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Engineering

Reversibly संलग्न Kinesins द्वारा संचालित आणविक शटल कोडांतरण

Published: January 26, 2019 doi: 10.3791/59068
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University
* These authors contributed equally

Summary

हम आणविक शटल, जहां सतह का पालन kinesin मोटर प्रोटीन प्रेरित डाई-लेबल microtubules का निर्माण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । सतह के साथ kinesins की कमजोर बातचीत के लिए यह उनके प्रतिवर्ती लगाव को सक्षम बनाता है । यह एक नेनो प्रणाली है जो गतिशील विधानसभा और इसके घटकों के विधानसभा प्रदर्शित करता है, जबकि अपनी कार्यक्षमता को बनाए रखने बनाता है ।

Abstract

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे kinesin बनाने के लिए kinesins की सतह के लिए एक कमजोर और प्रतिवर्ती लगाव के साथ आणविक शटल संचालित । पिछले प्रोटोकॉल के विपरीत, इस प्रणाली में, microtubules समाधान से kinesin मोटर प्रोटीन की भर्ती और उंहें एक सतह पर जगह है । kinesins, बारी में, desorbing वापस थोक समाधान में पहले सतह के साथ microtubules के ग्लाइडिंग की सुविधा है, इस प्रकार के लिए फिर से भर्ती होने के लिए उपलब्ध किया जा रहा होगा । इस निरंतर विधानसभा और विधानसभा इस तरह के microtubules ग्लाइडिंग द्वारा अस्थाई kinesin ट्रेल्स के गठन के रूप में इस प्रणाली में गतिशील व्यवहार हड़ताली करने के लिए सुराग ।

इस प्रयोग के दौरान कई प्रायोगिक तरीकों का वर्णन किया जाएगा: यूवी की तुलना spectrophotometry के लिए रिएजेंट के स्टॉक समाधानों की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए किया जाएगा, coverslips पहले ओजोन और पराबैंगनी (यूवी) इलाज किया जाएगा और फिर silanized इससे पहले प्रवाह कोशिकाओं में रखा जा रहा है, और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी एक साथ छवि kinesin मोटर्स और microtubule रेशा करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।

Introduction

सक्रिय nanosystems के व्यवहार को नियंत्रित करने वाले इंटरैक्शन को हमेशा लंबे समय तक जिया जाता है, लगभग अपरिवर्तनीय बांड1,2,3,4,5,6 ,7,8. इस का एक अच्छी तरह से अध्ययन उदाहरण microtubule-kinesin प्रणाली है, जहां ग्लाइडिंग microtubules अचल सतह बंधे kinesin मोटर्स1,2,3,4द्वारा चालित हैं, 5. सिस्टम में घटक एक दूसरे से जुड़े reversibly है सैद्धांतिक रूप से अध्ययन किया गया है9,10 और macroscale11,12पर हासिल की है, लेकिन इन प्रणालियों को नीचे स्केलिंग नेनो चुनौतीपूर्ण रहा है । इस के लिए प्रमुख कारणों में से एक यह है कि तोड़ने और घटकों के बीच बांड सुधार अक्सर पर्यावरण की स्थिति में एक बड़ा परिवर्तन की आवश्यकता है । हालांकि इस तरह के परिवर्तन पिछले13,14,15में लागू किया गया है, वे अपने पर्यावरण के लिए अनुकूल के बजाय प्रणाली को संशोधित करने पर भरोसा करेंगे । डिजाइन आणविक पैमाने पर सिस्टम में जो घटक लगातार इकट्ठा और संरचनाओं में समग्र पर्यावरण जिसमें प्रयोग जगह लेने के लिए गतिशील व्यवहार की एक विस्तृत श्रृंखला की खोज के लिए दरवाजा खुला होगा परेशान बिना पुनर्निर्माण 16 , 17. शी.

यहां, हम वर्णन और एक गतिशील कोडांतरण और नेनो में प्रणाली काम कर कोडांतरण बनाने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का प्रदर्शन । प्रणाली और उसके सामांय व्यवहार से पहले शुरू किया गया है18: microtubule रेशा reversibly सतह से बंधे kinesin-1 मोटर्स की पटरियों द्वारा चालित हैं । इन kinesin मोटर प्रोटीन समाधान से भर्ती कर रहे हैं मदद करने के लिए प्रेरित microtubules आगे, desorbing से पहले फिर शीघ्र ही बाद में । एक बार समाधान में वापस, वे फिर से भर्ती किया जा सकता है एक नया microtubule में वृद्धि । पिछले13,14,15में, तोड़ने और बांड की सुधार आवश्यक पर्यावरणीय संशोधनों; इसके विपरीत, हमारे प्रवाह सेल के पर्यावरण अपरिवर्तित रहता है, जबकि kinesin मोटर्स सतह के साथ बातचीत ।

