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Expansão de duas dimensões Electrospun nanofibras esteiras em três dimensões andaimes

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DOI:

10.3791/58918

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7 de janeiro de 2019

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1Department of Surgery-Transplant and Mary & Dick Holland Regenerative Medicine Program, University of Nebraska Medical Center

Neste artigo

Resumo

Este artigo demonstra a técnica de expansão de uma esteira de nanofibras tradicional, duas dimensões (2D) electrospun em um andaime de três dimensões (3D) através da despressurização subcrítico CO2 líquido. Estes andaimes aumentadas são 3D, pistas perto imitar nanotopographic celular e preservar as funções de moléculas biológicas encapsuladas dentro de nanofibras.

Resumo

Eletrofiação tem sido a tecnologia preferencial em produzir um andaime devido o biomimetismo a matriz extracelular e o controle de facilidade de composição, estrutura e diâmetro de fibras sintético, funcional. No entanto, apesar dessas vantagens, electrospun tradicional nanofibras andaimes vêm com limitações incluindo desorganizado orientação de nanofibras, baixa porosidade, tamanho dos poros pequenos e esteiras principalmente bidimensionais. Como tal, há uma grande necessidade para o desenvolvimento de um novo processo para fabricar andaimes de nanofibras de electrospun que podem superar as limitações acima. Neste documento, um método simples e romance é descrito. Uma esteira de nanofibras 2D tradicional é transformada em um andaime 3D com a espessura desejada, distância, porosidade e pistas de nanotopographic para permitir a propagação de células e proliferação através da despressurização subcrítico CO2 líquido. Além de fornecer um andaime para regeneração de tecidos ocorrer, esse método também fornece a oportunidade para encapsular moléculas bioativas, tais como peptídeos antimicrobianos para entrega de drogas local. Os CO2 expandida nanofibras andaimes segurar grande potencial na regeneração de tecidos, cicatrização de feridas, tecido 3D modelagem e entrega de droga tópica.

Introdução

O conceito de desenvolvimento de um andaime sintético que pode ser implantado em pacientes para auxiliar na regeneração e reparo tecidual é aquele que tem permeado o campo da medicina regenerativa para décadas. O andaime sintético ideal serve para induzir a migração de células do tecido saudável circundante, fornece uma arquitetura para vascularização de suportes de semeadura, adesão, sinalização, proliferação e diferenciação, célula, permite a adequada oxigenação e entrega de nutrição e promove a atividade imunológica do hospedeiro para garantir o sucesso após a implantação1. Além disso, ele pode ser usado como um portador para a incorporação de moléculas antimicrobianas para auxiliar na ferida cura1,3,6,7,8,9. A capacidade de controlar o lançamento temporal destas moléculas biológicas do cadafalso sintético é outro atributo desejável que é considerado quando engenharia moldes1.

Eletrofiação tem sido uma técnica bem-utilizada para a produção de nanofibras andaimes1,2,3,4,5,6. Tentativas anteriores para criar um andaime de nanofibras como o discutido aqui tem sido feitas em diferentes graus de sucesso. No entanto, nanofibras tradicionais andaimes limitaram habilidades para atingir esses objetivos. Andaimes de nanofibras tradicionais têm sido principalmente esteiras bidimensional1,3. Estes andaimes nonexpanded são densamente com tamanhos de poros pequenos; Isso limita a infiltração celular, migração e diferenciação como ele não promove um ambiente bastante semelhante àquelas encontradas na vivo1,7,8,9. Por esta razão, novas técnicas de preparação de andaime de nanofibras electrospun 3D foram criadas para alterar as falhas inerentes que vêm com esteiras de nanofibras 2D. Estas técnicas resultam em 3D andaimes; no entanto, eles têm limitada aplicabilidade devido aos métodos de produção que exigem soluções aquosas e procedimentos de liofilização. Esse processamento resulta na distribuição aleatória das nanofibras sem organização restrita, espessura adequada, e/ou porosidade desejada para fornecer as pistas de nanotopographic adequados que são necessárias para a proliferação e migração celular. Esses fatores resultam nos andaimes de nanofibras 3D electrospun anterior que a falta de adequada mimetismo de vida tecidos1,7,8,9.

