Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Montering molekylær skyttelbussene drevet av reversibel knyttet Kinesins

Published: January 26, 2019 doi: 10.3791/59068
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University
* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterer en protokoll for å bygge molekylær skyttelbussene, hvor overflaten-overholdt kinesin motoren proteiner drive fargestoff-merket piskehale som henger. Svake interaksjoner av kinesins med overflaten gir sin reversibel tilknytning til den. Dette skaper en nanoskala system som viser dynamisk montering og demontering av komponenter samtidig beholde funksjonaliteten.

Abstract

Denne protokollen beskriver hvordan du oppretter kinesin-drevet molekylær transport med en svak og reversibel vedlegg av kinesins til overflaten. I motsetning til tidligere protokoller, i dette systemet, piskehale som henger rekruttere kinesin motoren proteiner fra løsningen og plassere dem på en overflate. Kinesins vil i sin tur lette gliding de piskehale som henger langs overflaten før desorbing tilbake i bulk løsningen, dermed blir tilgjengelig for å bli rekruttert igjen. Dette kontinuerlig montering og demontering fører til slående dynamiske virkemåten i systemet, som dannelsen av midlertidige kinesin stier av gliding piskehale som henger.

Flere eksperimentelle metoder vil bli beskrevet i dette eksperimentet: UV-Vis spectrophotometry brukes til å bestemme konsentrasjonen av lager løsninger reagenser, coverslips blir først ozon og ultrafiolett (UV) behandlet og deretter silanized før blir montert i flyt celler og total intern refleksjon fluorescens brukes (TIRF) mikroskopi til samtidig image kinesin motorer og microtubule filamenter.

Introduction

Samhandlinger som styrer virkemåten for aktive nanosystems har alltid vært preget av langvarige, nesten uhelbredelig obligasjoner1,2,3,4,5,6 ,7,8. Et godt studert eksempel på dette er microtubule-kinesin system, der gli piskehale som henger er drevet av irreversibelt overflaten-bundet kinesin motorer1,2,3,4, 5. Systemer der komponentene er reversibel koblet til en annen har vært studert teoretisk9,10 og oppnådd ved macroscale11,12, men skalering disse systemene ned til den nanoskala er utfordrende. En av de viktigste grunnene til dette er at bryte og reformere bånd mellom komponenter ofte krever en stor endring i miljøforholdene. Selv om slike endringer er implementert i siste13,14,15, ville de avhengige å endre systemet selv i stedet for å tilpasse den til omgivelsene. Utforme molekylær skala systemer der komponentene kontinuerlig montere og omorganisere i strukturer uten å forstyrre det generelle miljøet der eksperimenter skje vil åpne døren til utforskning av et bredt spekter av dynamisk oppførsel 16 , 17.

Her beskriver vi og vise detaljert protokollen for å opprette en dynamisk montering og demontering systemet fungerer på nanoskala. Systemet og virkemåten generelt har blitt introdusert tidligere18: microtubule filamenter er drevet av spor av reversibel overflaten-bundet kinesin-1 motorer. Disse kinesin motoren proteiner er rekruttert fra løsningen til å drive piskehale som henger, før desorbing igjen kort tid etterpå. Når tilbake i løsningen, kan de bli rekruttert igjen for å drive en ny microtubule. I de siste13,14,kreves15, bryte og reformere obligasjoner miljømessige endringer; derimot forblir miljøet av våre flyt-cellen uendret mens kinesin motorene samhandle med overflaten.

Denne protokollen vil hjelpe interessert forskere (1) visualisere alle trinnene i protokollen, og (2) hjelpe med feilsøking denne typen analysen. Det er avledet fra fremgangsmåtene i Howard et al. 199319.

Protocol

1. løsning forberedelse

FORSIKTIG: Tre av reagensene i denne protokollen (toluen, dimethyldichlorosilane og dithiothreitol) er svært giftig. Se de relevante sikkerhetsdatablader (MSDS) før bruk. Videre må deler av denne protokollen utføres under et høyere nivå av beskyttelse, iført vernebriller og to sett hansker som angitt. Med mindre annet rådet, kan eksperimenter utføres på laboratorium benker mens alle aktuelle personlig beskyttende utstyr (vernebriller, hansker, laboratoriefrakk, full lengde bukser og lukket-toe sko).