इस प्रोटोकॉल के लिए दिलचस्पी शोधकर्ताओं में मदद मिलेगी (1) प्रोटोकॉल के सभी कदम कल्पना, और (2) परख के इस प्रकार समस्या निवारण के साथ सहायता करते हैं । यह हावर्ड एट अल. १९९३19में वर्णित प्रक्रियाओं से व्युत्पंन किया गया है ।

Protocol

1. समाधान तैयारी

चेतावनी: तीन इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया एजेंट के (टोल्यूनि, dimethyldichlorosilane, और dithiothreitol) अत्यधिक विषाक्त कर रहे हैं । कृपया उपयोग करने से पहले प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डेटा पत्रक (MSDS) से परामर्श करें । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल के कुछ हिस्सों को सुरक्षा के एक उच्च स्तर के तहत प्रदर्शन करने की जरूरत है, और संकेत के रूप में सुरक्षात्मक दस्ताने के दो सेट पहने । जब तक अंयथा सलाह दी, प्रयोगों प्रयोगशाला बेंच पर प्रदर्शन किया जा सकता है, जबकि सभी उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (सुरक्षा चश्मा, दस्ताने, लैब कोट, पूर्ण लंबाई पैंट, और बंद पैर के जूते) का उपयोग कर ।

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एटीपी, kinesin, और microtubules की सांद्रता प्रत्येक प्रयोग की आवश्यकताओं को देखते हुए संशोधित की जा सकती है । हालांकि, यदि संशोधित, तो कृपया सुनिश्चित करें कि अंय रिएजेंट के अंतिम सांद्रता नीचे दिए गए के रूप में एक ही रहते हैं । सभी प्रयोगों कमरे के तापमान पर प्रदर्शन किया गया, (~ 25 डिग्री सेल्सियस).