Mais recentes tentativas de desenvolver um andaime expandido, 3D com melhor biomimetismo da matriz extracelular (ECM) foram realizadas usando um tratamento da solução (NaBH4) boro-hidreto de sódio aquoso e moldes pré-concebidos para ajudar a controlar melhor o forma da resultante andaime7,8. No entanto, esse método não é o ideal, como exige o uso de soluções aquosas, reações químicas e de liofilização que pode interferir com polímeros e qualquer biomoléculas encapsuladas que são solúveis em água. Os aditivos usados também podem causar efeitos colaterais durante a regeneração de tecido8,9. O método de expansão de2 CO descrito neste artigo grandemente reduz o tempo de processamento, elimina a necessidade de soluções aquosas e preserva a montante e a funcionalidade de moléculas biologicamente ativas em maior medida do que o anteriormente estabelecidos métodos9.

Em estudos anteriores, antibióticos, prata, 1 α, 25 dihidroxivitamina D3e peptídeo antimicrobiano LL-37 foram carregados os andaimes de nanofibras individualmente e em conjunto para investigar o potencial destes andaimes para liberar agentes para mais ajuda na ferida cura9,10,12,13. Com a finalidade de demonstrar este método de expansão de andaime de nanofibras, Coumarine 6, um corante fluorescente, serão carregados no cadafalso para demonstrar o potencial de incorporação o andaime com vários compostos desejados. Este método de fabricação de andaime de nanofibras expandido em conjunto com moléculas bioativas encapsulados possui grande potencial na regeneração dos tecidos, cicatrização de feridas, a criação de modelos 3D de tecido e a entrega tópica de drogas.

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Protocolo

Todos na vivo os procedimentos descritos abaixo foram aprovados pelo Comité IACUC no centro médico da Universidade de Nebraska.

1. prepare as soluções para o padrão eletrofiação

  1. Em um tubo de vidro de 20 mL, dissolver 2 g de poly(ε-caprolactone) (PCL, Mw = 80 kDa) em uma solvente mistura de diclorometano (DCM) e N, N-dimetilformamida (DMF) com uma ração de 4:1 (v/v) em uma concentração de 10% (p/v).
    Cuidado: Punho DCM e DMF em um capuz ventilado para evitar a exposição aos vapores. Não exponha o DCM para materiais plásticos.
  2. Coloque o tubo de vidro em um rotador de laboratório até a solução torna-se claro. A solução pode misturar durante a noite.
  3. Se pretende incorporar materiais bioativos como peptídeos ou drogas para o cadafalso, criar uma solução separada e armazenar à 4 ° C até que esteja pronto para usar.
    1. Prepare a solução de tintura fluorescente (50 mg/mL) com 20 mL de solução PCL.

2. montar o aparelho eletrofiação (figura 1A)

  1. Adicione a solução PCL para uma seringa de 20 mL com uma agulha 21 calibre anexada. Certifique-se de que não existe ar na seringa e tubagem associada.
  2. Coloque um tambor de aço rotativo com o coletor de solo 12 cm da ponta da agulha.
  3. Usando clipes jacaré, conecte a fonte de alimentação de alta tensão de corrente contínua (DC) para a agulha e certifique-se de que o coletor é castigo.
    Cuidado: Sempre desligue a alimentação antes de manusear qualquer materiais ligados.

3. eletrofiação

  1. Para os 20 mL de solução PCL, defina os parâmetros da bomba de seringa como segue: diâmetro = 20,27 mm, taxa de fluxo = 0,5 mL/h. verificar se as gotas estão se formando na ponta da agulha.
  2. Se a incorporação de moléculas bioativas é desejada, configurar o aparelho para permitir a eletrofiação co-axial (figura 1B). Crie um personalizado bocal coaxial usando agulhas hipodérmicas.
    Nota: Esses bicos estão também disponíveis comercialmente. Note que é preparada uma solução de corante para simular a adição de tais moléculas.
    1. Prepare uma solução de 1% do corante fluorescente 6 de cumarina em água. Adicione 3 mL de corante 1% a uma pequena seringa. Conecte a seringa de bico coaxial mesmo como a solução PCL. Mais uma vez, certifique-se de que não há nenhuma bolha de ar.
    2. Para esta solução de 3 mL, defina os parâmetros da bomba de seringa como segue: diâmetro = 9,49 mm, taxa de fluxo = 0,02 mL/h. verificar se as gotas estão se formando na ponta da agulha.
  3. Aplicar um potencial elétrico de 20 kV entre a fieira (agulha de calibre 22) e um coletor de solo situado a 20 cm de distância da fieira. Recolha as esteiras de nanofibras alinhados em um tambor rotativo a 2.000 rpm. Recolha as esteiras de nanofibras PCL quando atingem uma espessura de ~ 1 mm.

4. geração de nanofibras PCL esteiras com buracos de matriz.

  1. Fabrica tapetes de nanofibras PCL.
    1. Dissolva os grânulos PCL numa mistura solvente consistindo de DCM e DMF com uma relação de 4:1(v/v) com uma concentração de 10% (PCL) (p/v). Bombear a solução PCL com um caudal de 0,7 mL/h, usando uma bomba de seringa, enquanto um potencial de 20 kV é aplicada entre a fieira (uma agulha de calibre-22) e um coletor aterrado localizado além da fieira de 12 cm.
    2. Recolha a membrana de nanofibras usando um tambor rotativo com uma velocidade de giro maior do que 500 rpm.
  2. Mergulhe as esteiras de nanofibras PCL no líquido N2 por 5 min (i. e., tornar-se duro). Manter as esteiras de nanofibras PCL no líquido N2 e socar PCL nanofibras esteiras um golpe de 0,5 mm de diâmetro.

5. expansão de nanofibras 2D esteiras com/sem furos matriz através de subcrítica CO2 líquido (Figura 2).

  1. Coloque as esteiras de nanofibras PCL em nitrogênio líquido por 5 min e corte em quadrados de 1 cm x 1 cm, usando tesouras cirúrgicas afiadas enquanto submerso em nitrogênio líquido para evitar a deformação das bordas.
  2. Coloque o tapete de corte em um tubo de centrífuga de 30ml com ~ 1 g de gelo seco. Firmemente a tampa do tampão e permitir o gelo seco transformar em líquido de CO2.
  3. Uma vez que o líquido se formou no tubo, libera-se rapidamente a pressão, abrindo a tampa.
    Atenção: Use equipamento de proteção térmico adequado ao trabalhar com nitrogênio líquido e gelo seco. Não abra o tubo pressurizado para o rosto. Tubo de centrífuga não deve ser usado repetidamente.
  4. Retirar e observar o andaime inchado do tubo. Coloque o andaime em um novo tubo de centrifugação com gelo seco e repita até a espessura desejada seja alcançada. Esterilize os andaimes de nanofibras expandido em óxido de etileno antes da incubação com células.

6. caracterização de nanofibras expandido andaimes

  1. Caracteriza a morfologia e a estrutura dos andaimes de nanofibras expandida usando microscopia eletrônica de varredura (MEV).
    1. Colocar as amostras com fita condutiva dupla face à viga metálica e casaco com platina para 40 s usando um aplicador por pulverização catódica em 40 mA.
    2. Examine as fibras usando SEM segundo anteriores estudos9. Recolher as imagens em uma tensão de aceleração de 15 kV.
  2. Caracteriza em vitro perfis de liberação e bioatividade de peptídeos liberados.
    1. Peso 10 mg de nanofibras membranas antes e após a expansão em CO2.
    2. Mergulhe as amostras em tampão PBS e coletar 10 μL do sobrenadante a pontos de tempo diferentes (0-28 dias).
    3. Use o kit de Enzyme-Linked imuno Sorbent ensaio (ELISA) para quantificar a concentração de peptídeo de LL-37 no sobrenadante coletado.
  3. Examine a resposta de infiltração celular in vivo e anfitrião.
    1. Coloque os ratos Sprague-Dawley (SD) 9 - semana de idade em uma câmara de anestesia, conectar-se ao vapor de isoflurano e anestesiar os ratos. Transferi os ratos para uma mesa de operação depois que os ratos se tornam anestesia completa sem sentimentos. Continuamente anestesia os ratos usando um cone de nariz de isoflurano com vaporizador durante a cirurgia. Raspar o cabelo das costas do rato pela máquina de barbear do animal e sterilize com iodo e álcool esfoliação da pele. Crie bolsos subcutâneos através de incisões de 1,5 cm no supra-espinhais sites no dorso com um bisturi.
    2. Insira a bolsa subcutânea usando uma pinça para cada incisão um andaime de nanofibras expandida (1,5 mm de espessura). Feche a incisão usando um grampeador.
    3. Em 1, 2 e 4 semanas, eutanásia em ratos com 95% de CO2. Delicadamente, disse o explante e do tecido circundante com uma tesoura cirúrgica. Antes da análise histológica, mergulhe o tecido em formol pelo menos 3 dias e depois incorporar com parafina. Seção do tecido com um micrótomo e, em seguida, executar a hematoxilina e eosina (H & E), de coloração tricromo de Masson.

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Resultados

A eficácia da expansão electrospun 2D tradicional nanofibras esteiras em andaimes 3D através de despressurização subcrítico CO2 líquido foi demonstrada em diferentes capacidades: a espessura dos andaimes aumentou de 1 mm, quando não tratada a 2,5 mm e 19,2 mm com CO2 tratamentos 1 e 2, respectivamente (Figura 3A-C). A porosidade-a característica da arquitetura crítica para a propagação de célula-também aumentou de forma ...

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Discussão

Transformando electrospun 2D tradicionais esteiras de nanofibras expandidos andaimes 3D através de CO2 despressurização foi investigada. Esteiras de nanofibras 2D tradicional são expandido com sucesso através de subcrítica CO2 líquido. Os passos críticos são para fabricar esteiras de nanofibras 2D sob uma condição otimizada e cortar as esteiras sem deformar as bordas (EG., utilizando tesouras cirúrgicas em ponto). Esta CO2-andaimes de nanofibras expandida têm mu...

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Divulgações

Os autores declaram que não há nenhum conflito de interesses.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por concede do Instituto Nacional de General Medical ciência (NIGMS) no NIH (2P 20 GM103480-06 e 1R01GM123081 para J.X.), os fundos de Otis Glebe Medical Research Foundation, NE LB606 e inicialização de medicina da Universidade de Nebraska Centro.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
PolicaprolactonaSigma-Aldrich440744
N,N-DimetliformamidaFisher ChemicalD-199-1
DiclorometanoFisher ChemicalAC61093-1000
Cumarina 6Sigma-Aldrich546283
Tambor de aço rotativopersonalizadoIsso serve como um coletor durante a eletrofiação.
Bomba de SeringaFisher Scientific14-831-200A fiação coaxial requer duas bombas de seringa única.
RevolverLab Net InternationalH5600Rotador de laboratório ajustável para misturar soluções
Agulha Hipodérmica (27G x 1 1/2")EXCELINT International Co26426Isso faz parte do exemplo de focinho coaxial personalizado mostrado.
Agulha hipodérmica (21G x 1 1/2 ")EXCELINT International Co26416Esta é parte do exemplo de nozzel coaxial personalizado mostrado.
Fonte de alimentação DC de alta tensãoGamma High Voltage ResearchES30
Microscópio eletrônico de varreduraFEINova 2300
Microscópio de fluorescênciaZeissAxio Imager 2
LL 37 ELISA KitHycult BiotechHK321-02

Referências

  1. Chen, S., et al. Recent advances in electrospun nanofibers for wound healing. Nanomedicine. 12 (11), 1335-1352 (2017).
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  3. Xie, J., Li, X., Xia, Y. Put electrospun nanofibers to work for biomedical research. Macromolecular Rapid Communication. 29 (22), 1775-1792 (2008).
  4. Xie, J., et al. Nanofiber membranes with controllable microwells and structural cues and their use in forming cell microarrays and neuronal networks. Small. 7 (3), 293-297 (2011).
  5. Xie, J., et al. Radially aligned, electrospun nanofibers as dural substitutes for wound closure and tissue regeneration applications. ACS. 4 (9), 5027-5036 (2010).
  6. Xie, J., et al. "Aligned-to-random" nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site. Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).
  7. Jiang, J., et al. Expanded 3D Nanofiber Scaffolds: Cell Penetration. Neovascularization, and Host Response. Advanced Healthcare Materials. 5 (23), 2993-3003 (2016).
  8. Jiang, J., et al. Expanding Two-Dimensional Electrospun Nanofiber Membranes in the Third Dimension by a Modified Gas-Foaming Technique. ACS Biomaterials Science & Engineering. 10 (1), 991-1001 (2015).
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