Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Montering molekylære pendulfart drevet af reversibelt vedhæftet Kinesins

Published: January 26, 2019 doi: 10.3791/59068
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer en protokol for at opbygge molekylære pendulkørsler, hvor overflade-overholdt kinesin motor proteiner fremdrive dye-mærket mikrotubuli. Svage interaktioner i kinesins med overfladen giver deres reversible tilknytning til det. Dette skaber en nanoskala system, der udstiller dynamisk samling og demontering af dens komponenter samtidig bevare dens funktionalitet.

Abstract

Denne protokol beskriver, hvordan du opretter kinesin-drevne molekylære pendulfart med en svag og reversible udlæg i kinesins overflade. I modsætning til tidligere protokoller i dette system, mikrotubuli rekruttere kinesin motor proteiner fra løsningen og placere dem på en overflade. Kinesins vil til gengæld lette gliding af mikrotubuli langs overfladen før desorbing tilbage i bulk løsning, således at være til rådighed til at blive ansat igen. Denne kontinuerlige montering og demontering fører til slående dynamiske opførsel i systemet, såsom dannelsen af midlertidige kinesin stier af svæveflyvning mikrotubuli.

Flere eksperimentelle metoder vil blive beskrevet i hele dette eksperiment: UV-Vis spektrofotometri vil blive brugt til at bestemme koncentrationen af stamopløsninger af reagenser, coverslips vil først blive ozon og ultraviolet (UV) behandlet og derefter TOT silaniseret før monteres i flow celler og total interne reflection fluorescens bruges (JOHANNAS) mikroskopi til samtidigt billede kinesin motors og mikrotubulus filamenter.

Introduction

De interaktioner, der regulerer funktionen af aktive nanosystemer har altid været præget af langlivet, næsten uoprettelige obligationer1,2,3,4,5,6 ,7,8. En velundersøgte eksempel på dette er mikrotubulus-kinesin system, hvor gliding mikrotubuli er fremdrives ved uigenkaldeligt overflade-bundet kinesin motorer1,2,3,4, 5. Systemer, hvori komponenterne er reversibelt forbundet til hinanden har været undersøgt teoretisk9,10 og gennemføres på overordnet11,12, men skalering disse systemer ned til den nanoskala har været udfordrende. En af de vigtigste grunde til dette er at bryde og reformere obligationer mellem komponenter ofte kræver store ændringer i de miljømæssige forhold. Selvom sådanne ændringer er blevet gennemført i de sidste13,14,15, ville de afhængige ændre selve systemet i stedet for at tilpasse den til sine omgivelser. Designe Molekylær-skala systemer hvor komponenter løbende samle og omorganisere i strukturer uden at forstyrre det generelle miljø, hvori forsøgene finder sted vil åbne døren til udforskningen af en bred vifte af dynamisk adfærd 16 , 17.

Her, vi beskriver og viser detaljerede protokollen for at oprette en dynamisk samling og adskillelse system fungerer på nanoskalaen. Systemet og dets generelle opførsel er blevet indført tidligere18: mikrotubulus filamenter er fremdrives ved spor af reversibelt overflade-bundet kinesin-1 motorer. Disse kinesin motor proteiner er rekrutteret fra løsning til at hjælpe fremdrive mikrotubuli frem, før desorbing igen kort tid bagefter. Når tilbage i løsning, kan de ansættes igen til at fremdrive en ny mikrotubulus. I de sidste13,14,,kræves15, breaking og reform af obligationer miljømæssige ændringer; Derimod forbliver miljø for vores flow celle uændret, mens kinesin motors interagere med overfladen.

Denne protokol vil hjælpe interesserede forskere til (1) visualisere alle trin i protokollen, og (2) hjælpe med fejlfinding af denne type analyse. Det er afledt af de procedurer, der er beskrevet i Howard et al. 199319.

Protocol

1. løsning forberedelse

Forsigtig: Tre af de reagenser, der anvendes i denne protokol (toluen, dimethyldichlorsilan og dithiothreitol) er meget giftige. Skal du kontakte de relevante materiale sikkerhedsdatablade (MSDS) før brug. Dele af denne protokol skal desuden udføres under et højere beskyttelsesniveau, bære sikkerhedsbriller og to sæt af beskyttende handsker som angivet. Medmindre andet tilrådes, kan forsøgene udføres på laboratoriet bænke mens du bruger alle de passende personlige værnemidler (sikkerhedsbriller, handsker, laboratoriekittel, fuld længde bukser og lukket tå sko).