Merk: Konsentrasjonen av ATP, kinesin og piskehale som henger som brukes i denne protokollen kan endres gitt behovene til hvert eksperiment. Men hvis endret, kontroller at de endelige konsentrasjonene av andre reagensene forblir den samme som angitt nedenfor. Alle eksperimentene ble utført i romtemperatur, (~ 25 ° C).

  1. Utarbeidelse av lager løsninger
    Merk: Forberede og aliquot følgende løsninger på forhånd. Alle dele kan tilberedes ved romtemperatur (~ 25 ° C).
    1. BRB80 buffer
      Merk: Bufferen for de fleste av løsningene som brukes i denne protokollen er BRB80. BRB80 kan være forberedt i store mengder og lagret i en 20 ° C fryser.
      1. Oppløse 24.2 g piperazin-N, N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (DATAKANALER) og 3.1 g kaliumhydroksid (KOH) i 800 mL i deionisert vann for å lage 800 mL av 100 mM rør. Legge til 100 mL av 10 mM magnesiumklorid (MgCl2) og 100 mL 10 mM etylenglykol tetraacetic syre (EGTA) for å få et endelig antall 1 L. øker pH 8 med kaliumhydroksid (KOH) kan hjelpe i oppløsningen av rør og EGTA.
        Merk: De siste konsentrasjonene av kjemikalier i BRB80 bufferen er 80 mM rør, 1 mM MgCl2og 1 mM EGTA.
      2. Justere pH i bufferen til 6,9 KOH og saltsyre (HCl).
    2. ATP
      1. Forberede en 1 mL løsning av 100 mM ATP i ultrapure vann. Pipetter løsningen i 10 μL dele. Lagre dele i-80 ° C fryser.
    3. GTP
      1. Forberede en 500 μL løsning på 25 mM GTP i ultrapure vann. Pipetter løsningen i 5 μL dele. Lagre dele i-80 ° C fryser.
    4. MgCl2
      1. Forberede en 1 mL løsning av 100 mM MgCl2 i ultrapure vann. Pipetter løsningen i 10 μL dele. Lagre dele i 20 ° C fryser.
    5. Kasein
      1. Veie 1 g tørr kasein og overføre den til en 50 mL konisk sentrifuge rør. Legge til 35 mL BRB80 bufferen røret for å oppløse den kasein pulveret.
      2. Sette løsningen i et vannglass i et kaldt rom å oppløse over natten. På dette punktet, vil løsningen se tykk og tyktflytende.
      3. La røret oppreist i 4 ° C kjøleskap å tillate noen store fra ikke klumper å avgjøre. Overføre nedbryting til en ny tube.
      4. Spinne røret i en sentrifuge 1000 x g til pellets ut mer precipitates. Igjen, overføre nedbryting til en ny tube.
      5. Gjentatte ganger filtrere løsningen med 0,2 μm (7 bar maksimalt trykk) filtre. Løsningen blir tykk, mange filtre komme tett, så Gjenta dette trinnet til filteret er klart og tettes ikke.
      6. Bestemme kasein konsentrasjonen i resulterende løsningen bruker UV/Vis spectrophotometry, bruke kaseins utryddelse koeffisient av 19 mM-1∙cm-1 280 nm20. Forutsatt en molekylvekt av 23 kDa for kasein, fortynne løsningen på en konsentrasjon på 20 mg∙mL-1 i BRB80.
      7. Pipetter løsningen i 20 μL dele og lagre dele i 20 ° C fryser.
    6. D-glukose
      1. Forberede en 1 mL løsning av 2 M D-glukose i ultrapure vann. Pipetter løsningen i 10 μL dele. Lagre dele i 20 ° C fryser.
    7. Gluko
      1. Forberede en 1 mL løsning av 20 mg∙mL-1 -gluko i BRB80. Pipetter løsningen i 10 μL dele. Lagre dele i 20 ° C fryser.
    8. Catalase
      1. Forberede en 1 mL løsning av 0,8 mg∙mL-1 catalase i BRB80. Pipetter løsningen i 10 μL dele. Lagre dele i 20 ° C fryser.