  1. स्टॉक समाधानों की तैयारी
    नोट: पहले से निंन समाधानों को तैयार और aliquot । सभी aliquots कमरे के तापमान (~ 25 डिग्री सेल्सियस) पर तैयार किया जा सकता है ।
    1. BRB80 बफर
      नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए समाधानों के अधिकांश के लिए बफ़र BRB80 है । BRB80 बड़ी मात्रा में तैयार किया जा सकता है और एक-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत ।
      1. पिपेराजीन-एन, N′-बीआईएस (2-ethanesulfonic एसिड) (पाइप) और ३.१ ग्राम के पोटेशियम हीड्राकसीड (कोह) में ८०० मिलीलीटर के २४.२ ग्राम को विच्छेदित पानी में ८०० मिलीलीटर की १०० मिमी पाइप बनाने के लिए भंग । 10 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड (MgCl2) और 10 मिमी ईथीलीन ग्लाइकोल tetraacetic एसिड की १०० मिलीलीटर की १०० मिलीलीटर जोड़ें 1 एल के एक अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए EGTA । पोटेशियम के साथ 8 के लिए पीएच स्थापना हीड्राकसीड (KOH) पाइप और EGTA के विघटन में मदद कर सकते हैं ।
        नोट: BRB80 बफर में रसायनों की अंतिम सांद्रता ८० मिमी पाइप, 1 मिमी MgCl2, और 1 मिमी EGTA हैं ।
      2. ६.९ KOH और हाइड्रोक्लोरिक एसिड (HCl) का उपयोग करने के लिए बफर के पीएच समायोजित करें ।
    2. एटीपी
      1. ultrapure पानी में १०० एमएम एटीपी का 1 एमएल सॉल्यूशन तैयार करें । समाधान को 10 μL aliquots में प्लास्टिक । एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में aliquots स्टोर ।
    3. Gtp
      1. ultrapure पानी में 25 एमएम GTP का ५०० μL घोल तैयार करें । समाधान को 5 μL aliquots में प्लास्टिक । एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में aliquots स्टोर ।
    4. MgCl२
      1. ultrapure पानी में १०० mM MgCl2 का 1 मिलीलीटर घोल तैयार करें । समाधान को 10 μL aliquots में प्लास्टिक । एक-20 ° c फ्रीजर में aliquots की दुकान ।
    5. कैसिइन
      1. सूखी कैसिइन के 1 जी वजन और एक ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण । कैसिइन पाउडर भंग करने के लिए ट्यूब के लिए BRB80 बफर की ३५ मिलीलीटर जोड़ें ।
      2. समाधान एक गिलास में एक ठंडे कमरे में जगह रात भर भंग करने के लिए । इस बिंदु पर, समाधान मोटी और चिपचिपा लग जाएगा ।
      3. एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में ट्यूब ईमानदार छोड़ किसी भी बड़े undissolved के झुरमुट के लिए बसने के लिए अनुमति देते हैं । supernatant एक नई ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
      4. १,००० एक्स जी में एक केंद्रापसारक में ट्यूब स्पिन अधिक हालाs बाहर गोली करने के लिए । एक बार फिर, supernatant एक नई ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
      5. ०.२ माइक्रोन (7 बार अधिकतम दबाव) फ़िल्टर का उपयोग करके समाधान को बार-बार फ़िल्टर करें. समाधान मोटी जा रहा है, कई फिल्टर भरा हो जाएगा, तो इस कदम को दोहराने जब तक फिल्टर स्पष्ट और भरा हुआ है ।
      6. कैसिइन के परिणामस्वरूप समाधान में एकाग्रता का निर्धारण यूवी/विज़ spectrophotometry, कैसिइन के विलुप्त होने के गुणांक का उपयोग 19 मिमी-1∙ सेमी-1 पर २८० एनएम20। कैसिइन के लिए 23 केडीए के एक आणविक वजन संभालने, BRB80 में 20 मिलीग्राम ∙ एमएल-1 की एकाग्रता के लिए समाधान पतला ।
      7. समाधान को 20 μL aliquots में प्लास्टिक और aliquots को एक-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें ।
    6. D-ग्लूकोज
      1. ultrapure पानी में 2 एम डी ग्लूकोज का 1 मिलीलीटर समाधान तैयार करें । समाधान को 10 μL aliquots में प्लास्टिक । एक-20 ° c फ्रीजर में aliquots की दुकान ।
    7. ग्लूकोज oxidase
      1. BRB80 में 20 मिलीग्राम ∙ एमएल-1 ग्लूकोज oxidase की एक 1 मिलीलीटर समाधान तैयार करें । समाधान को 10 μL aliquots में प्लास्टिक । एक-20 ° c फ्रीजर में aliquots की दुकान ।
    8. Catalase
      1. BRB80 में ०.८ मिलीग्राम ∙ एमएल-1 catalase की एक 1 मिलीलीटर समाधान तैयार करें । समाधान को 10 μL aliquots में प्लास्टिक । एक-20 ° c फ्रीजर में aliquots की दुकान ।
    9. Dithiothreitol (डीटीटी)
      नोट: के बाद से डीटीटी थोड़ा अस्थिर और विषाक्त है, कृपया एक धुएं हुड के तहत निंनलिखित चरणों का पालन करें ।
      1. 1 मीटर ultrapure पानी में पतला डीटीटी का 1 मिलीलीटर समाधान तैयार करें । समाधान को 10 μL aliquots में प्लास्टिक । एक-20 ° c फ्रीजर में aliquots की दुकान ।
    10. Paclitaxel
      1. DMSO में पतला 1 मिमी paclitaxel का एक 1 मिलीलीटर समाधान तैयार करें । समाधान को 10 μL aliquots में प्लास्टिक । एक-20 ° c फ्रीजर में aliquots की दुकान ।
    11. Dimethyl sulfoxide (DMSO)
      नोट: इन प्रयोगों में प्रयुक्त DMSO शुद्ध है ।
      1. प्लास्टिक 1 मिलीलीटर शुद्ध DMSO में 10 μL aliquots । एक-20 ° c फ्रीजर में aliquots की दुकान ।
    12. Creatine फॉस्फेट
      1. ultrapure पानी में ०.२ मीटर creatine फॉस्फेट का 1 मिलीलीटर घोल तैयार करें । समाधान को 10 μL aliquots में प्लास्टिक । एक-20 ° c फ्रीजर में aliquots की दुकान ।
    13. Creatine phosphokinase
      1. २०० इकाइयों की एक 1 मिलीलीटर समाधान तैयार · एल-1 creatine phosphokinase ultrapure पानी में । समाधान को 10 μL aliquots में प्लास्टिक । एक-20 ° c फ्रीजर में aliquots की दुकान ।
    14. निकेल (II) सल्फेट
      1. ultrapure पानी में ५० mM निकेल (II) सल्फेट का समाधान ५०० मिलीलीटर तैयार करें । कमरे के तापमान (~ 25 डिग्री सेल्सियस) पर समाधान की दुकान ।
    15. पाली (ईथीलीन ग्लाइकोल)-block-पाली (propylene ग्लाइकोल)-block-पाली (ईथीलीन ग्लाइकोल) (खूंटी-PPG-खूंटी) समाधान
      1. बाहर वजन 2 खूंटी के एमजी-PPG-खूंटी (संख्या औसत आणविक वजन: १४,६०० g ∙ मॉल-1)-वजनी कागज पर ंत् पाउडर । खूंटी-PPG-खूंटी-ंत् एक nitrilotriacetic एसिड (ंत्) समूह के साथ कार्यात्मक triblock copolymer है । खूंटी-PPG-खूंटी-ंत् के बारे में अधिक जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें ।