Bemærk: Koncentrationen af ATP, kinesin og mikrotubuli, der bruges i denne protokol kan blive ændret givet behov for hvert forsøg. Men hvis ændret, skal du sikre at de endelige koncentrationer af andre reagenser forbliver det samme som givet nedenfor. Alle eksperimenter blev udført ved stuetemperatur, (~ 25 ° C).

  1. Forberedelse af stamopløsninger
    Bemærk: Forberede og alikvot følgende løsninger på forhånd. Alle delprøver kan tilberedes ved stuetemperatur (~ 25 ° C).
    1. BRB80 buffer
      Bemærk: Buffer for de fleste af de løsninger, der anvendes i denne protokol er BRB80. BRB80 kan tilberedes i store mængder og opbevares i en-20 ° C fryser.
      1. Opløse 24,2 g piperazin-Nielsen, N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (rør) og 3,1 g kaliumhydroxid (KOH) i 800 mL deioniseret vand at gøre 800 mL 100 mM rør. Tilsættes 100 mL 10 mM magnesiumchlorid (MgCl2) og 100 mL 10 mM ethylenglycol tetraacetic syre (EGTA) for at få en endelige mængden af 1 L. avl til pH 8 med kaliumhydroxid (KOH) kan hjælpe i opløsningen af rør og EGTA.
        NOTE: De endelige koncentrationer af kemikalier i BRB80 buffer er 80 mM rør, 1 mM MgCl2og 1 mM EGTA.
      2. Justere pH buffer til 6,9 ved hjælp af KOH og saltsyre (HCl).
    2. ATP
      1. Forberede en 1 mL opløsning af 100 mM ATP i ultrarent vand. Med pipette overfoeres løsning i 10 μL delprøver. Gemme delprøver i et-80 ° C fryser.
    3. GTP
      1. Forberede en 500 μl opløsning af 25 mM GTP i ultrarent vand. Med pipette overfoeres løsning til 5 μl delprøver. Gemme delprøver i et-80 ° C fryser.
    4. MgCl2
      1. Forberede en 1 mL opløsning af 100 mM MgCl2 i ultrarent vand. Med pipette overfoeres løsning i 10 μL delprøver. Gemme delprøver i en-20 ° C fryser.
    5. Kasein
      1. Der afvejes 1 g tørre kasein og overføre det til en 50 mL konisk centrifugeglas. Tilføje 35 mL af BRB80 buffer til glasset til kasein pulveret opløses.
      2. Sted løsning i en tørretumbler i et koldt rum til at opløse natten over. På dette tidspunkt, vil løsningen ser tyk og tyktflydende.
      3. Forlade røret oprejst i 4 ° C køleskab til at tillade nogen store uopløst klumper at bilægge. Overføre supernatanten til en ny tube.
      4. Dreje røret i en centrifuge på 1.000 x g at sammenpresse ud mere bundfald. Igen, overføre supernatanten til en ny tube.
      5. Gentagne gange filtrere løsning med 0,2 μm (7 bar maksimalt pres) filtre. Løsningen bliver tyk, mange filtre vil få tilstoppet, så Gentag dette trin, indtil filtret er klar og unclogged.
      6. Bestemme koncentrationen af kasein i den resulterende løsning ved hjælp af UV/Vis spektrofotometri, ved hjælp af kaseins extinction koefficient af 19 mM-1∙cm-1 på 280 nm20. Antager en molekylevægt af 23 kDa for kasein, fortyndes løsning til en koncentration af 20 mg∙mL-1 i BRB80.
      7. Med pipette overfoeres løsning til 20 μL delprøver og gemme delprøver i en-20 ° C fryser.
    6. D-glukose
      1. Forberede en 1 mL opløsning af 2 M D-glucose i ultrarent vand. Med pipette overfoeres løsning i 10 μL delprøver. Gemme delprøver i en-20 ° C fryser.
    7. Glucose stavbakterier
      1. Forberede en 1 mL opløsning af 20 mg∙mL-1 glucose stavbakterier i BRB80. Med pipette overfoeres løsning i 10 μL delprøver. Gemme delprøver i en-20 ° C fryser.
    8. Katalase
      1. Forberede en 1 mL opløsning af 0,8 mg∙mL-1 katalase i BRB80. Med pipette overfoeres løsning i 10 μL delprøver. Gemme delprøver i en-20 ° C fryser.