    9. Dithiothreitol (DTT)
      Merk: Siden DTT er litt flyktig og giftige, Utfør følgende under avtrekksvifte.
      1. Forberede en 1 mL løsning av 1 M DTT fortynnet i ultrapure vann. Pipetter løsningen i 10 μL dele. Lagre dele i 20 ° C fryser.
    10. Paklitaxel
      1. Forberede en 1 mL løsning av 1 mM paklitaxel fortynnet i DMSO. Pipetter løsningen i 10 μL dele. Lagre dele i 20 ° C fryser.
    11. Dimethyl sulfoxide (DMSO)
      Merk: DMSO brukes i disse eksperimentene er ren.
      1. Pipetter 1 mL av pure DMSO til 10 μL dele. Lagre dele i 20 ° C fryser.
    12. Kreatin fosfat
      1. Forberede en 1 mL løsning av 0,2 M kreatin fosfat i ultrapure vann. Pipetter løsningen i 10 μL dele. Lagre dele i 20 ° C fryser.
    13. Kreatin phosphokinase
      1. Forberede en 1 mL løsning av 200 units· L-1 kreatin phosphokinase i ultrapure vann. Pipetter løsningen i 10 μL dele. Lagre dele i 20 ° C fryser.
    14. Nikkel (II) sulfate
      1. Forberede 500 mL i en løsning av 50 mM nikkel (II) sulfate i ultrapure vann. Lagre løsningen ved romtemperatur (~ 25 ° C).
    15. Poly(ethylene glycol)-block-poly(propylene glycol)-block-poly(ethylene glycol) (PEG-PPG-PEG) løsning
      1. Veie ut 2 mg av PEG-PPG-pinne (nummer gjennomsnittlig molekylvekt: 14,600 g∙mol-1)-NTA pulver på veier papir. PEG-PPG-PEG-NTA er triblock copolymer functionalized med en nitrilotriacetic syre (NTA) gruppe. Se Tabellen for materiale for mer informasjon om PEG-PPG-PEG-NTA.
      2. Overføre pulver til en 1,5 mL microcentrifuge tube. Legg 1 mL av lager nikkel (II) sulfat løsningen til røret. Forblir Vortex til pulver er oppløst og ingen synlige klumper.
      3. Butikken for opptil én måneds ved romtemperatur.
  2. Før du starter et eksperiment
    1. Fylle en bøtte med is.
    2. Ta en aliquot fra hver av 13 reagensene beskrevet i avsnitt 1.1.1 å 1.1.13 over og legge dem på bøtta, og dermed holde dem på isen. Tine hver av reagensene før bruk.
  3. Microtubule forberedelse
    Merk: Piskehale som henger var polymerized fra en 20 μg aliquot av fargestoff-merket lyofilisert tubulin. Eksitasjon Bølgelengden av fargestoff er 647 nm.
    1. Utarbeidelse av microtubule vekst bufferen
      1. Pipetter 21.8 μL BRB80 buffer i en liten (0,6 mL) microcentrifuge rør. Legg 1 μL MgCl2 lager løsningen, 1 μL GTP lager løsningen og 1.2 μL DMSO lager løsningen.
        Merk: Dermed siste konsentrasjonen av reagensene i BRB80 bufferen er 4 mM MgCl2og 1 mM GTP 5% (v/v) dimethyl sulfoxide.
    2. Microtubule polymerisering
      1. Legg 6,25 μL microtubule vekst bufferen direkte i en 20 μg aliquot av merket lyofilisert tubulin. Vortex aliquot for 5 s på 30 rps.
      2. Cool aliquot på is 5 min før rugende den på 37 ° C i 45 minutter og fortsette til delen 1.3.3.
    3. Microtubule stabilisering
      1. Tilsett 5 μL av aliquoted paklitaxel løsningen 490 μL BRB80 buffer. Vortex løsningen for 10 s på 30 rps.
      2. Når 45 min med inkubering for de piskehale som henger er opp, tilsett 5 μL av polymerized microtubule løsningen til BRB80/paklitaxel løsning.
        Merk: Denne 100-fold utvannet, stabilisert, microtubule løsningen vil heretter bli referert til som MT100. Den kan brukes i opptil 5 dager, og det kan bli utvannet for å få ønsket microtubule tetthet for hvert eksperiment.