      2. एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में पाउडर स्थानांतरण । स्टॉक निकेल (II) सल्फेट ट्यूब के लिए समाधान की 1 मिलीलीटर जोड़ें । भंवर जब तक पाउडर भंग है और कोई दिखाई नहीं झुरमुट रहते हैं ।
      3. कमरे के तापमान पर एक महीने तक के लिए स्टोर ।
  2. एक प्रयोग शुरू करने से पहले
    1. बर्फ के साथ एक बाल्टी भरें ।
    2. इस प्रकार उंहें बर्फ पर रखने के लिए ऊपर 1.1.13 और उंहें बाल्टी में जोड़ने के लिए 1.1.1 वर्गों में वर्णित 13 रिएजेंट में से प्रत्येक से एक aliquot ले लो । उपयोग करने से पहले प्रत्येक रिएजेंट को गल ।
  3. Microtubule तयारी
    नोट: Microtubules डाई-लेबल lyophilized tubulin के एक 20 μg aliquot से बहुलक थे । डाई की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य ६४७ एनएम का है ।
    1. microtubule विकास बफ़र की तैयारी
      1. प्लास्टिक २१.८ μL BRB80 बफर की एक छोटी (०.६ मिलीलीटर) microcentrifuge ट्यूब में । MgCl2 शेयर समाधान के 1 μL, GTP शेयर समाधान के 1 μL, और μL शेयर समाधान के १.२ DMSO जोड़ें ।
        नोट: इस प्रकार, BRB80 बफ़र में रिएजेंट के अंतिम सांद्रता 4 mm MgCl2, 1 mm GTP, और 5% (v/v) dimethyl sulfoxide हैं ।
    2. Microtubule बहुलकीकरण
      1. microtubule वृद्धि बफर के ६.२५ μL जोड़ें लेबल lyophilized tubulin के एक 20 μg aliquot में सीधे । भंवर 30 आर पी एस में 5 s के लिए aliquot ।
      2. 5 मिनट के लिए बर्फ पर aliquot ठंडा ४५ मिनट के लिए ३७ ° c पर यह मशीन से पहले और धारा 1.3.3 के लिए आगे बढ़ना ।
    3. Microtubule स्थिरीकरण
      1. जोड़ें 5 μL के aliquoted paclitaxel समाधान के लिए ४९० μL के BRB80 बफर । भंवर 30 आर पी एस में 10 s के लिए समाधान ।
      2. एक बार microtubules के लिए मशीन के ४५ मिनट कर रहे हैं, BRB80/paclitaxel समाधान के लिए बहुलक microtubule समाधान के 5 μL जोड़ें ।
        नोट: यह १००-गुना पतला, स्थिर, microtubule समाधान के बाद MT100 के रूप में भेजा जाएगा । यह अप करने के लिए 5 दिनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और यह प्रत्येक प्रयोग के लिए वांछित microtubule घनत्व प्राप्त करने के लिए पतला किया जा सकता है ।
  4. गतिशीलता समाधान
    1. एंजाइमी antifade, एटीपी पुनर्सृजन प्रणाली, और एटीपी
      1. जोड़ें ९.० μL के aliquoted कैसिइन समाधान के लिए २९१ μL के BRB80 बफर ।
      2. यदि प्रयोग के लिए वांछित एटीपी एकाग्रता से कम है 1 मिमी, प्लास्टिक ८३ μL के BRB80/कैसिइन समाधान में एक नया ०.६ एमएल microcentrifuge ट्यूब. अंयथा, एक नया ०.६ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में है कि समाधान के ८५ μL प्लास्टिक ।
      3. इसमें D-ग्लूकोज की 1 μL, ग्लूकोज oxidase की 1 μL, catalase की 1 μL, और उस ट्यूब को μL की 1 डीटीटी जोड़ें ।
        नोट: इन रसायनों का गठन एक एंजाइमी antifade कॉकटेल21 कि भंग ऑक्सीजन को हटाने और प्रतिक्रियाशील कण शमन द्वारा photobleaching कम हो जाएगा । यह प्रतिदीप्ति इमेजिंग के दौरान उत्तेजना रोशनी की वजह से photobleaching और microtubule विघटन कम कर देता है22, 23.
      4. जिन प्रयोगों में एटीपी एकाग्रता को 1 मिमी से काफी कम होना चुना जाता है, उनके लिए एक एटीपी-पुन: जनरेटिंग सिस्टम बनाने के लिए समाधान के लिए निम्नलिखित रिएजेंटों को जोड़ने के लिए, aliquoted creatine फॉस्फेट सॉल्यूशन का 1 μL और aliquoted creatine का 1 μL phosphokinase समाधान ।
      5. गतिशीलता समाधान के लिए स्टॉक एटीपी समाधान के 1 μL जोड़ें । झाड़ या भंवर aliquot को homogenously वितरित रसायनों ।
        नोट: इस प्रकार, समाधान में रसायनों की अंतिम एकाग्रता 10 माइक्रोन paclitaxel, ०.५ मिलीग्राम · एमएल− 1 कैसिइन, 20 एमएम डी-ग्लूकोज, २०० μg · एमएल− 1 ग्लूकोज oxidase, 8 μg · एमएल− 1 catalase, 10 एमएम dithiothreitol, 2 एमएम creatine फॉस्फेट (अगर जोड़ा गया है), 2 इकाइयों L− 1 creatine phosphokinase (यदि जोड़ा गया हो), और 1 मिमी एटीपी । इस समाधान के बाद गतिशीलता समाधान के रूप में संदर्भित किया जाएगा ।
    2. Kinesin
      नोट: इन प्रयोगों में प्रयुक्त स्टॉक kinesin समाधान Sandia राष्ट्रीय प्रयोगशालाओं में एकीकृत Nanotechnologies के लिए केंद्र में जी Bachand द्वारा तैयार किया जाता है और एक प्रयोक्ता समझौते (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php) के तहत उपलब्ध कराया जाता है । यहां इस्तेमाल बफर ४० mm imidazole, ३०० mm NaCl, ०.७६ छ · एल-1 EGTA, ३७.२ मिलीग्राम · L-1 EDTA, ५० छ · दिस एल-1 सुक्रोज, ०.२ मिमी TCEP, और ५० माइक्रोन एमजी-एटीपी. प्रयोगों की इस श्रृंखला के लिए, rkin430eGFP kinesin निर्माण किया गया था । यह एक kinesin चूहे kinesin भारी श्रृंखला के पहले ४३० अमीनो एसिड से मिलकर eGFP और एक सी-टर्मिनल अपने-पूंछ डोमेन24पर टैग से जुड़े हुए है । यह ई कोलाई में व्यक्त किया गया था और एक नी − ंत् कॉलम का उपयोग कर शुद्ध । GFP-kinesin स्टॉक समाधान की एकाग्रता १.८ ± ०.३ माइक्रोन के रूप में यूवी/विज़ spectrophotometry द्वारा निर्धारित किया गया था, ४८९ एनएम25पर ५५ mM-1· cm-1 के GFP के लिए एक विलुप्त गुणांक का उपयोग कर, और खाते में ले कि kinesin एक डिमर है ।
      1. प्रयोग के लिए वांछित kinesin एकाग्रता या सतह घनत्व निर्धारित करें । ठेठ परख के लिए, इस एकाग्रता 20 एनएम है । यदि kinesin एकाग्रता की जरूरत है एक सौ गुना से अधिक पतला हो, यह BRB80 के एक समाधान में पतला है कि शामिल है ०.५ मिलीग्राम · एमएल-1 के कैसिइन ।
      2. approximatively 20 एनएम के एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए गतिशीलता समाधान के लिए kinesin समाधान के 1 µ एल जोड़ें ।
    3. Microtubules
      1. गतिशीलता समाधान के लिए अनुभाग १.३ में तैयार MT100 समाधान के 10 μL जोड़ें ।
        नोट: इस गतिशीलता समाधान के लिए 3 घंटे के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उस समय के बाद, antifade प्रणाली अपनी प्रभावशीलता खो देता है क्योंकि समाधान में ग्लूकोज एंजाइमी प्रतिक्रिया द्वारा समाप्त हो गया है ।