    9. Dithiothreitol (DTT)
      Bemærk: Da DTT er lidt flygtige og giftige, skal du udføre følgende trin under et stinkskab.
      1. Forberede en 1 mL opløsning af 1 M DTT fortyndet i ultrarent vand. Med pipette overfoeres løsning i 10 μL delprøver. Gemme delprøver i en-20 ° C fryser.
    10. Paclitaxel
      1. Forberede en 1 mL opløsning af 1 mM paclitaxel fortyndet i DMSO. Med pipette overfoeres løsning i 10 μL delprøver. Gemme delprøver i en-20 ° C fryser.
    11. Dimethylsulfoxid (DMSO)
      Bemærk: DMSO disse forsøgsdyr er ren.
      1. Afpipetteres 1 mL ren DMSO i 10 μL delprøver. Gemme delprøver i en-20 ° C fryser.
    12. Kreatin phosphat
      1. Forberede en 1 mL oploesning af 0,2 M kreatin fosfat i ultrarent vand. Med pipette overfoeres løsning i 10 μL delprøver. Gemme delprøver i en-20 ° C fryser.
    13. Kreatin phosphokinase
      1. Forberede en 1 mL opløsning af 200 units· L-1 kreatin phosphokinase i ultrarent vand. Med pipette overfoeres løsning i 10 μL delprøver. Gemme delprøver i en-20 ° C fryser.
    14. Nikkel (II) sulfat
      1. Forberede 500 mL af en oploesning af 50 mM nikkel (II) sulfat i ultrarent vand. Gemme løsning ved stuetemperatur (~ 25 ° C).
    15. Poly(ethylene glycol)-blok-poly(propylene glycol)-blok-poly(ethylene glycol) (PIND-PPG-PLØK) løsning
      1. Afvejes 2 mg af PEG-PPG-PEG (nummer gennemsnitlig molekylevægt: 14,600 g∙mol-1)-NTA pulver på vejer papir. PIND-PPG-PIND-NTA er triblock copolymer functionalized med en nitrilotrieddikesyre syre (NTA) gruppe. Henvises til Tabel af materialer for flere detaljer om PIND-PPG-PIND-NTA.
      2. Overføre pulveret i en 1,5 mL microcentrifuge rør. Der tilsættes 1 mL af stamopløsningen nikkel (II) sulfat til røret. Vortex indtil pulveret er opløst og ingen synlige klumper forblive.
      3. Butik i op til én måned ved stuetemperatur.
  2. Før du starter et eksperiment
    1. Fyld en spand med is.
    2. Tage en prøve fra hver af de 13 reagenser beskrevet i punkt 1.1.1 til 1.1.13 ovenfor og tilføje dem til spanden, således at holde dem på is. Tø hver af reagenser før brug.
  3. Mikrotubulus forberedelse
    Bemærk: Mikrotubuli var polymeriserede fra en 20 μg alikvot af dye-mærket frysetørrede tubulin. Excitation bølgelængden af farvestoffet er af 647 nm.
    1. Forberedelse af mikrotubulus vækst buffer
      1. Med pipette overfoeres 21,8 μL BRB80 buffer ind i en lille (0,6 mL) microcentrifuge tube. Tilføj 1 μL MgCl2 stamopløsning, 1 μL af GTP stamopløsningen og 1,2 μL af DMSO stamopløsningen.
        Bemærk: Således de endelige koncentrationer af reagenser i BRB80 buffer er 4 mM MgCl2, 1 mM GTP og 5% (v/v) dimethylsulfoxid.
    2. Mikrotubulus polymerisering
      1. Tilføje 6,25 μL mikrotubulus vækst buffer direkte ind i en 20 μg alikvot af mærket frysetørrede tubulin. Vortex alikvot for 5 s til 30 rps.
      2. Cool alikvot i isbad i 5 min før inkubation ved 37 ° C i 45 min og fortsætte til afsnit 1.3.3.
    3. Mikrotubulus stabilisering
      1. Tilsættes 5 μl af opløsningen aliquoted paclitaxel 490 μL BRB80 buffer. Vortex løsning for 10 s på 30 rps.
      2. Når 45 min inkubation for mikrotubuli er op, tilsættes 5 μl polymeriseret mikrotubulus løsningens BRB80/paclitaxel løsning.
        Bemærk: Denne 100-fold fortyndet, stabiliseret, mikrotubulus løsning vil blive benævnt MT100. Det kan bruges i op til 5 dage, og det kan fortyndes for at opnå den ønskede mikrotubulus tæthed for hvert forsøg.