  4. Motilitet løsning
    1. Enzymatisk antifade, ATP regenerere system og ATP
      1. Tilsett 9.0 μL av aliquoted kasein løsningen 291 μL BRB80 buffer.
      2. Hvis ønsket ATP konsentrasjonen for eksperimentet er lavere enn 1 mM, Pipetter 83 μL BRB80/kasein løsningen i en ny 0,6 mL microcentrifuge tube. Ellers Pipetter 85 μL løsningen i en ny 0,6 mL microcentrifuge tube.
      3. Tilsett 1 μL av D-glukose, 1 μL gluko, 1 μL catalase og 1 μL DTT at tube.
        Merk: Disse kjemikaliene utgjør en enzymatisk antifade cocktail21 som reduserer photobleaching ved å fjerne oppløst oksygen og slukker reaktive radikaler. Dette reduserer photobleaching og microtubule oppløsning skyldes eksitasjon belysning under fluorescens imaging22,23.
      4. For eksperimenter som ATP konsentrasjonen er valgt vil bli vesentlig lavere enn 1 mM, legge følgende reagenser til løsningen å opprette en ATP-regenerere system: 1 μL aliquoted kreatin fosfat løsningen og 1 μL aliquoted kreatin phosphokinase løsning.
      5. Tilsett 1 μL av lager ATP løsningen motilitet løsningen. Flick eller vortex aliquot homogenously distribuere kjemikalier.
        Merk: Dermed siste konsentrasjonen av kjemikalier i løsningen er 10 μM paklitaxel, 0,5 mg·mL−1 kasein, 20 mM D-glukose, 200 μg·mL−1 gluko, 8 μg·mL−1 catalase, 10 mM dithiothreitol, 2 mM kreatinfosfat (hvis la), 2 Units· L−1 kreatin phosphokinase (hvis la) og 1 mM ATP. Denne løsningen vil heretter bli referert til som motilitet løsningen.
    2. Kinesin
      Merk: Lager kinesin løsningen brukes i disse eksperimentene er utarbeidet av G. Bachand ved Center for integrert nanoteknologi ved Sandia National Laboratories og gjort tilgjengelig under lisensavtale (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php). bufferen her består av 40 mM imidazole, 300 mM NaCl, 0,76 g· L-1 EGTA, 37,2 mg· L-1 EDTA, 50 g· L-1 sukrose, 0.2 mM TCEP og 50 μM Mg-ATP. For denne serien eksperimenter, ble den rkin430eGFP kinesin konstruere brukt. Dette er en kinesin som består av de første 430 aminosyrene av rotte kinesin tunge kjeden smeltet eGFP og en C-terminalen hans-kode på halen domene24. Det ble uttrykt i Escherichia coli og renset med en Ni−NTA kolonne. Konsentrasjonen av GFP-kinesin lager løsningen var 1,8 ± 0,3 μM som UV/Vis spectrophotometry, bruker en utryddelse koeffisient for GFP av 55 mM-1·cm-1 på 489 nm25, tatt i betraktning at kinesin er således en dimer.
      1. Angi ønsket kinesin konsentrasjon eller overflate tettheten for eksperimentet. Typisk analyser, denne konsentrasjonen er 20 nM. Hvis kinesin konsentrasjonen må fortynnes mer enn et hundred-fold, fortynne den i en løsning av BRB80 som inneholder 0,5 mg·mL-1 av casein.
      2. Legge 1 µL kinesin løsning til motilitet løsningen for å få en endelig konsentrasjon av approximatively 20 nM.
    3. Piskehale som henger
      1. Tilsett 10 μL av MT100 løsningen i delen 1.3 motilitet løsningen.
        Merk: Denne motilitet løsningen kan brukes for til 3 timene. Etter mister antifade systemet sin effektivitet fordi glukose i løsningen utarmet av den enzymatiske reaksjonen.