2. प्रवाह कोशिकाओं कोडांतरण

  1. coverslips धुलाई
    1. प्रवाह कोशिकाओं के लिए, एक बड़े coverslip का उपयोग करें (आयाम: ६० मिमी x 25 मिमी) और एक छोटे से एक (आयाम: 22 मिमी x 22 मिमी)19.
    2. सभी coverslips दो बार इथेनॉल के साथ और दो बार ultrapure पानी के साथ कुल्ला । Sonicate 5 मिनट के लिए ultrapure पानी में coverslips को 50 – 75 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर ओवन में सुखा लें ।
    3. एक यूवी/ओजोन क्लीनर का उपयोग करना (सामग्री और निर्माता के निर्देशों की तालिका देखें), 15 मिनट के लिए प्रत्येक coverslip के एक पक्ष का इलाज. इस कदम के कमरे के तापमान (~ 25 डिग्री सेल्सियस) और सामान्य वायुमंडलीय हालत (1 एटीएम के दबाव) में कर सकते हैं ।
    4. ध्यान से अपने दूसरे पक्ष के लिए एक coverslip बारी (चिमटी का उपयोग) और यूवी/
    5. 5 मिनट के लिए ultrapure पानी में coverslips फिर से Sonicate के तापमान पर ओवन में फिर से सूखने से पहले 50-75 ° c ।
  2. coverslips खूंटी-PPG-खूंटी कोटिंग सक्षम करने के लिए इलाज
    नोट: dimethyldichlorosilane और टोल्यूनि उच्च विषाक्त जा रहा है प्रोटोकॉल के इस हिस्से में इस्तेमाल किया, एक धुएं डाकू के तहत निंनलिखित कदम प्रदर्शन, जबकि निंनलिखित सावधानियों ले: सुरक्षात्मक दस्ताने और एक लंबी बाजू शर्ट के दो सेट पहनने के तहत उनकी प्रयोगशाला कोट. कमीज की बांहों के अंदर दस्ताने के किनारों को टक करें ताकि बांहों से कोई भी त्वचा सीधे तौर पर किसी छलकने की स्थिति में रसायनों के संपर्क में न आए । सुरक्षात्मक चश्मे पहनें ।
    1. टोल्यूनि के ४७५ मिलीलीटर में शुद्ध dimethyldichlorosilane के 25 मिलीलीटर पतला । 15 सेकंड के लिए dimethyldichlorosilane और टोल्यूनि समाधान में प्रत्येक coverslip विसर्जित कर दिया ।
    2. coverslips को दो बार टोल्यूनि में और तीन बार मेथनॉल में धो लें । दबाव नाइट्रोजन का उपयोग कर coverslips सूखी ।
  3. प्रवाह कोशिकाओं में coverslips कोडांतरण
    1. एक बार coverslips शुष्क कर रहे हैं, दो 1 सेमी x २.५ सेमी धारियों में खड़ी डबल पक्षीय टेप के एक 2 सेमी x २.५ cm टुकड़ा काट दिया ।
    2. एक नाजुक कार्य वाइपर पर बड़े coverslip रखो और टेप के टुकड़ों के बीच एक 1 सेमी x २.५ सेमी क्षेत्र बनाने के लिए coverslip के किनारों के साथ लंबाई पट्टियों छड़ी ।
    3. टेप धारियों के शीर्ष पर छोटे coverslip छड़ी करने के लिए फ्लो सेल विधानसभा खत्म ।

3. एक प्रवाह सेल में समाधान बह

  1. प्रवाह approximatively के 20 μL खूंटी-PPG-खूंटी समाधान इकट्ठे फ्लो सेल में । सेल में जो मात्रा लगवाई गई है वह चैंबर को भरने के लिए काफी बड़ी होनी चाहिए । अगले चरणों में, समाधानों का आदान-प्रदान करते समय समान वॉल्यूम का उपयोग करें ।
  2. 5 मिनट के लिए सतह पर अवशोषित करने के लिए खूंटी-PPG-खूंटी समाधान के लिए अनुमति दें । BRB80 बफर के साथ खूंटी-PPG-खूंटी समाधान में बफर प्रवाह द्वारा 3 बार विनिमय प्रवाह कक्ष में गतिशीलता समाधान प्रवाह ।
  3. अगर योजनाबद्ध प्रयोग एक घंटे से अधिक समय तक वाष्पीकरण को रोकने के लिए तेल के साथ फ्लो सेल के किनारों को सील करें ।
    नोट: फ्लो सेल अब इमेज्ड होने के लिए तैयार है ।

4. इमेजिंग एक फ्लो सेल

  1. microtubules और kinesin मोटर्स (देखें सामग्री की तालिका) के लिए एक उद्देश्य-प्रकार कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) सेटअप का उपयोग करते हुए इमेजिंग निष्पादित करें ।
    नोट: यहां, हम एक 100x/1.49 संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य लेंस के साथ एक खुर्दबीन का इस्तेमाल किया, दो पराबैंगनीकिरण, ६४२ एनएम के एक तरंग दैर्ध्य और १४० मेगावाट की एक अधिकतम शक्ति के साथ एक, और ४८८ एनएम और १५० मेगावाट की एक अधिकतम शक्ति की तरंग दैर्ध्य के साथ एक और ।
  2. उद्देश्य पर विसर्जन तेल की एक बूंद रखें ।
  3. माइक्रोस्कोप मंच पर फ्लो सेल प्लेस और उद्देश्य लाने जब तक वहां उद्देश्य और प्रवाह सेल पर तेल के बीच संपर्क है ।
  4. भागने से सभी लेजर लाइट को ब्लॉक करने के लिए माइक्रोस्कोप की गूंथ कवर प्रणाली का प्रयोग करें ।
  5. लेजर को चालू करें और फ्लो सेल की निचली सतह पर ध्यान दें । microtubules फ्लोरोसेंट लेबल और ६४७ एनएम के एक तरंग दैर्ध्य पर उत्तेजित कर रहे हैं । वे एक ६४२ एनएम लेजर का उपयोग कर imaged किया जाएगा, जबकि एक ४८८ एनएम लेजर GFP-kinesin मोटर्स के लिए प्रयोग किया जाता है ।
  6. छवियों या ब्याज की वीडियो रिकॉर्ड । आमतौर पर, लेजर शक्ति के बारे में 30 मेगावाट की है और दोनों लेजर चैनलों के लिए ५० ms के एक जोखिम समय है । छवियों के लिए जब तक वहां प्रवाह कक्ष में गतिशीलता है के रूप में दर्ज किया जा सकता है ।
    नोट: लेजर रोशनी नग्न आंखों के लिए हानिकारक है और अपूरणीय क्षति पैदा कर सकता है । कृपया सुनिश्चित करें कि प्रबुद्ध क्षेत्र पूरी तरह से एक अपारदर्शी ढक्कन के साथ कवर किया जाता है ।