  4. Motilitet løsning
    1. Enzymatisk antifade, ATP regenererende system og ATP
      1. Tilføje 9.0 μL aliquoted kasein løsning til 291 μL BRB80 buffer.
      2. Hvis den ønskede ATP koncentrationen for eksperimentet er lavere end 1 mM, afpipetteres 83 μL af BRB80/kasein løsningen ind i en ny 0,6 mL microcentrifuge rør. Ellers, afpipetteres 85 μL af denne løsning i en ny 0,6 mL microcentrifuge rør.
      3. Tilføje 1 μL af D-glucose, 1 μL af glucose stavbakterier, 1 μL af katalase og 1 μL af DTT til at tube.
        Bemærk: Disse kemikalier udgør en enzymatisk antifade cocktail21 , der vil reducere photobleaching ved at fjerne opløst ilt og dæmper reaktive radikaler. Dette reducerer photobleaching og mikrotubulus nedbrydning forårsaget af excitation belysning under fluorescens imaging22,23.
      4. For eksperimenter, hvor ATP koncentrationen er valgt til at være betydeligt lavere end 1 mM, Tilføj de følgende reagenser til opklaring hen til skabe en ATP-regenererende system: 1 μL aliquoted kreatin fosfat løsning og 1 μL aliquoted kreatin phosphokinase løsning.
      5. Tilføje 1 μL af stamopløsningen ATP til motilitet løsning. Svirp eller vortex alikvot homogen måde distribuere kemikalier.
        NOTE: Den endelige koncentration af kemikalier i løsningen er således 10 μM paclitaxel, 0,5 mg·mL1 kasein, 20 mM D-glucose, 200 μg·mL1 glucose stavbakterier, 8 μg·mL1 katalase, 10 mM dithiothreitol, 2 mM kreatin phosphat (hvis tilføjet), 2 Units· L1 kreatin phosphokinase (hvis tilføjet), og 1 mM ATP. Denne løsning vil herefter blive omtalt som motilitet løsning.
    2. Kinesin
      Bemærk: Stock kinesin løsningen anvendes i disse eksperimenter er udarbejdet af G. Bachand på Center for integreret nanoteknologi på Sandia National Laboratories og stillet til rådighed under en brugeraftale (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php). den buffer, der bruges her består af 40 mM imidazol, 300 mM NaCl, 0,76 g· L-1 EGTA, 37,2 mg· L-1 EDTA, 50 g· L-1 saccharose, 0,2 mM TCEP og 50 μM Mg-ATP. Til denne serie af eksperimenter, blev rkin430eGFP kinesin konstruktion brugt. Dette er en kinesin bestående af de første 430 aminosyrer i rotte kinesin tunge kæde sammenvokset til eGFP og en C-terminale hans-tag på halen domæne24. Det blev udtrykt i Escherichia coli og renset ved hjælp af en Ni−NTA kolonne. Koncentrationen af stamopløsningen normal god landbrugspraksis-kinesin var 1,8 ± 0,3 μM, bestemt af UV/Vis spektrofotometri, ved hjælp af en udslettelse koefficient for normal god landbrugspraksis i 55 mM-1·cm-1 på 489 nm25, og under hensyntagen til at kinesin er en dimer.
      1. Bestemme den ønskede kinesin koncentration eller overflade tæthed for eksperimentet. For typiske assays, denne koncentration er 20 nM. Hvis kinesin koncentration skal fortyndes mere end en hundredfold, fortynde det i en opløsning af BRB80, der indeholder 0,5 mg·mL-1 af kasein.
      2. Tilføje 1 µL af kinesin løsning til motilitet løsning for at få en endelig koncentration på omkring 20 nM.
    3. Mikrotubuli
      1. Tilsættes 10 μL MT100 løsning parat i afsnit 1.3 motilitet løsning.
        Bemærk: Denne motilitet løsning kan bruges i op til 3 timer. Efter tid mister det antifade system sin effektivitet fordi glukose i løsningen er forarmet af enzymatisk reaktion.