2. montering flyt cellene

  1. Vaske coverslips
    1. Flyt celler, bruke en stor dekkglassvæske (dimensjon: 60 x 25 mm) og en liten (dimensjoner: 22 x 22 mm)19.
    2. Skyll alle coverslips to ganger med etanol og to ganger med ultrapure vann. Sonicate coverslips i ultrapure vann for 5 min. tørke dem i en ovn ved en temperatur på 50-75 ° C.
    3. Bruke en UV/ozon renere (se Tabell av materialer og produsentens instruksjoner), behandle én side av hver dekkglassvæske i 15 min. utføre dette trinnet kan ved romtemperatur (~ 25 ° C) og i normal atmosfæriske tilstand (Trykk 1 atm).
    4. Slå nøye hver dekkglassvæske til den andre siden (ved hjelp av pinsett) og UV/ozon behandle den siden.
    5. Sonicate coverslips i ultrapure vann igjen i 5 minutter før tørking dem igjen i ovnen ved en temperatur på 50-75 ° C.
  2. Behandling av coverslips for å aktivere PEG-PPG-pinne belegg
    Merk: Dimethyldichlorosilane og toluen brukes i denne delen av protokollen er svært giftige, gjør du følgende under avtrekksvifte, mens å ta følgende forholdsregler: bære to sett vernehansker og en langermet skjorte under deres lab kåpe. Tuck kantene av hansker i ermene på skjorten slik at ingen hud fra underarmer er direkte utsatt for kjemikalier ved en søl. Vernebriller.
    1. Fortynne 25 mL av ren dimethyldichlorosilane i 475 mL av toluen. Legg hver dekkglassvæske i dimethyldichlorosilane og toluen løsningen i 15 sekunder.
    2. Vask coverslips to ganger i toluen og tre ganger i metanol. Tørr coverslips med trykksatt nitrogen.
  3. Montering coverslips i flyt celler
    1. Når coverslips er tørr, skåret en 2 cm x 2,5 cm stykke dobbeltsidig tape loddrett i to 1 cm x 2,5 cm striper.
    2. Sette den store dekkglassvæske på en delikate oppgaven svaber og stikke den bånd stripes lengderetningen langs kantene på dekkglassvæske å opprette en 1 cm x 2,5 cm området mellom deler av tape.
    3. Holde de små dekkglassvæske på tape stripene ferdig flyt celle forsamlingen.

3. strømmer løsninger i en flyt celle

  1. Flow approximatively 20 μL av PEG-PPG-pinne løsningen i sammensatte flyt cellen. Volumet er fløyet i cellen må være stor nok til å fylle kammeret. I neste trinn, bruke samme volum når utveksle løsninger.
  2. Tillate PEG-PPG-pinne løsningen å absorbere på overflaten i 5 minutter. Utveksle PEG-PPG-pinne løsningen med BRB80 buffer 3 ganger av flytende bufferen i. Flyt motilitet løsningen i flyt cellen.
  3. Forsegle kantene av flyt cellen med fett å hindre fordampning hvis planlagt eksperimentet er lengre enn en time.
    Merk: Flyt cellen er nå klar til å avbildes.

4. imaging en flyt celle

  1. Utføre et mål-type total intern refleksjon fluorescens (TIRF) oppsett for bildevisning for både de piskehale som henger og kinesin motorene (se Tabell for materiale).
    Merk: Her, vi brukte et mikroskop med en 100 x / 1.49 numerisk mål blenderåpning, bruker to lasere, med en bølgelengde på 642 nm og en maksimal effekt på 140 mW, og en annen med bølgelengde på 488 nm og en maksimal effekt på 150 mW.
  2. Plass en dråpe neddyppingsolje på målet.
  3. Plasser flyt cellen på mikroskopet plattformen og bringe målet inntil det er kontakt mellom olje på målet og flyt cellen.
  4. Bruk visningskroppen sperresystem dekke for å blokkere alle laserlys fra å rømme.
  5. Slå på laser og fokusere på lavere overflaten av flyt cellen. De piskehale som henger fluorescently merket og spent på en bølgelengde på 647 nm. De blir vist ved hjelp av en 642 nm laser mens en 488 nm laser brukes til GFP-kinesin-motorer.
  6. Registrere bilder eller videoer av interesse. Laser makt er vanligvis ca 30 mW og en eksponeringstid på 50 ms både laser kanaler. Bilder kan registreres så lenge det er motilitet i flyt-cellen.
    Merk: Laser lys er skadelig for det blotte øye og kan føre til ubotelig skade. Kontroller at opplyst området er helt dekket med en ugjennomsiktig lokk.

Representative Results

I disse eksperimentene, har vi brukt et 1000 ganger fortynning av de piskehale som henger i delen 1.3.2. Kinesin konsentrasjonen var 20 nM, og ATP konsentrasjonen var 1 mM. Bildebehandling ble utført TIRF mikroskopi. Gli piskehale som henger var separat fotografert fra kinesin-motors: piskehale som henger var synlig på eksitasjon med en 647 nm laser (figur 1, rød), og GFP-kinesin var synlig når opphisset med en 488 nm laser (figur 1, grønn). Tiden mellom eksitasjon med røde og grønne lys var mindre enn 1 s. Tiden mellom rammene var 10 s. piskehale som henger vises stabil gliding. Den gjennomsnittlige microtubule gli hastighet var approximatively 800 nm/s. Microtubule overflate tetthet var 400 mm-2. Spor av kinesin (grønn) syntes å strekke seg utover etterfølgende slutten av piskehale som henger (rød) for flere mikrometer.

Figure 1
Figur 1: gli piskehale som henger drevet av svakt overflaten-bundet kinesin motorer. Som piskehale som henger gå videre, samle de kinesin motorer fra løsning. Disse motorene veksle mellom to stater: single-grense på microtubule, og dobbel-bundet til både microtubule og overflaten. Når en dobbel bundet motor når slutten av microtubule, motoren er igjen og desorbs langsomt fra overflaten med en av rate på ca 0,1 s-1. Resultatet fortsatt stier av kinesin motors bak de piskehale som henger. Øverste rad: rød (microtubule) kanal. Midtre rad: grønn (kinesin) kanal. Nederste rad: kombinert rød (microtubule) og grønn (GFP-kinesin) kanal. Skala bar: 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

I dette arbeidet presenterer vi en aktiv nanoskala system hvilke selv samler svakt bindende byggesteinene for å lage egne spor. Som vist i figur 1, glir piskehale som henger akkumulere kinesin motorer fra løsning og sette dem på overflaten. Kinesin motorene forblir i kjølvannet av microtubule for en kort periode før retur til løsning. Dermed i dette eksperimentet motorer kinesin alternative mellom 3:

(1) et microtubule singel-bundet staten: Dette er når en kinesin først binder seg til en microtubule. Det finnes i likevekt med tilstand (2).

(2) en dobbel-bundet tilstand: i dette tilfellet et microtubule singel-bundet kinesin også binder til den overflate via hans-koden. Dobbel-bundet tilstanden gir microtubule fremdrift.

(3) en enkelt overflaten-bundet stat: en dobbelt-bundet kinesin som har gått på slutten av microtubule og har ikke ennå desorbed fra overflaten er i denne tilstanden. Disse motorene kan observeres i figur 1 (kombinert og grønne kanaler): de utvide bak halen av microtubule for flere micrometers og danner sine avtagende spor.

Det viktigste trinnet i denne protokollen er dannelsen av hydrofobe overflaten på lysbildet. Ikke bare bruker det farlige kjemikalier, men det tillater PEG-PPG-pinne functionalized med gruppen NTA til coat overflaten, som deretter kan kinesin reversibel binde til overflaten. Et annet viktig skritt er tetting flyt cellen med fett. Dette gir langvarig tenkelig uten væske i flyt celle fordamper.

De primære endringene denne teknikken består av endre microtubule konsentrasjon, kinesin konsentrasjon og ATP konsentrasjon. Hvis du endrer microtubule konsentrasjon, endres antallet piskehale som henger gli på overflaten. Hvis du endrer kinesin konsentrasjon, endres antallet kinesin molekyler som kan binde til microtubule. Men kan øker kinesin konsentrasjonen over beløpene allerede definert i dette eksperimentet øke bakgrunnen fluorescens, gjør det vanskeligere å se kinesin stier igjen gli piskehale som henger. I mellomtiden reduseres senke ATP konsentrasjoner under 10 µM betydelig microtubule gli hastighet. Hvis dette er ønskelig, er det nødvendig å bruke en ATP regenerere system består av kreatin fosfatase og phosphokinase.

En mulig begrensning av denne teknikken er at på grunn av store aktive kinesin innholdet på systemet, ATP kan brukes raskt, og eksperimenter kan vare mindre enn en time i visse betingelser. Dette ville for eksempel være tilfellet hvis en brukte en todelt høyere kinesin konsentrasjon og fem ganger høyere microtubule konsentrasjon enn hva er presentert i denne protokollen.

I vår tidligere arbeid18, vi studerte den romlige fordelingen av kinesin motorer langs de piskehale som henger, beviser at gli piskehale som henger samle kinesin motorer fra løsning, resulterer i en økning av tettheten av motorer langs den microtubule. Vi fant også at den piskehale som henger gliding stabilitet viste en lineær avhengighet av løsning kinesin konsentrasjon og microtubule hastigheten.

Presentert protokollen baner vei for en mer effektiv bruk av protein motorer i nanoskala utviklet systemer og for videre etterforskning i utformingen av aktive nanosystems i dynamisk likevekt. Videre kan dynamikken i dette systemet det tjene som en modell for å studere selvhelbredende og dynamisk utskifting av molekylære komponenter, lukke del av gapet mellom utvikling og naturlig.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne erkjenner takknemlig støtte under NSF grant NSF-DMR 1807514. Forfatterne takker G. Bachand og V. Vandelinder for å gi GFP-kinesin protein. Dette arbeidet ble utført, delvis ved Center for integrert nanoteknologi, en kontoret av vitenskap bruker anlegget drives for oss Department of Energy (DOE) Office of Science ved Los Alamos National Laboratory (kontrakt nei. DE-AC52-06NA25396) og Sandia National Laboratories (con-skrift nr 97 DE-AC04-94AL85000). Forfatterne takker Dr. Jennifer Neff og AllVivo vaskulær for sin gave PEG-PPG-pinne functionalized med NTA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
488 nm laser Omicron Laserage LuxX 488-150
642 nm laser Omicron Laserage LuxX 642
Casein Sigma C7078-500G
Catalase from bovine liver Sigma C40-500MG
Creatine Phosphate Sigma P-7936
Creatine Phosphokinase Sigma C3755-500UN
D-Glucose Sigma G2133-50KU
Dichlorodimethylsilane solution Sigma 40140-25ML Toxic
Dimethyl Sulfoxide Sigma 34869-100ML
Dithiothreitol Sigma D0632-5G Toxic
Eclipse TI Nikon Instruments
eGFP rkin430 Provided by George Bachand
EGTA Sigma E4378-25G
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-49A
Glucose Oxidase Sigma G0543-10KU
Guanosine Triphosphate Sigma G8877-10MG
Kimwipes Delicate Task Wipers Sigma Pharmaceuticals 8089
Magnesium Chloride Sigma M1028-100ML
Methanol Fisher Chemical A412 Toxic
Milli-Q Water Purification System Millipore Corporation
Nickel Sulfate Sigma 656895-50G
Paclitaxel Sigma T1912-5MG
PIPES Sigma P-6757
Pluronic F108-NTA Provided by Jennifer Neff and AllVivo Vascular PEG-PPG-PEG-NTA
Pluronic F-108 Sigma 542342-250G PEG-PPG-PEG
Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 21-403-190
Toluene Fisher Chemical T324 Toxic
Tubulin, HiLyte647-labeled Cytoskeleton, Inc. TL670M
UV Ozone Procleaner BioForce Nanosciences PC440
Whatman Puradisc syringe filters Sigma WHA67840402
Zyla 4.2 sCMOS Camera Andor Technology sCMOS 4.2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vale, R. D., Reese, T. S., Sheetz, M. P. Identification of a Novel Force-Generating Protein, Kinesin, Involved in Microtubule-Based Motility. Cell. 42, 39-50 (1985).
  2. Ray, S., Meyhofer, E., Milligan, R. A., Howard, J. Kinesin Follows the Microtubule's Protofilament Axis. Journal of Cell Biology. 121, 1083-1093 (1993).
  3. Dennis, J. R., Howard, J., Vogel, V. Molecular shuttles: directed motion of microtubules along nanoscale kinesin tracks. Nanotechnology. 10, 232-236 (1999).
  4. Kawamura, R., Kakugo, A., Osada, Y., Gong, J. P. Microtubule bundle formation driven by ATP: the effect of concentrations of kinesin, streptavidin and microtubules. Nanotechnology. 21, 145603 (2010).
  5. Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in Insect Cells Improves Microtubule in Vitro Gliding Performance, Long-Term Stability and Guiding Efficiency in Nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15, 62-69 (2016).
  6. Whitesides, G. M., Grzybowski, B. Self-assembly at all scales. Science. 295, 2418-2421 (2002).
  7. Ringler, P., Schulz, G. E. Self-assembly of proteins into designed networks. Science. 302, 106-109 (2003).
  8. Boncheva, M., et al. Magnetic self-assembly of three-dimensional surfaces from planar sheets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 3924-3929 (2005).
  9. England, J. L. Dissipative adaptation in driven self-assembly. Nature Nanotechnology. 10, 919 (2015).
  10. Fialkowski, M., et al. Principles and Implementations of Dissipative (Dynamic) Self-Assembly. The Journal of Physical Chemistry B. 110, 2482-2496 (2006).
  11. Boncheva, M., Whitesides, G. M. Self-healing systems having a design stimulated by the vertebrate spine. Angewandte Chemie-International Edition. 42, 2644-2647 (2003).
  12. Rubenstein, M., Cornejo, A., Nagpal, R. Programmable self-assembly in a thousand-robot swarm. Science. 345, 795-799 (2014).
  13. Plaisted, T. A., Vakil Amirkhizi, A., Arbelaez, D., Nemat-Nasser, S. C., Nemat-Nasser, S. Self-healing structural composites with electromagnetic functionality. Proceedings of the Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. 5054, 372-381 (2003).
  14. Ghosh, S. K. Self-Healing Materials. Ghosh, S. K. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim. 1-28 (2009).
  15. Burnworth, M., et al. Optically healable supramolecular polymers. Nature. 472, (2011).
  16. Bachand, G. D., Spoerke, E. D., Stevens, M. J. Microtubule-Based Nanomaterials: Exploiting Nature's Dynamic Biopolymers. Biotechnology and Bioengineering. 112, 1065-1073 (2015).
  17. Gao, Y. W., Lei, F. M. Small scale effects on the mechanical behaviors of protein microtubules based on the nonlocal elasticity theory. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387, 467-471 (2009).
  18. Lam, A. T. -C., Tsitkov, S., Zhang, Y., Hess, H. Reversibly Bound Kinesin-1 Motor Proteins Propelling Microtubules Demonstrate Dynamic Recruitment of Active Building Blocks. Nano Letters. 18, 1530-1534 (2018).
  19. Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules. Methods in Cell Biology. 39, 137-147 (1993).
  20. Huppertz, T., Fox, P. F., Kelly, A. L. Proteins in Food Processing (Second Edition). Yada, R. Y. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 49-92 (2018).
  21. Wettermark, G., Borglund, E., Brolin, S. E. A regenerating system for studies of phosphoryl transfer from ATP. Analytical Biochemistry. 22, 211-218 (1968).
  22. Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination. Journal of Cell Biology. 107, 1011-1024 (1988).
  23. Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -H., Vogel, V. Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices. Nanotechnology. 15, S540-S548 (2004).
  24. Rogers, K. R., et al. KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry. EMBO Journal. 20, 5101-5113 (2001).
  25. Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 73, 2782-2790 (1997).

Tags

Engineering motorer problemet 143 nanobiotechnology molekylær skyttelbussene piskehale som henger kinesin reversibel bindende dynamisk selvstendig montering
Montering molekylær skyttelbussene drevet av reversibel knyttet Kinesins
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bassir Kazeruni, N. M., Tsitkov, S., … More

Bassir Kazeruni, N. M., Tsitkov, S., Hess, H. Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins. J. Vis. Exp. (143), e59068, doi:10.3791/59068 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter