Artigo de método

Célula de Merkel Polyomavirus infecção e deteção

DOI:

10.3791/58950

⸱

7 de fevereiro de 2019

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Laboratory of Cellular Oncology, National Cancer Institute

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo para infectar primário dos fibroblastos dérmicos humano com MCPyV. O protocolo inclui o isolamento de fibroblastos dérmicos, preparação de virions MCPyV, infecção por vírus, mancha da imunofluorescência e fluorescência hibridação in situ. Este protocolo pode ser estendido para caracterizar as interações MCPyV-host e descobrindo outros tipos de células infectáveis pelo MCPyV.

Resumo

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Merkel, carcinoma celular (MCC), uma forma altamente agressiva de câncer de pele pode provocar infecção de polyomavirus (MCPyV) de células de Merkel. Estudos mecanicistas para investigar plenamente os mecanismos oncogênicos e biologia molecular de MCPyV foram dificultados pela falta de modelos de cultura celular adequada. Aqui, descrevemos um conjunto de protocolos para executar e detecção de infecção MCPyV de células de pele humana primária. Os protocolos descrevem o isolamento de fibroblastos dérmicos humanos, preparação de recombinantes MCPyV virions e detecção da infecção do vírus por imunofluorescência (IF) coloração e reação em cadeia em situ hibridização de DNA (HCR), que é um altamente sensível fluorescência na abordagem de situ hybridization (FISH). Os protocolos neste documento podem ser adaptados por pesquisadores interessados a identificar outros tipos de células ou linhas celulares que suportam MCPyV infecção. A abordagem descrita do peixe também poderia ser adaptada para a detecção de níveis baixos de DNAs virais presentes na pele humana infectada.

Introdução

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Célula de Merkel polyomavirus (MCPyV) é um vírus pequeno, double-stranded do DNA que tem sido associado um câncer de pele raro mas agressivo, Merkel cell carcinoma (MCC)1,2. A taxa de mortalidade de MCC, cerca de 33%, ultrapassa a de melanoma3,4. MCPyV tem um genoma circular de ~ 5 kb1,5 , dividido por uma região reguladora não-codificantes (NCRR) em regiões1de codificação cedo e tarde. O NCRR contém a origem viral de replicação (Ori) e promotores bidirecional para trans....

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Protocolo

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Prepúcios neonatais humanos foram obtidos pelo centro de pesquisa de doença de pele de Penn. Fibroblastos humanos adultos foram obtidos de pele normal descartada após a cirurgia. Todos os protocolos foram aprovados pela Universidade da Pennsylvania institucional Review Board.

1. isolamento de fibroblastos dérmicos humanos

  1. Use um par de tesouras para cortar fora o tecido subcutâneo e gordo de prepúcio humano neonatal e cortar a amostra de pele em metades ou quartos.
  2. Incubar o tecido em 5 mL de dispase 10 mg/mL II em PBS suplementado com antibiótico-antimicótico a 4 ° C durante a noite.
  3. Em um prato de estéril 10c....

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Resultados

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O protocolo descrito neste manuscrito permitiu o isolamento de uma população quase homogênea de HDFs (Figura 1). Como demonstrado pela coloração imunofluorescente, quase 100% da células dérmicas humanas isolado usando nas condições descritas no presente protocolo foram positivamente manchado por colágeno, vimentina e marcadores de fibroblastos dérmicos eu24, mas negativo para o ser humano marcador de queratinócitos do prepúcio K14 (

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Discussão

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Os métodos descritos acima, incluindo isolamento de fibroblastos dérmicos do tecido da pele humana, elaboração de recombinantes MCPyV virions, infecção das células cultivadas, coloração imunofluorescente e um método de peixes sensível adaptado da tecnologia do HCR, que deve permitir aos investigadores analisar MCPyV infecção27. Um dos passos mais importantes para a realização MCPyV infecção in vitro é a produção de preparações de alta-título do virion. Usando o protocolo para a preparação de recom.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Os autores gostaria de agradecer o Dr. Meenhard Herlyn (Instituto de Wistar) e Dr. M. Celeste Simon (Universidade da Pensilvânia) para fornecer reagentes e suporte técnico. Agradecemos também os membros dos nossos laboratórios de discussão útil. Este trabalho foi apoiado pelas concessões do National Institutes of Health (NIH) (R01CA187718, R01CA148768 e R01CA142723), a concessão de apoio de centro NCI câncer (NCI P30 CA016520) e o prêmio de Penn CFAR (P30 AI 045008).

....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Soro fetal de bezerroHyCloneSH30071.03
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais, 100XThermo Fisher Scientific11140050
GLUTAMAX I, 100XThermo Fisher Scientific35050061L-Glutamina
DPBS, sem cálcio, sem magnésioThermo Fisher Scientific14190136
0,05% Tripsina-EDTAThermo Fisher Scientific25300-054
DMEM/F12 meio ThermoFisher Scientific11330-032
Proteína EGF Humana Recombinante, CFR& D systems236-EG-200Armazenar a -80 graus Celsius
CHIR99021Cayman Chemical13122Armazenar a -80 graus Celsius
CHIR99021SigmaSML1046Armazenar a -80 graus Celsius
Colagenase tipo IVThermo Fisher Scientific17104019
Dispase IIRoche4942078001
Antibiótico-AntimicóticoThermo Fisher Scientific15240-062Proteger da luz
Meio DMEMThermo Fisher Scientific11965084
Alexa Fluor 594 cabra anti-rato IgGThermo Fisher ScientificA11032Proteger da luz
Alexa Fluor 488 cabra anti-coelho IgGThermo Fisher ScientificA11034Proteger da luz
OptiPrep Densidade Gradiente MédioSigmaD1556Proteger da luz
ParaformaldeídoSigmaP6148
anti-MCPyV LT (CM2B4)Santa Cruzsc-136172Lote # B2717
MCV VP1 coelhoSoro policlonal de coelho #10965https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
HygromycinRoche10843555001
Fatores básicos de crescimento de fibroblastos (bFGF),Corning354060Armazenar a -80 graus Celsius
Benzonase NucleaseSigmaE8263
DNase dependente de ATP segura para plasmídeoEPICENTREE3101K
Tampão de hibridização por sondaTecnologias moleculares
Tampão de lavagem por sondaTecnologias moleculares
Tampão de amplificaçãoTecnologias
moleculares Grampos de cabelo marcados com Alexa 594Tecnologias molecularesB4Proteger da luz
Triton X-100SigmaX100
Quant-iT PicoGreen dsDNA ReagenteThermo Fisher ScientificP7581
BamHI-HFNEBR3136
Buffer PBQiagen19066
coluna de rotação miniprep azulQiagen27104
50mL Tubos de centrífuga cônicosCorning352070
T4 ligaseNEBM0202T
MagicMark XPThermo Fisher ScientificLC5602
recombinante humano

Referências

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  1. Gjoerup, O., Chang, Y. Advances in Cancer Research. Vande Woude, G., Klein, G. 106, Academic Press. 1-51 (2010).
  2. Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
  3. Lemos, B., Nghiem, P.

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Etiquetas

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