2. montering flow celler

  1. Vask af coverslips
    1. For flow celler, bruge en stor coverslip (dimension: 60 mm x 25 mm) og en lille en (dimensioner: 22 mm x 22 mm)19.
    2. Skyl alle coverslips to gange med ethanol og to gange med ultrarent vand. Der sonikeres coverslips i ultrarent vand i 5 min. tørre dem i en ovn ved en temperatur på 50-75 ° C.
    3. Ved hjælp af en UV/ozon renere (Se Tabel af materialer og producentens anvisninger), behandle én side af hver coverslip i 15 min. udføre dette trin kan ved stuetemperatur (~ 25 ° C) og i normale atmosfæriske tilstand (tryk på 1 atm).
    4. Slå forsigtigt hver coverslip til den anden side (med pincet) og UV/ozon behandling af denne side.
    5. Der sonikeres coverslips i ultrarent vand igen for 5 min før tørring dem igen i ovnen ved en temperatur på 50-75 ° C.
  2. Behandling af coverslips for at aktivere PIND-PPG-PIND belægning
    Bemærk: Dimethyldichlorsilan og toluen anvendes i denne del af protokollen er meget giftigt, skal du udføre følgende trin under et stinkskab, samtidig med at tage følgende forholdsregler: bære to sæt af beskyttende handsker og en langærmet skjorte under deres lab frakke. Tuck kanterne af handsker inde ærmerne af skjorten, således at ingen hud fra underarmene er direkte udsat for kemikalier i tilfælde af et spild. Bære beskyttelsesbriller.
    1. Fortyndet 25 mL ren dimethyldichlorsilan i 475 mL toluen. Fordyb hver coverslip i opløsningen dimethyldichlorsilan og toluen i 15 sekunder.
    2. Vask af coverslips, to gange i toluen og tre gange i methanol. Tørre coverslips ved hjælp af tryk kvælstof.
  3. Samle coverslips til flow celler
    1. Når coverslips er tørre, skåret en 2 cm x 2,5 cm stykke dobbeltsidet tape vertikalt i to 1 cm x 2,5 cm striber.
    2. Sætte det store coverslip på en delikat opgave visker og stick tape striber på langs kanten af coverslip til at oprette et 1 cm x 2,5 cm område mellem stykker tape.
    3. Holde den lille coverslip på toppen af tape striber til slut flow celle forsamling.

3. flyder løsningerne i en flow-celle

  1. Flyde omkring 20 μL PIND-PPG-PIND løsning i cellen samlet flow. Den diskenhed, der er fløjet i cellen må være stor nok til at fylde salen. I de næste skridt, bruge den samme volumen når udveksling af løsninger.
  2. Mulighed for PIND-PPG-PIND løsning til at absorbere på overfladen i 5 minutter. Udveksle PIND-PPG-PIND løsningen med BRB80 buffer 3 gange af flydende buffer i. Flow motilitet løsningen ind i flow-cellen.
  3. Forsegle kanterne af cellen flow med fedt at forhindre fordampning, hvis den planlagte eksperiment er længere end en time.
    Bemærk: Cellen flow er nu klar til afbildning.

4. imaging en flow-celle

  1. Udføre imaging ved hjælp af et mål-type total interne reflection fluorescens (JOHANNAS) setup for både mikrotubuli og kinesin motorer (Se Tabel af materialer).
    Bemærk: Her, vi brugte et mikroskop med en 100 x / 1,49 numerisk blænde mål linse, ved hjælp af to lasere, én med en bølgelængde på 642 nm og en maksimal effekt på 140 mW, og en anden med bølgelængde på 488 nm og en maksimal effekt på 150 mW.
  2. Anbring en dråbe immersionsolie på målet.
  3. Placere cellen flow på mikroskop-platformen og bringe målsætningen, indtil der er kontakt mellem olien på målet og flow-cellen.
  4. Bruge den mikroskop interlock cover system til at blokere alle laserlys i at flygte.
  5. Tænd laseren og fokusere på den nedre overflade af cellen flow. Mikrotubuli er fluorescently mærket og ophidset ved en bølgelængde på 647 nm. De vil være afbildet med en 642 nm laser, mens en 488 nm laser bruges til normal god landbrugspraksis-kinesin motorer.
  6. Optage billeder eller videoer af interesse. Laser power er typisk omkring 30 mW og en eksponeringstid på 50 ms for både laser kanaler. Billeder kan registreres, så længe der er motilitet i cellen flow.
    Bemærk: Laser belysningsstyrke er skadeligt for det blotte øje og kan forårsage uoprettelig skade. Sørg for at det belyste område er helt dækket med en uigennemsigtig låg.

Representative Results

I disse eksperimenter, vi brugte en 1,000 gange fortynding af mikrotubuli forberedt i punkt 1.3.2. Kinesin koncentration var 20 nM, og ATP koncentrationen var 1 mM. Imaging blev udført ved hjælp af JOHANNAS mikroskopi. Svæveflyvning mikrotubuli var særskilt afbildet fra kinesin motorer: mikrotubuli blev synlig ved excitation med en 647 nm laser (figur 1, red), og normal god landbrugspraksis-kinesin var synlig, når ophidset med en 488 nm laser (figur 1, grøn). Tiden mellem magnetisering med det røde og grønne lys var mindre end 1 s. Tiden mellem rammer var 10 s. mikrotubuli vises stabil svæveflyvning. Den gennemsnitlige mikrotubulus svæveflyvning hastighed var omkring 800 nm/s. Mikrotubulus overflade tætheden var 400 mm-2. Spor af kinesin (grøn) syntes at overskride den efterstillede slutningen af mikrotubuli (rød) til flere mikrometer.

Figure 1
Figur 1: svæveflyvning mikrotubuli fremdrives ved svagt overflade-bundet kinesin motors. Som mikrotubuli bevæger os fremad, ophobes de kinesin motorer fra løsning. Disse motorer veksler mellem to stater: single-bundet til en mikrotubulus, og dobbelt-bundet til både mikrotubulus og overfladen. Når en dobbelt bundet motor når enden af en mikrotubulus, motoren er efterladt og desorbs langsomt fra overfladen med en off på ca 0,1 s-1. Som et resultat, forbliver stier af kinesin motors bag mikrotubuli. Øverste række: rød (mikrotubulus) kanal. Mellemste række: grøn (kinesin) kanal. Nederste række: kombineret rød (mikrotubulus) og grønne (normal god landbrugspraksis-kinesin) kanal. Skalalinjen: 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

I dette arbejde præsenterer vi en aktiv nanoskala system som self samler svagt-bindende byggesten for at konstruere sit eget spor. Som vist i figur 1, svæveflyvning mikrotubuli akkumulere kinesin motorer fra løsning og deponere dem på overfladen. Kinesin motors forbliver i kølvandet på mikrotubulus for en kort periode før han vendte tilbage til løsning. Således i dette eksperiment motorer kinesin alternativ mellem 3 stater:

(1) en mikrotubulus single-bundet tilstand: Dette er, når en kinesin først bindes til en mikrotubulus. Den findes i ligevægt med staten (2).

(2) en dobbelt-bundet tilstand: i dette tilfælde en mikrotubulus single-bundet kinesin også binder sig til den overflade via sin hans-tag. Denne dobbelt-bundet tilstand giver til mikrotubulus fremdrift.

(3) en enkelt overflade-bundet tilstand: et dobbelt-bundet kinesin, der har gået ud i slutningen af en mikrotubulus og har ikke endnu desorberet fra overfladen er i denne tilstand. Disse motorer kan ses i figur 1 (kombineret og grønne kanaler): de udvide bag halen af mikrotubulus for flere mikrometer og danne sin faldende trail.

Det mest afgørende skridt i denne protokol er dannelsen af den hydrofobe overflade på diaset. Ikke kun bruger den farlige kemikalier, men det giver også mulighed for PIND-PPG-PIND functionalized med gruppen NTA til pels overfladen, som derefter tillader kinesin reversibelt bindes til overfladen. Et andet vigtigt skridt forsegling cellen flow med fedt. Dette giver mulighed for forlænget tænkelig uden væske i flow celle fordamper.