Representative Results

इन प्रयोगों में, हम धारा 1.3.2 में तैयार microtubules के एक १,००० बार कमजोर पड़ने का इस्तेमाल किया । kinesin एकाग्रता 20 एनएम था, और एटीपी एकाग्रता था 1 मिमी. इमेजिंग TIRF माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया गया था । ग्लाइडिंग microtubules अलग kinesin मोटर्स से imaged थे: microtubules एक ६४७ एनएम लेजर के साथ उत्तेजना पर दिखाई दे रहे थे (1 चित्रा, लाल), और GFP-kinesin जब एक ४८८ एनएम लेजर के साथ उत्तेजित दिखाई था (1 आंकड़ा, हरा) । रेड और ग्रीन लाइट के साथ उत्तेजना के बीच का समय 1 एस से कम था । फ्रेम के बीच का समय था 10 एस Microtubules प्रदर्शित स्थिर ग्लाइडिंग । औसत microtubule ग्लाइडिंग वेग था approximatively ८०० एनएम/ microtubule सतह घनत्व ४०० mm-2था । kinesin (ग्रीन) की पटरियों कई micrometers के लिए microtubules (लाल) के पीछे के छोर से परे विस्तार दिखाई दिया ।

Figure 1
चित्रा 1: ग्लाइडिंग microtubules कमजोर सतह बंधे kinesin मोटर्स द्वारा चालित । microtubules आगे बढ़ने के रूप में, वे समाधान से kinesin मोटर्स जमा । इन दो राज्यों के बीच वैकल्पिक मोटर्स: एकल microtubule के लिए बाध्य है, और डबल दोनों microtubule और सतह के लिए बाध्य । जब एक डबल बंधे मोटर microtubule के अंत तक पहुंच जाता है, मोटर पीछे छोड़ दिया है और धीरे से सतह से desorbs लगभग ०.१ एस-1की एक बंद दर के साथ । नतीजतन, kinesin मोटर्स के ट्रेल्स microtubules के पीछे रहते हैं । शीर्ष पंक्ति: लाल (microtubule) चैनल । मध्य पंक्ति: हरा (kinesin) चैनल । नीचे पंक्ति: संयुक्त लाल (microtubule) और हरे (GFP-kinesin) चैनल । स्केल बार: 20 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

इस काम में, हम एक सक्रिय नेनो प्रणाली है जो स्वयं को कमजोर-बाध्यकारी इमारत ब्लॉकों के लिए अपने स्वयं के ट्रैक का निर्माण इकट्ठा प्रस्तुत करते हैं । के रूप में चित्र 1में दिखाया गया है, ग्लाइडिंग microtubules समाधान से kinesin मोटर्स जमा और उंहें सतह पर जमा । kinesin मोटर्स समाधान के लिए लौटने से पहले समय की एक छोटी अवधि के लिए microtubule के जाग में रहते हैं । इस प्रकार, इस प्रयोग में, kinesin 3 राज्यों के बीच वैकल्पिक मोटर्स:

(1) एक microtubule एकल बाध्य राज्य: यह तब होता है जब एक kinesin पहले एक microtubule को बांधता है । यह (2) राज्य के साथ संतुलन में मौजूद है ।

(2) एक डबल-बाउंड राज्य: इस मामले में, एक microtubule एकल बंधे kinesin भी अपनी-टैग के माध्यम से सतह को बांधता है । इस दोहरे बाध्य राज्य microtubule लैबोरेटरी के लिए अनुमति देता है ।

(3) एक एकल सतह से बंधे राज्य: एक डबल-बाउंड kinesin कि microtubule के अंत तक चला गया है और सतह से अभी तक desorbed नहीं है इस राज्य में है । इन मोटर्स चित्रा 1 में देखा जा सकता है (संयुक्त और हरे चैनल): वे कई micrometers के लिए microtubule की पूंछ के पीछे का विस्तार और अपनी कम निशान फार्म ।

इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम स्लाइड पर hydrophobic सतह का गठन है । न केवल यह खतरनाक रसायनों का उपयोग करता है, लेकिन यह भी खूंटी-PPG-ंत् समूह के साथ कार्यात्मक खूंटी की अनुमति देता है कोट करने के लिए सतह, जो तो kinesin सतह के लिए reversibly बांध करने के लिए अनुमति देता है । एक अंय महत्वपूर्ण कदम तेल के साथ प्रवाह सेल सील है । यह लंबे समय तक इमेजिंग के लिए प्रवाह सेल वाष्पीकरण में तरल बिना अनुमति देता है ।

इस तकनीक में प्राथमिक संशोधनों microtubule एकाग्रता, kinesin एकाग्रता, और एटीपी एकाग्रता बदलने से मिलकर बनता है । microtubule एकाग्रता बदलने से सतह पर ग्लाइडिंग microtubules की संख्या में बदलाव आएगा. kinesin एकाग्रता बदलने से kinesin अणुओं की संख्या में बदलाव आएगा जो microtubule को बाँध सकता है. हालांकि, इस प्रयोग में पहले से ही परिभाषित मात्रा के ऊपर kinesin एकाग्रता बढ़ाने से बैकग्राउंड प्रतिदीप्ति बढ़ सकता है, जिससे ग्लाइडिंग microtubules पीछे छोड़े गए kinesin ट्रेल्स को देखना ज्यादा मुश्किल होता है । इस बीच, 10 µ मीटर नीचे एटीपी सांद्रता कम काफी microtubule ग्लाइडिंग वेग कम हो जाएगा । यदि यह प्रभाव वांछित है, यह creatine फॉस्फेट और phosphokinase से मिलकर एक एटीपी पुनर्सृजन प्रणाली का उपयोग करने के लिए आवश्यक है ।

इस तकनीक की एक संभावित सीमा है कि, प्रणाली के बड़े सक्रिय kinesin सामग्री के कारण, एटीपी तेजी से भस्म किया जा सकता है, और प्रयोगों कुछ शर्तों में एक घंटे से भी कम पिछले हो सकता है. यह उदाहरण के लिए मामला होगा अगर एक एक दोहरा उच्च kinesin एकाग्रता और पांच क्या इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत किया है से उच्च microtubule एकाग्रता गुना इस्तेमाल किया ।

हमारे पिछले काम18में, हम microtubules साथ kinesin मोटर्स के स्थानिक वितरण का अध्ययन किया, साबित करना है कि ग्लाइडिंग microtubules समाधान से kinesin मोटर्स जमा, की लंबाई के साथ मोटर्स के घनत्व की वृद्धि में जिसके परिणामस्वरूप microtubule । हमने यह भी पाया कि ' microtubules ग्लाइडिंग स्थिरता समाधान kinesin एकाग्रता और microtubule वेग पर एक रैखिक निर्भरता का प्रदर्शन किया ।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल नेनो इंजीनियर सिस्टम में प्रोटीन मोटर्स के एक अधिक कुशल उपयोग के लिए रास्ता प्रशस्त करता है और सक्रिय nanosystems के डिजाइन में आगे की जांच के लिए है कि गतिशील संतुलन में हैं । इसके अलावा, इस प्रणाली के गतिशील प्रकृति यह आत्म चिकित्सा और आणविक घटकों के गतिशील प्रतिस्थापन, इंजीनियर और प्राकृतिक संरचनाओं के बीच की खाई का हिस्सा बंद का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में सेवा करने की अनुमति देता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक कृतज्ञता NSF अनुदान NSF-DMR १८०७५१४ के तहत वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं । लेखकों ने GFP-kinesin प्रोटीन प्रदान करने के लिए जी Bachand और वी. Vandelinder का धन्यवाद किया । यह काम किया गया था, भाग में, एकीकृत Nanotechnologies के लिए केंद्र में, विज्ञान उपयोगकर्ता ऊर्जा विभाग के लिए संचालित सुविधा का एक कार्यालय (डो) लॉस एलामोस राष्ट्रीय प्रयोगशाला द्वारा विज्ञान के कार्यालय (अनुबंध सं. de-AC52-06NA25396) और Sandia राष्ट्रीय प्रयोगशालाओं (कांग्रेस-पथ no. ९७ de-AC04-94AL85000) । लेखक Dr. जेनिफर Neff और AllVivo संवहनी खूंटी-PPG-ंत् के साथ कार्यात्मक खूंटी के अपने उपहार के लिए धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
488 nm laser Omicron Laserage LuxX 488-150
642 nm laser Omicron Laserage LuxX 642
Casein Sigma C7078-500G
Catalase from bovine liver Sigma C40-500MG
Creatine Phosphate Sigma P-7936
Creatine Phosphokinase Sigma C3755-500UN
D-Glucose Sigma G2133-50KU
Dichlorodimethylsilane solution Sigma 40140-25ML Toxic
Dimethyl Sulfoxide Sigma 34869-100ML
Dithiothreitol Sigma D0632-5G Toxic
Eclipse TI Nikon Instruments
eGFP rkin430 Provided by George Bachand
EGTA Sigma E4378-25G
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-49A
Glucose Oxidase Sigma G0543-10KU
Guanosine Triphosphate Sigma G8877-10MG
Kimwipes Delicate Task Wipers Sigma Pharmaceuticals 8089
Magnesium Chloride Sigma M1028-100ML
Methanol Fisher Chemical A412 Toxic
Milli-Q Water Purification System Millipore Corporation
Nickel Sulfate Sigma 656895-50G
Paclitaxel Sigma T1912-5MG
PIPES Sigma P-6757
Pluronic F108-NTA Provided by Jennifer Neff and AllVivo Vascular PEG-PPG-PEG-NTA
Pluronic F-108 Sigma 542342-250G PEG-PPG-PEG
Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 21-403-190
Toluene Fisher Chemical T324 Toxic
Tubulin, HiLyte647-labeled Cytoskeleton, Inc. TL670M
UV Ozone Procleaner BioForce Nanosciences PC440
Whatman Puradisc syringe filters Sigma WHA67840402
Zyla 4.2 sCMOS Camera Andor Technology sCMOS 4.2

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References

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