Aqui apresentamos um protocolo que combina um sistema de cocultura neural-endotelial in vitro e incorporação metabólica de sialoglicano com grupos funcionais bioortogonais para expandir as células primárias de tronco neural e progenitoras e rotular sua superfície sialoglycoproteínas para a análise da imagem latente ou da massa-espectrometria de marcadores da superfície da pilha.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Identificando marcadores de superfície celular da haste neural primária e células progenitoras por rotulagem metabólica de Sialoglycan
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A haste neural e as células progenitoras (NSPCs) são a base celular para as complexas estruturas e funções do cérebro. Eles estão localizados em nichos especializados in vivo e podem ser isolados e expandidos in vitro, servindo como um importante recurso para o transplante de células para reparar danos cerebrais. No entanto, os NSPCs são heterogêneos e não claramente definidos no nível molecular ou purificados devido à falta de marcadores específicos de superfície celular. O protocolo apresentado, que foi relatado previamente, combina um sistema neural-endothelial da cocultura com um método metabólico da rotulagem do glicana para identificar o sialoglycoproteome de superfície de nspcs preliminares. O sistema de cocultura NSPC-endotelial permite a autorenovação e expansão de NSPCs primários in vitro, gerando um número suficiente de nspcs. os Sialoglicanos em nspcs cultivados são rotulados usando um repórter metabólico de ácido siálico não natural com grupos funcionais bioortogonais. Comparando o sialoglycoproteome dos NSPCs Self-renovando expandidos em uma cocultura endothelial com diferenciação da cultura neural, nós identificamos uma lista de proteínas da membrana que são enriquecidas em NSPCs. Em detalhe, o protocolo envolve: 1) set-up de uma cocultura NSPC-endotelial e de uma cultura de diferenciação de NSPC; 2) rotulagem com azidoaçúcar por-O-acetilado N-azidoacetilmannosamina (AC4Mannaz); e 3) conjugação de biotina ao sialoglicíno modificado para imagem após fixação da cultura neural ou extração protéica da cultura neural para análise de espectrometria de massas. Em seguida, os candidatos a marcadores de superfície enriquecidos com NSPC são selecionados por análise comparativa de dados de espectrometria de massas tanto do NSPC expandido quanto de culturas neurais diferenciadas. Este protocolo é altamente sensível para identificar proteínas da membrana da baixa abundância nos materiais de partida, e pode ser aplicado à descoberta do marcador em outros sistemas com modificações apropriadas
Introdução
Células-tronco neurais são definidas como uma população de células multipotentes que podem se autorenovar para manter uma piscina de células-tronco e diferenciar-se em neurônios e glia. Eles são os principais tipos de células no sistema nervoso e podem oferecer grande potencial terapêutico na medicina regenerativa através da transplantação celular em cérebros doentes e feridos1,2. Como o desenvolvimentoprossegue, apopulação de células-tronco neural torna-se heterogênea3,4, ea proporção de células-tronco neurais no cérebro diminui gradualmente
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os protocolos animais utilizados neste estudo foram aprovados pelo IACUC (Comitê institucional de cuidados e uso de animais) da Universidade de Tsinghua e realizados de acordo com as diretrizes do IACUC. A instalação de laboratório de animais na Universidade de Tsinghua foi credenciada pela AAALAC (Associação para avaliação e acreditação de laboratório de cuidados com animais internacionais). Para o estadiamento dos embriões, o meio-dia do tampão vaginal identificado foi calculado como dia embrionário 0,5 (E 0,5).
Nota: Todas as células são cultivadas na incubadora de células em condições de 37 ° c e 5% CO2....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Todo o procedimento para expansão in vitro e rotulagem metabólica de NSPCs embrionários primários demora 6 dias (Figura 1a). A qualidade da linha celular BEND3 e os NSPCs primários recém-isolados são fundamentais para uma experiência bem-sucedida. As células BEND3 são a fonte de fatores solúveis que estimulam a autorenovação e a proliferação de NSPCs. Deve-se garantir que as células BEND3 estejam livres de qualquer contaminação e se dividam ativamente com a m.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Os marcadores de superfície são comumente usados para rotular e purificar ostipos de célulasespecíficas in vitro e in vivo17,18. Descoberta de marcadores de superfície contribui grandemente para a medicina regenerativa e pesquisas de células-tronco, fornecendo ferramentas moleculares para enriquecer seletivamente uma população de células-tronco de tecidos normais ou patológicos e pratos de cultura, oferecendo uma célula purificada recurso para uso clínico ou estu.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Figura 1b, 1C, 1e e 1F são reproduzidos a partir de Bai et al . 10 de com permissão da sociedade real de química. Agradecemos Yi Hao no laboratório de X. C. para edição de figura. Este trabalho é apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (no. 91753206 para Q. S. e X. C., no. 31371093 para Q. S., e nos. 21425204 e 21672013 para X. C.).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| BEND3 | ATCC | CRL-229 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| L-glutamina | Gibco | 25030081 | 1% |
| piruvato de sódio | Sigma | P5280 | 1% |
| N2 suplemento | Gibco | 17502048 | 1 a 100 |
| N-acetil-L-cisteína | Sigma | A7250 | 1 mM |
| Papaína | Worthington | LS003726 | 10 U/mL |
| B27 suplemento | Gibco | 17504044 | 1 a 50 |
| Poli-L-lisina | Sigma | P4707 | |
| Fator básico de crescimento de fibroblastos | Gibco | PHG0261 | 10 ng/mL |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140122 | 1% |
| Soro bovino fetal | Gibco | 10099141 | 10% |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| Tripsin-EDTA, 0,25% | Gibco | 25200056 | |
| DPBS | Gibco | 14190094 | |
| Transwell | Corning | 3450 | |
| Paraformaldeído | Sigma | 158127 | 4% |
| Sacarose | Sangon | A100335 | |
| DAPI | Gibco | 62248 | |
| Buffer RIPA | Thermo Scientific | 89900 | |
| SDS-PAGE buffer de carregamento 2x | Solarbio | P1018 | |
| Placa de 6 poços | Corning | 3335 | |
| Tris-Glycine protein gel | invitrogen | xp00100box | |
| Mouse monoclonal anti-Nestin | Estudo de Desenvolvimento Hybridoma Bank | Rat-401 | 1 a 20 |
| Camundongo monoclonal anti-beta-tubulina III | Sigma | T8860 | 1 a 1.000 |
| Alexa Fluor 488 cabra anti-camundongo IgG1 | invitrogen | A-21121 | 1 a 1.000 |
| Alexa Fluor 546 cabra anti-camundongo IgG2b | invitrogen | A-21143 | 1 a 1.000 |
| Albumina bovina V | Amresco | 0332 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694 | |
| BCA kit de ensaio | Thermo Scientific | 23225 | |
| Dimetil sulfóxido Sigma | D2650 | ||
| Brij97 | Aladdin | B129088 | |
| CuSO4 | Sigma | 209198 | |
| Alcino-biotina | Clique Ferramentas de Química | TA105 | |
| BTTAA | Clique | 1236 | |
| Ferramentas de Química Ac4ManNAz | Click | 1084 | 100 µ M |
| 9AzSia | sintetizado em laboratório | ||
| Ascorbato de sódio | Sigma | A4034 | |
| Metanol | Sigma | 34860 | |
| EDTA | Sangon | A100322 | |
| NaCl | Sangon | A100241 | |
| SDS | Sangon | A100227 | |
| Alexa Farinha 647 conjugada estreptavidina | invitrogen | S21374 | 1 a 1.000 |
| Trietanolamina | Sigma | V900257 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | invitrogen | 60210 | |
| Bicarbonato de amônio | Sigma | 9830 | |
| Coomassie Azul Brilhante R-250 | Thermo Scientific | 20278 | |
| Isoflurano | RWD Life Science Co. | 970-00026-00 | |
| DNase I | Sigma | DN25 | 12 µ g/mL |
| de uréia | Sigma | U5378 |
Referências
- Weissman, I. L. Stem Cells: Units of Development, Units of Regeneration, and Units in Evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Gage, F. H., Temple, S. Neural Stem Cells: Generating and Regenerating the Brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
- Gal, J. S.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