De primære ændringer til denne teknik består af skiftende mikrotubulus koncentration, kinesin koncentration og ATP koncentrationen. Ændre mikrotubulus koncentration vil ændre antallet af mikrotubuli glider på overfladen. Ændring af kinesin koncentration vil ændre antallet af kinesin molekyler, der kan bindes til en mikrotubulus. Men øget kinesin koncentration over de beløb, der allerede er defineret i dette eksperiment kan øge baggrund fluorescens, hvilket gør det sværere at se de kinesin stier efterladt svæveflyvning mikrotubuli. I mellemtiden vil sænke ATP koncentrationer under 10 µM signifikant fald mikrotubulus svæveflyvning hastighed. Hvis denne effekt ønskes, er det nødvendigt at udnytte en ATP regenererende system bestående af kreatin fosfatase og phosphokinase.

En eventuel begrænsning af denne teknik er, at på grund af det store aktive kinesin indholdet af systemet, ATP kan hurtigt forbruges, og eksperimenter kan vare mindre end en time i visse betingelser. Dette ville for eksempel være tilfældet, hvis en brugt en dobbelt højere kinesin koncentration og fem gange højere mikrotubulus koncentration end hvad er præsenteret i denne protokol.

I vores tidligere arbejde18, vi studerede den geografiske fordeling af kinesin motors langs mikrotubuli, bevise at svæveflyvning mikrotubuli akkumulerer kinesin motorer fra løsning, som medfører en forøgelse af tætheden af motors langs længden af den mikrotubulus. Vi fandt også, at mikrotubuli gliding stabilitet viste en ikke-lineær afhængighed af løsning kinesin koncentration og mikrotubulus hastighed.

