroquímica, microscopia de fluorescência é usada para controlar o estado de redox das quinona monitor e piscina pH mudanças no lúmen. Devido a resolução espacial de microscopia fluorescente, centenas de lipossomas podem ser medidas simultaneamente enquanto o conteúdo de enzima pode ser escalado para baixo para uma única enzima ou transportador por lipossomas. A análise dos respectivos única enzima pode revelar padrões na dinâmica funcional da enzima que pode ser oculto pelo comportamento de toda a população. Nós incluímos uma descrição de um script para análise automatizada de imagem.
Introdução
Informação sobre a cinética e mecanismos de enzima é normalmente obtida a nível ensemble ou macroescala com população de enzima em milhares de milhões de moléculas, onde as medições representam uma média estatística. Sabe-se, entretanto, que macromoléculas complexas tais como enzimas podem demonstrar a heterogeneidade em seu comportamento e mecanismos moleculares observados no nível de conjunto não são necessariamente válidos para cada molécula. Tais desvios na escala de molécula individual foram extensivamente confirmados por estudos de enzimas único com uma variedade de métodos emergentes durante as últimas duas décadas1. Notavelmente, deteçã....
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Protocolo
1. preparação de uma mistura de lipídeos/UQ-10/FDLL
Nota: E. coli lipídios usados para a preparação dos lipossomas devem ser aliquotadas e cuidadosamente misturada com ubiquinona-10 (substrato) e long-comprimento de onda fluorescentes tingir-etiquetados lipídios (para determinação de tamanho de lipossomas) antes do reconstituição.
- Utilizando uma seringa de vidro, 200 µ l de transferência de estoque de clorofórmio de lipídios polares extrair de Escherichia coli (25 mg/mL) em frascos de vidro tornar-se alíquotas de 5 mg.
- Adicionar 50 µ l de 1 mg/mL ubiquinona-10 (UQ-10; em clorofórmio) para os li....
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Resultados
A qualidade do ouro-modificado lamínula (eletrodo) com uma SAM de 6MH é verificada antes de cada experimento com espectroscopia de impedância eletroquímica. Figura 2A mostra representativas parcelas de Cole-Cole medidas usando espectroscopia de impedância eletroquímica, antes e depois de lipossomas são adsorvidos. Se a qualidade do SAM é suficiente, espectroscopia de impedância deve demonstrar um comportamento capacitivo quase puro, resultando em uma trama do.......
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Discussão
O método descrito é adequado para estudar o próton bombeamento por proteínas de membrana respiratória que podem ser reconstituídas em lipossomas e são capaz de trocar elétrons com o pool de quinona. Atividade de bombeamento de prótons podem ser monitorado no nível do single-enzima usando corantes sensíveis ao pH (ratiometric) encapsulados no lúmen do lipossoma (figura 1A).
O método baseia-se na capacidade de ubiquinona (ou outras quinonas), incorporada a bicamada .......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores reconhecem o BBSRC (BB/P005454/1), apoio financeiro. NH foi financiado pelo programa VILLUM Foundation Young Investigator.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 6-Mercapto-1-hexanol (6MH) | Sigma | 451088 | 97% |
| Ácido 8-hidroxipireno-1,3,6-trissulfónico (HPTS) | BioChemika | 56360 | |
| Suporte de alumínio (célula eletroquímica) | Feito à | 30x30x7 mm; diâmetro interno: 26 mm; diâmetro do furo: 15 mm | |
| Eléctrodo | fio de platina | ||
| Clorofórmio | VWR Produtos químicos | 83627 | |
| E.coli lipídios polares | Avanti | 100600C | 25 mg/mL em clorofórmio |
| Epóxi | EPO-TEK | 301-2FL | epóxi de baixa fluorescência |
| Fiji (ImageJ 1.52d) | Plugins necessários: StackReg e TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) | ||
| Cubo de filtro ("ATTO633") | Chroma Technology Corporation | Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm | |
| Cubo de filtro ("HPTS1") | Chroma Technology Corporation | Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Cubo de filtro ("HPTS2") | Chroma Technology Corporation | Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Cubo de filtro ("Texas Red") | Chroma Technology Corporation | Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm | |
| Lipídios marcados com corante fluorescente (FDLL) | ThermoFisher Scientific | T1395MP | TexasRed-DHPC foi usado neste trabalho (λ exc 595 nm; λ em 615 nm) |
| Lipídios marcados com corante fluorescente (FDLL) (alternativa) | ATTO-TEC | AD 633-161 | ATTO633-DOPE pode ser usado como alternativa (λ exc 630 nm; λ em 651 nm) |
| Coluna de filtração de gel | GE Healthcare | 28-9893-33 | HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, para purificação adicional de proteínas |
| Lamínulas de vidro | VWR International | 631-0172 | No 1.5 |
| Seringa de vidro | Hamilton | 1725 RNR | 250 µ L |
| Frascos de vidro | Scientific Glass Laboratories Ltd | T101 / V1 | 1,75 mL de capacidade |
| Gold | GoodFellow | 99,99% | |
| Gramacidin | Sigma | G5002 | |
| Eletrodo de referência de sulfato de mercúrio | Radiômetro (Hash) | E21M012 | |
| Microcentrífuga | Eppendorf | Minispin NL040 | |
| Microscópio | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microscópio Câmera | Andor | Zyla 5.5 sCMOS | |
| Microscópio Lâmpada | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
| NIS-Elements AR 5.0.2 | Nikon | Microscópio software de aquisição | |
| n-Octil β-D-glucopyranoside | Melford Laboratories | B2007 | |
| Nova 1.10 | Metrohm | Software de controle de potenciostato | |
| Objetivo | Nikon | Plan Apo λ óleo | |
| OriginPro 2017 | OriginLab | Software de plotagem | |
| O-ring (célula eletroquímica) | Orinoko | Diâmetro interno: 16 mm; seção transversal: 1,5 mm | |
| Tubos de plástico | Eppendorf | 3810X | 1,5 mL |
| Microesferas de poliestireno | Bio-RAD | 152-3920 | Biobeads, malha 20-50 |
| Potenciostato | Metrohm Autolab | PGSTAT 128N | |
| Potenciostato | CH Instrumentos | CHI604C | |
| Software de script | Matlab | R2017a | Caixas de ferramentas necessárias: 'Caixa de ferramentas de processamento de imagem', 'Caixa de ferramentas de computação paralela', 'Caixa de ferramentas de ajuste de curva', 'Caixa de ferramentas de identificação do sistema', 'Caixa de ferramentas de otimização'Bolachas |
| de silício | IDB Technologies LTD | Si-C2 (N< 100>P) | Ø 25 mm, 525 um de espessura |
| Célula de Teflon (Célula eletroquímica) | Feito sob medida | Diâmetro externo: 26 mm; diâmetro interno: 13,5 mm | |
| Superfícies de ouro ultra-planas despojadas de hastes | Platypus Technologies | AU.1000.SWTSG | Superfícies alternativas de ouro ultra-planas prontas para uso (Espessura abaixo de 100 nm sob demanda) |
| Pontas finas de micropipeta | Sarstedt | 70.1190.100 | ou pontas de gelloader semelhantes 200 µ L |
| Ubiquinona-10 | Sigma | C-9538 | |
| Ultracentrífuga | Beckman-Coulter | L-80XP | com rotor Ti 45 |
| Banho ultrassônico | Fisher Scientific | FB15063 |
Referências
- Claessen, V. I., et al. Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme. Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).
- Rojek, M. J., Walt, D. R. Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activ....
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Reimpressões e permissões
