Artigo de método

Célula de Merkel Polyomavirus infecção e deteção

DOI:

10.3791/58950

⸱

7 de fevereiro de 2019

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Laboratory of Cellular Oncology, National Cancer Institute

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um protocolo para infectar primário dos fibroblastos dérmicos humano com MCPyV. O protocolo inclui o isolamento de fibroblastos dérmicos, preparação de virions MCPyV, infecção por vírus, mancha da imunofluorescência e fluorescência hibridação in situ. Este protocolo pode ser estendido para caracterizar as interações MCPyV-host e descobrindo outros tipos de células infectáveis pelo MCPyV.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Merkel, carcinoma celular (MCC), uma forma altamente agressiva de câncer de pele pode provocar infecção de polyomavirus (MCPyV) de células de Merkel. Estudos mecanicistas para investigar plenamente os mecanismos oncogênicos e biologia molecular de MCPyV foram dificultados pela falta de modelos de cultura celular adequada. Aqui, descrevemos um conjunto de protocolos para executar e detecção de infecção MCPyV de células de pele humana primária. Os protocolos descrevem o isolamento de fibroblastos dérmicos humanos, preparação de recombinantes MCPyV virions e detecção da infecção do vírus por imunofluorescência (IF) coloração e reação em cadeia em situ hibridização de DNA (HCR), que é um altamente sensível fluorescência na abordagem de situ hybridization (FISH). Os protocolos neste documento podem ser adaptados por pesquisadores interessados a identificar outros tipos de células ou linhas celulares que suportam MCPyV infecção. A abordagem descrita do peixe também poderia ser adaptada para a detecção de níveis baixos de DNAs virais presentes na pele humana infectada.

Introdução

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Célula de Merkel polyomavirus (MCPyV) é um vírus pequeno, double-stranded do DNA que tem sido associado um câncer de pele raro mas agressivo, Merkel cell carcinoma (MCC)1,2. A taxa de mortalidade de MCC, cerca de 33%, ultrapassa a de melanoma3,4. MCPyV tem um genoma circular de ~ 5 kb1,5 , dividido por uma região reguladora não-codificantes (NCRR) em regiões1de codificação cedo e tarde. O NCRR contém a origem viral de replicação (Ori) e promotores bidirecional para transcrição viral6,7. A região precoce codifica proteínas de antígeno de tumor chamadas grande T (LT), pequeno T (sT), 57kT, alternativa LT ORF (ALTO), bem como de autoregulatory miRNA1,8,9,10. Região da tarde codifica as proteínas do capsídeo VP1 e VP211,12,13. LT e sT são as proteínas de MCPyV mais bem estudadas e foram mostrados para suportar a replicação do DNA viral e tumorigênese induzida por MCPyV5. Integração clonal de MCPyV DNA no genoma hospedeiro, que tem sido observado em até 80% de MCCs, provavelmente é um factor causal para tumor de vírus positivo desenvolvimento14,15.

A incidência de MCC triplicou durante os últimos vinte anos16. Infecção assintomática do MCPyV também é generalizada na população em geral17,18,19. Com o aumento do número de diagnósticos MCC e a alta prevalência de infecção MCPyV, há uma necessidade de melhorar a nossa compreensão do vírus e seu potencial oncogênica. No entanto, muitos aspectos da biologia de MCPyV e oncogênicos mecanismos permanecem mal compreendidos20. Isto é principalmente porque MCPyV Replica mal em celulares estabelecidas linhas11,12,21,22,23 e, até recentemente, as células capazes de suportar a MCPyV da pele infecção não tinha sido descoberto22. Estudos mecanicistas para investigar plenamente MCPyV e sua interação com células hospedeiras foram dificultados pela falta de um sistema de cultura de células para a propagação do vírus5.

Descobrimos que fibroblastos dérmicos humanos primários (HDFs) isolaram em infecção do prepúcio humano neonatal suporte robusta MCPyV, ambos em vitro e ex vivo24. Neste estudo, pudemos estabelecer o primeiro modelo de infecção de cultura celular para MCPyV24. Baseando-se este modelo de sistema, nós mostramos que a indução de genes de metaloproteinase (MMP) matriz pelo WNT/β-catenina sinalização via e outros factores de crescimento estimula a infecção MCPyV. Além disso, achamos que o FDA aprovou MEK antagonista trametinib inibe eficazmente MCPyV infecção5,25. Destes estudos, também estabelecemos um conjunto de protocolos para isolar os fibroblastos dérmicos humanos24,25, preparando MCPyV virions11,12, realizando MCPyV infecção em fibroblastos dérmicos humanos 24 , 25 e detecção de MCPyV de proteínas por se coloração26. Além disso, adaptamos o in situ DNA hibridização reação em cadeia (HCR) tecnologia27 para desenvolver uma técnica altamente sensível de peixe (peixe de HCR-DNA) para detecção de DNA MCPyV em células de pele humana infectada. Esses novos métodos será útil para estudar o ciclo infeccioso de MCPyV, bem como a resposta celular a infecção MCPyV. As células de reservatório de hospedeiros naturais que mantêm MCPyV infecção e as células que dão origem aos tumores MCC permanecem desconhecidas. As técnicas que descrevemos neste manuscrito poderiam ser aplicadas para examinar vários tipos de células humanas para identificar tanto as células de reservatório e origem de tumores MCC. Nossos métodos estabelecidos, tais como peixes HCR-DNA, também podem ser empregados na detecção de outros vírus de tumor de DNA e a caracterização das interações de células do hospedeiro.

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Protocolo

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Prepúcios neonatais humanos foram obtidos pelo centro de pesquisa de doença de pele de Penn. Fibroblastos humanos adultos foram obtidos de pele normal descartada após a cirurgia. Todos os protocolos foram aprovados pela Universidade da Pennsylvania institucional Review Board.

1. isolamento de fibroblastos dérmicos humanos

  1. Use um par de tesouras para cortar fora o tecido subcutâneo e gordo de prepúcio humano neonatal e cortar a amostra de pele em metades ou quartos.
  2. Incubar o tecido em 5 mL de dispase 10 mg/mL II em PBS suplementado com antibiótico-antimicótico a 4 ° C durante a noite.
  3. Em um prato de estéril 10cm, separe com cuidado da epiderme das camadas dérmicas usando microdissection fórceps.
  4. Transferência do tecido cutâneo resultante para um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de colagenase 2 mg/mL tipo IV em FBS-free suplementado com antibiótico-Antimicótico.
  5. Incube a amostra a 37 ° C em 5% de CO2 para 4-6 h com agitação periódica até permanecem apenas alguns agregados de tecido macroscópica.
  6. Versão única células da derme pipetando subindo e descendo (moer) vigorosamente dez vezes com uma pipeta de 10 mL.
  7. Centrifugar a 180 x g por 5 min e descartar o sobrenadante.
  8. Placa das células dissociadas em meio DMEM suplementado com soro fetal bezerro de 10%, 1% não aminoácidos essenciais e 1% L-glutamina a 37 ° C em 5% CO2.

2. recombinante preparação de MCPyV do virion

  1. Digest 50 µ g de pR17b do plasmídeo (carregando MCPyV genoma) com 250 U de BamHI-HF em um volume de 200 µ l (4 h a 37 ° C) para separar o genoma viral da espinha dorsal de vetor (Figura 2).
  2. Adicionar 1200 µ l de tampão PB (suplementado com 10 µ l de 3 M NaAc, pH 5.2) ao DNA digerido e purificar por 2 colunas de rotação de miniprep (capacidade de DNA de 20 µ g). Eluir o plasmídeo digerido pR17b de cada coluna com 200 µ l de tampão TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA).
  3. Prepare a reação da ligadura num tubo de centrífuga de 50 mL. Adicione 400 µ l de plasmídeo purificado da etapa 2.2, 8,6 mL de tampão de ligase x T4 1.05 e 6 µ l de ligase de alta concentração de T4. Incube a 16 ° C durante a noite.
  4. Adicionar 45 mL de tampão PB (suplementado com 10 µ l de 3 M NaAc, pH 5.2) para a ligadura e usar um distribuidor de vácuo para carregar através de 2 colunas de rotação de miniprep. Eluir cada coluna com 50 µ l de tampão TE. Espere um rendimento de cerca de 30 µ g de DNA.
  5. À tarde à tarde/noite, semente 6 x 106 293TT28 células em um 10cm prato contendo meio DMEM, suplementado com 10% de soro fetal bezerro, 1% não aminoácidos essenciais e 1% L-glutamina sem hptII B.
  6. Na manhã seguinte, certifique-se de que as células são cerca de 50% confluentes. Transfect usando 66 µ l de reagente de transfeccao (1.1 µ l/cm2), 12 µ g de re-ligado MCPyV isolar o DNA R17b da etapa 2.4, 8.4 µ g de ST pMtB de plasmídeo de expressão e 9,6 µ g de LT expressão do plasmídeo pADL *29.
  7. Quando as células transfectadas são quase confluentes, no dia seguinte, trypsinize as células e transferi-los para um prato de 15 cm para a continuação da expansão.
  8. Opcionalmente, levar um pequeno número de células de 293TT após a expansão e executar se mancha para MCPyV LT (CM2B4) e VP1 (MCV VP1 coelho30) para determinar a eficiência do transfection. Nesta fase, a nuclear é sinal pode ser visível mas VP1 expressão provavelmente não será detectável.
  9. Quando o prato 15 cm torna-se quase confluente (geralmente 5-6 dias após a inicial do transfection), transferir as células para três pratos de 15 cm. Quando eles se tornam quase confluentes e seguem o protocolo de colheita de vírus abaixo da colheita as células desde os pratos de 15 cm.
    Nota: Opcionalmente execute controle de qualidade se como descrito na etapa 2.8. A maioria das células deve ser MCPyV LT e VP1 positivo nesta fase.
  10. Para recolher o vírus, trypsinize células, girar a 180 x g durante 5 min à RT e remover o sobrenadante. Adicione um volume de sedimento de célula de DPBS-Mg (DPBS com 9,5 mM MgCl2 e 1 x antibiótico antimicótico). Em seguida, adicionar sulfato de amônio 25 mM (a partir de uma solução estoque 1m pH 9) seguido por 0,5% Triton X-100 (a partir de uma solução 10% das ações), 0,1% Benzonase e 0,1% de uma DNase ATP-dependente. Misture bem e incubar a 37 ° C durante a noite.
  11. Incubar a mistura por 15 min no gelo e em seguida, adicionar volume 0.17 de 5 M de NaCl. Misturar e incubar no gelo por outro 15 min. centrifugação por 10min a 12.000 x g em uma centrífuga de 4 ° C. Se o sobrenadante não é claro, suavemente inverta o tubo e repita a etapa de fiação. Transferi o sobrenadante para um tubo novo.
  12. Resuspenda o pellet usando um volume de DPBS suplementado com 0,8 M NaCl e girar novamente, conforme descrito na etapa 2.11.
  13. Combine os sobrenadantes da etapa 2.11 e 2.12 e girar mais uma vez, conforme descrito na etapa 2.11.
  14. Despeje os gradientes de iodixanol em tubos de polyallomer de 5 mL de parede fina por subjacentes (27% e 33%, em seguida 39%) ~0.7 passos de mL utilizando uma seringa de 3 mL equipado com uma agulha longa ou uma pipeta p1000.
  15. Carrega 3 mL de esclareceu sobrenadante contendo vírus do gradiente iodixanol preparado.
  16. Girar para 3,5 h a 234.000 x g e 16 ° C em um rotor de SW55ti. Defina a aceleração e desaceleração para retardar.
  17. Após ultracentrifugação, colete 12 fracções em tubos siliconizados (cada fração é ~ 400 µ l).
  18. Analisar as frações para a presença do vírus dsDNA reagente e/ou borrão ocidental para VP1 (MCV VP1 coelho30). Piscina gradientes fracções com pico dsDNA e/ou conteúdo VP1 e caracterizar o estoque por PCR quantitativo para calcular o equivalente do genoma viral31. Armazenar o estoque do virion de MCPyV a-80 ° C.

3. infecção

  1. Manter primários fibroblastos dérmicos humanos em DMEM com soro fetal bezerro de 10%, 1% não aminoácidos essenciais e 1% L-glutamina. Ao atingir a confluência, dividi fibroblastos 1:4 sem girar para baixo.
    Nota: Utilize para maior eficiência de infecção MCPyV, fibroblastos primários entre 5 e 12, que se dividem activamente no momento do chapeamento de passagens.
  2. Para infectar humanos fibroblastos dérmicos, Aspire o meio e lavar as células com DPBS.
  3. Adicionar 1 mL de 0.05% Trypsin-EDTA para o prato e incubar a 37 ° C, durante 5-10 min.
  4. Verifique sob o microscópio para certificar-se que as células estão saindo o prato.
  5. Adicionar 10 mL DMEM/F12 meio contendo 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF e 3 µM de CHIR99021, os quais estimulam a infecção MCPyV24, para o prato e transferir a solução de célula para um tubo de 15 mL.
  6. Gire para baixo as células a 180 x g por 2 min e descartar o sobrenadante. Ressuspender as células em meio DMEM/F12 contendo 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF e 3µM CHIR99021 em 2-4 x 104 células / mL.
  7. Sementes de 200 µ l de suspensão de célula suplementada com 1 mg/mL colagenase tipo IV em cada poço de uma placa de 96 poços. Descongele o estoque de vírion MCPyV no gelo. Adicione 109 equivalentes de genoma viral dos virions MCPyV (calculado na etapa 2.18) por 1 µ l do iodixanol para cada 2.500 para 5000 células ser infectado.   Bata o lado da placa suavemente e coloque a placa na incubadora.
  8. Após a incubação a 37 ° C em 5% de CO2 para 48-72 h, adicionar 20% FBS a cada poço.
  9. Permitir que a infecção proceder a 37 ° C em 5% de CO2 para 72-96 h.

4. imunofluorescência coloração

  1. Conserte as células obtidas no passo 3.9 com paraformaldeído 3% em PBS por 20 min.
  2. As células com PBS lave duas vezes.
  3. Incubar as células no buffer de bloqueio/permeabilização (0,5% Triton X-100, 3% BSA em PBS filtrado através de filtro de 0,22 µm) em RT por 1h.
  4. Incubar as células com as seguintes anticorpos primários: mouse LT anticorpo monoclonal anti-MCPyV (CM2B4) (1: 1000) e VP1 anticorpos de coelho policlonal anti-MCPyV (1: 2000), em RT para 3h.
  5. Lave as células com PBS três vezes.
  6. Incubar as células com os anticorpos secundários: Fluor 594 do anti-rato de cabra IgG (1: 1000) e Fluor 488 cabra anti-IgG de coelho (1: 500) em RT por 1h.
  7. Lave as células com PBS três vezes.
  8. Counterstain as células com 0,5 µ g/mL DAPI (4, 6-Diamidino-2-Phenylindole, dicloridrato).
  9. Monte as lamelas de vidro desliza e analisar usando um microscópio de fluorescência invertido.

5. In situ do DNA-HCR

Nota: Esta técnica requer que as células ser semeado em lamelas. Para este efeito, as condições de infecção descritas acima (passo 3) podem ser ampliadas para o formato de 24-placa.

  1. Consertar as células cultivadas em lamelas com 4% PFA em PBS durante 10 min. Lave as lamelas duas vezes com PBS, então tratá-los com etanol a 70% para permeabilize as células a 4 ° C durante a noite.
    Nota: Amostras fixas podem permanecer nesse estado por vários dias.
  2. Pre-cruzar amostras substituindo o etanol com tampão de hibridização da sonda e incubar por 60 min em RT
  3. Diluir a ição (1 µM) (tabela 1) na hibridização da sonda buffer solução na diluição de 1: 500 30 min antes do final da etapa de pré-hibridização e incubar a 45 ° C.
  4. No final da incubação do, adicionar ~ 10 μL da mistura diluída sonda por lamela em corrediças do microscópio. Lugar de lamelas, célula-lado para baixo, em suas respectivas gotículas de sonda de hibridização misturar. Sele as bordas e costas das lamelas para os slides com uma quantidade generosa de cola de borracha.
  5. Aqueça os slides com sondas adicionadas a 94 ° C por 3 min, definindo os slides no lado liso de um bloco de calor. Transferir os slides para uma câmara umidificada e incubar a 45 ° C durante a noite. Para fazer uma simples câmara umidificada, humedeça ligeiramente toalhas de papel estéril com dH2O e coloque no fundo de um recipiente de plástico que sela com uma junta de borracha.
    Nota: Durante o aquecimento o cimento de borracha pode borbulhar brevemente. No entanto, certifique-se que o selo não quebra.
  6. Cuidadosamente descascar o cimento de borracha com pinça e coloque a lamelas célula para cima de volta para poços de uma placa de 24. Lave as lamínulas com tampão de lavagem da sonda a RT três vezes.
  7. Incubar a lamela no buffer de amplificação (200 µ l em placas de 24 poços) em RT 30-60 min.
  8. Entretanto, cada uma os dois grampos do oligonucleotide rotulado reconhecendo as sondas (tabela 1), em tubos de PCR separados por aquecimento a 94 ° C por 90 anneal s e resfriamento para RT por 30 min, enquanto protege contra a luz. Misture os dois grampos no buffer de amplificação, cada um a uma diluição de 01:50.
  9. Fazer uma superfície para a reação de amplificação esticando a película de parafina sobre a face aberta de uma tampa da placa 24. Pipete gotas de 50-100 µ l da mistura tampão grampo/amplificação para a película de parafina para cada lamela. Use pinça para retirar cuidadosamente as lamelas da solução pré-amplificação. Seque a lamela, tocando a borda para uma limpeza descartável porosa e coloc célula-lado para baixo sobre a gota de amplificação.
  10. Coloque a tampa da placa segurando as lamelas em uma câmara umidificada e incubar durante a noite a RT no escuro.
  11. Devolver as lamelas de poços, mais uma vez. Incubar as amostras com 5 x SSCT [5 x citrato de sódio (CCD) de cloreto de sódio 0,1% Tween 20 filtrada através de um filtro de 0,22 µm] contendo 0,5 µ g/mL DAPI por 1h no RT lavar as amostras duas vezes com 5 x SSCT no RT
  12. Monte as lamelas em corrediças do microscópio. Analisar as células e a imagem das amostras usando um microscópio de fluorescência invertido.

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Resultados

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O protocolo descrito neste manuscrito permitiu o isolamento de uma população quase homogênea de HDFs (Figura 1). Como demonstrado pela coloração imunofluorescente, quase 100% da células dérmicas humanas isolado usando nas condições descritas no presente protocolo foram positivamente manchado por colágeno, vimentina e marcadores de fibroblastos dérmicos eu24, mas negativo para o ser humano marcador de queratinócitos do prepúcio K14 (

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Discussão

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Os métodos descritos acima, incluindo isolamento de fibroblastos dérmicos do tecido da pele humana, elaboração de recombinantes MCPyV virions, infecção das células cultivadas, coloração imunofluorescente e um método de peixes sensível adaptado da tecnologia do HCR, que deve permitir aos investigadores analisar MCPyV infecção27. Um dos passos mais importantes para a realização MCPyV infecção in vitro é a produção de preparações de alta-título do virion. Usando o protocolo para a preparação de recom...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Os autores gostaria de agradecer o Dr. Meenhard Herlyn (Instituto de Wistar) e Dr. M. Celeste Simon (Universidade da Pensilvânia) para fornecer reagentes e suporte técnico. Agradecemos também os membros dos nossos laboratórios de discussão útil. Este trabalho foi apoiado pelas concessões do National Institutes of Health (NIH) (R01CA187718, R01CA148768 e R01CA142723), a concessão de apoio de centro NCI câncer (NCI P30 CA016520) e o prêmio de Penn CFAR (P30 AI 045008).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Soro fetal de bezerroHyCloneSH30071.03
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais, 100XThermo Fisher Scientific11140050
GLUTAMAX I, 100XThermo Fisher Scientific35050061L-Glutamina
DPBS, sem cálcio, sem magnésioThermo Fisher Scientific14190136
0,05% Tripsina-EDTAThermo Fisher Scientific25300-054
DMEM/F12 meio ThermoFisher Scientific11330-032
Proteína EGF Humana Recombinante, CFR& D systems236-EG-200Armazenar a -80 graus Celsius
CHIR99021Cayman Chemical13122Armazenar a -80 graus Celsius
CHIR99021SigmaSML1046Armazenar a -80 graus Celsius
Colagenase tipo IVThermo Fisher Scientific17104019
Dispase IIRoche4942078001
Antibiótico-AntimicóticoThermo Fisher Scientific15240-062Proteger da luz
Meio DMEMThermo Fisher Scientific11965084
Alexa Fluor 594 cabra anti-rato IgGThermo Fisher ScientificA11032Proteger da luz
Alexa Fluor 488 cabra anti-coelho IgGThermo Fisher ScientificA11034Proteger da luz
OptiPrep Densidade Gradiente MédioSigmaD1556Proteger da luz
ParaformaldeídoSigmaP6148
anti-MCPyV LT (CM2B4)Santa Cruzsc-136172Lote # B2717
MCV VP1 coelhoSoro policlonal de coelho #10965https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
HygromycinRoche10843555001
Fatores básicos de crescimento de fibroblastos (bFGF),Corning354060Armazenar a -80 graus Celsius
Benzonase NucleaseSigmaE8263
DNase dependente de ATP segura para plasmídeoEPICENTREE3101K
Tampão de hibridização por sondaTecnologias moleculares
Tampão de lavagem por sondaTecnologias moleculares
Tampão de amplificaçãoTecnologias
moleculares Grampos de cabelo marcados com Alexa 594Tecnologias molecularesB4Proteger da luz
Triton X-100SigmaX100
Quant-iT PicoGreen dsDNA ReagenteThermo Fisher ScientificP7581
BamHI-HFNEBR3136
Buffer PBQiagen19066
coluna de rotação miniprep azulQiagen27104
50mL Tubos de centrífuga cônicosCorning352070
T4 ligaseNEBM0202T
MagicMark XPThermo Fisher ScientificLC5602
recombinante humano

Referências

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