Præsenteres protokollen baner vejen for en mere effektiv udnyttelse af protein motorer i nanoskala manipuleret systemer og til yderligere undersøgelse i udformningen af aktive nanosystemer, som er i dynamisk ligevægt. Desuden, den dynamiske karakter af dette system gør det muligt at tjene som en model til at studere selvhelende og dynamisk udskiftning af molekylære komponenter, lukke en del af kløften mellem konstruerede og naturlige strukturer.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne parlamentsarbejdet finansiel støtte under NSF grant NSF-DMR 1807514. Forfatterne takke G. Bachand og V. Vandelinder for at give normal god landbrugspraksis-kinesin protein. Dette arbejde var udført, delvist på Center for integreret nanoteknologi, en Office of Science bruger Facility drives for os afdeling af Energy (DOE) Office of Science ved Los Alamos National Laboratory (kontrakt nr. DE-AC52-06NA25396) og Sandia National Laboratories (con-tarmkanalen nr. 97 DE-AC04-94AL85000). Forfatterne takke Dr. Jennifer Neff og AllVivo kardiovaskulære for deres gave på PIND-PPG-PIND functionalized med NTA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
488 nm laser Omicron Laserage LuxX 488-150
642 nm laser Omicron Laserage LuxX 642
Casein Sigma C7078-500G
Catalase from bovine liver Sigma C40-500MG
Creatine Phosphate Sigma P-7936
Creatine Phosphokinase Sigma C3755-500UN
D-Glucose Sigma G2133-50KU
Dichlorodimethylsilane solution Sigma 40140-25ML Toxic
Dimethyl Sulfoxide Sigma 34869-100ML
Dithiothreitol Sigma D0632-5G Toxic
Eclipse TI Nikon Instruments
eGFP rkin430 Provided by George Bachand
EGTA Sigma E4378-25G
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-49A
Glucose Oxidase Sigma G0543-10KU
Guanosine Triphosphate Sigma G8877-10MG
Kimwipes Delicate Task Wipers Sigma Pharmaceuticals 8089
Magnesium Chloride Sigma M1028-100ML
Methanol Fisher Chemical A412 Toxic
Milli-Q Water Purification System Millipore Corporation
Nickel Sulfate Sigma 656895-50G
Paclitaxel Sigma T1912-5MG
PIPES Sigma P-6757
Pluronic F108-NTA Provided by Jennifer Neff and AllVivo Vascular PEG-PPG-PEG-NTA
Pluronic F-108 Sigma 542342-250G PEG-PPG-PEG
Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 21-403-190
Toluene Fisher Chemical T324 Toxic
Tubulin, HiLyte647-labeled Cytoskeleton, Inc. TL670M
UV Ozone Procleaner BioForce Nanosciences PC440
Whatman Puradisc syringe filters Sigma WHA67840402
Zyla 4.2 sCMOS Camera Andor Technology sCMOS 4.2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vale, R. D., Reese, T. S., Sheetz, M. P. Identification of a Novel Force-Generating Protein, Kinesin, Involved in Microtubule-Based Motility. Cell. 42, 39-50 (1985).
  2. Ray, S., Meyhofer, E., Milligan, R. A., Howard, J. Kinesin Follows the Microtubule's Protofilament Axis. Journal of Cell Biology. 121, 1083-1093 (1993).
  3. Dennis, J. R., Howard, J., Vogel, V. Molecular shuttles: directed motion of microtubules along nanoscale kinesin tracks. Nanotechnology. 10, 232-236 (1999).
  4. Kawamura, R., Kakugo, A., Osada, Y., Gong, J. P. Microtubule bundle formation driven by ATP: the effect of concentrations of kinesin, streptavidin and microtubules. Nanotechnology. 21, 145603 (2010).
  5. Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in Insect Cells Improves Microtubule in Vitro Gliding Performance, Long-Term Stability and Guiding Efficiency in Nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15, 62-69 (2016).
  6. Whitesides, G. M., Grzybowski, B. Self-assembly at all scales. Science. 295, 2418-2421 (2002).
  7. Ringler, P., Schulz, G. E. Self-assembly of proteins into designed networks. Science. 302, 106-109 (2003).
  8. Boncheva, M., et al. Magnetic self-assembly of three-dimensional surfaces from planar sheets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 3924-3929 (2005).
  9. England, J. L. Dissipative adaptation in driven self-assembly. Nature Nanotechnology. 10, 919 (2015).
  10. Fialkowski, M., et al. Principles and Implementations of Dissipative (Dynamic) Self-Assembly. The Journal of Physical Chemistry B. 110, 2482-2496 (2006).
  11. Boncheva, M., Whitesides, G. M. Self-healing systems having a design stimulated by the vertebrate spine. Angewandte Chemie-International Edition. 42, 2644-2647 (2003).
  12. Rubenstein, M., Cornejo, A., Nagpal, R. Programmable self-assembly in a thousand-robot swarm. Science. 345, 795-799 (2014).
  13. Plaisted, T. A., Vakil Amirkhizi, A., Arbelaez, D., Nemat-Nasser, S. C., Nemat-Nasser, S. Self-healing structural composites with electromagnetic functionality. Proceedings of the Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. 5054, 372-381 (2003).
  14. Ghosh, S. K. Self-Healing Materials. Ghosh, S. K. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim. 1-28 (2009).
  15. Burnworth, M., et al. Optically healable supramolecular polymers. Nature. 472, (2011).
  16. Bachand, G. D., Spoerke, E. D., Stevens, M. J. Microtubule-Based Nanomaterials: Exploiting Nature's Dynamic Biopolymers. Biotechnology and Bioengineering. 112, 1065-1073 (2015).
  17. Gao, Y. W., Lei, F. M. Small scale effects on the mechanical behaviors of protein microtubules based on the nonlocal elasticity theory. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387, 467-471 (2009).
  18. Lam, A. T. -C., Tsitkov, S., Zhang, Y., Hess, H. Reversibly Bound Kinesin-1 Motor Proteins Propelling Microtubules Demonstrate Dynamic Recruitment of Active Building Blocks. Nano Letters. 18, 1530-1534 (2018).
  19. Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules. Methods in Cell Biology. 39, 137-147 (1993).
  20. Huppertz, T., Fox, P. F., Kelly, A. L. Proteins in Food Processing (Second Edition). Yada, R. Y. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 49-92 (2018).
  21. Wettermark, G., Borglund, E., Brolin, S. E. A regenerating system for studies of phosphoryl transfer from ATP. Analytical Biochemistry. 22, 211-218 (1968).
  22. Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination. Journal of Cell Biology. 107, 1011-1024 (1988).
  23. Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -H., Vogel, V. Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices. Nanotechnology. 15, S540-S548 (2004).
  24. Rogers, K. R., et al. KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry. EMBO Journal. 20, 5101-5113 (2001).
  25. Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 73, 2782-2790 (1997).

Tags

Teknik motorer spørgsmålet 143 nanobioteknologi Molekylær pendulkørsler mikrotubuli kinesin vendbar bindende dynamisk samlesæt
Montering molekylære pendulfart drevet af reversibelt vedhæftet Kinesins
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bassir Kazeruni, N. M., Tsitkov, S., … More

Bassir Kazeruni, N. M., Tsitkov, S., Hess, H. Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins. J. Vis. Exp. (143), e59068, doi:10.3791/59068 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter