Artigo de método
* These authors contributed equally
A combinação de microscopia eletrônica de transmissão e transdução no útero é uma poderosa abordagem para o estudo de mudanças morfológicas na ultraestrutura fina do sistema nervoso durante o desenvolvimento. Este método combinado permite insights profundos sobre mudanças em detalhes estruturais subjacentes neuroplasticidade no que diz respeito a sua representação topográfica.
O presente estudo combina transdução no útero com microscopia eletrônica de transmissão (TEM) com o objetivo de uma análise morfométrica precisos dos parâmetros ultra-estruturais em inequivocamente identificadas estruturas topográficas, afetados por uma proteína de interesse que é introduzido no organismo através de transferência viral. Esta abordagem combinada permite uma transição suave de macrostructural para identificação ultraestrutural pelos seguintes mapas topográficos de navegação em um atlas de tecido. Microscopia eletrônica de alta resolução do tecido em-utero-transfectadas revela a ultraestrutura bem o neurópilo e seus parâmetros de plasticidade, como áreas seccionadas bouton sinápticos, o número de vesículas sinápticas e mitocôndrias dentro de um Perfil de Bouton, o comprimento de contatos sinápticos, áreas axonal seccionadas, a espessura das bainhas de mielina, o número de lamelas de mielina e seccionadas áreas de perfis de mitocôndrias. A análise destes parâmetros revela essenciais insights sobre alterações de plasticidade ultra-estruturais nas áreas do sistema nervoso que são afetados pela transferência viral da construção de genética. Este método combinado não só pode ser usado para estudar o efeito directo de biomoléculas geneticamente modificadas e/ou drogas na plasticidade neuronal, mas também abre a possibilidade de estudar o resgate no útero de plasticidade neuronal (por exemplo, no contexto da doenças neurodegenerativas).
O fóton não pode penetrar uma amostra de tecido ultrafinos no grau de profundidade de um elétron. Isto atribui vantagens inestimáveis para TEM na captura de imagens de resolução nanômetros de belas estruturas quando comparado às técnicas de microscopia de luz. Por exemplo, TEM permite a visualização de organelas intracelulares, tais como mitocôndrias, melanossomas e vários tipos de grânulos secretórios, microtúbulos, microfilamentos, cílios, microvilli e junções intercelulares (superfície de célula especializações), em particular as sinapses no sistema nervoso1,2,3,
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Todos os procedimentos em assuntos animais foram aprovados pelas comissões institucionais de ética animal dos Estados Federados de Hamburgo e Nordrhein-Westfalen, Alemanha. Use instrumentos estéreis, luvas e casacos assépticos ao longo de todo o procedimento cirúrgico.
1. no Utero transdução
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Para anestesia é confiável e rápida de ratos, inúmeros parâmetros de segurança foram considerados, e uma área de trabalho otimizada da unidade de anestesia provou para ser adequado (Figura 1A). A unidade é projetada para controlar a mistura de isoflurano líquido e ar ambiente com uma precisão exigida para a bem sucedida cirurgia em pequenos animais, como camundongos e ratos. Ar e isoflurano são misturados no vaporizador de acordo com as confi.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Um passo crucial de transdução no útero é o procedimento de injeção. A injeção precisa em ventrículos cerebrais ou em outra área de interesse requer experiência e habilidade de hands-on. A mais fina a ponta de conta, o menor dano tecidual pode ocorrer; no entanto, isto é à custa do aumento da pressão de injeção. Em contraste com eletroporação no útero19,20,21,22, a taxa de sobrevivência dos emb.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Os autores não têm nada para divulgar.
Os autores Agradecemos aos colegas do centro de animais na faculdade de medicina, Universidade de Ruhr Bochum, seus cuidados de suporte e animal.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2,4,6-Tris(dimetil-aminometil)fenol | Serva | 36975 | |
| 26 G x 1'' agulha | Henke-Sass, Wolf GmbH | ||
| 410 Unidade de Anestesia para bomba de ar | Instrumentos Biomédicos (Univentor) | 8323102 | |
| Vírus adeno-associado sorotipo 1 (AAV1) | UKE (Viral Core Facility) | - | Para referências e áreas-alvo de AAV1, consulte: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ e também: Vetores de entrega de genes projetados: engenharia molecular e evolução de vetores virais adeno-associados para transferência aprimorada de genes. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 março; 25(3):489-99. Os vetores virais AAV recombinantes pseudotipados com capsídeos virais dos sorotipos 1, 2 e 5 exibem eficiência diferencial e tropismo celular após a entrega em diferentes regiões do sistema nervoso central. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. Agosto de 2004; 10(2):302-17. Os vetores de vírus adeno-associados recombinantes auto-complementares (scAAV) promovem a transdução eficiente independentemente da síntese de DNA. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. Agosto de 2001; 8(16):1248-54. |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | baixa gelificação agarose |
| Bomba de ar | Instrumentos biomédicos (Univentor) | Eheim 100 | |
| Araldite | CIBA-GEIGY | 23857.9 | resina para incorporação de |
| conjuntos de sintonia de aspirador | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Máscara de respiração Mouse Instrumentos biomédicos de alumínio anodizado | (Univentor) | - | |
| buprenorfina | Temgesic | ampolas | analgésicos |
| capilares | Ciência-Produtos | GB100TF-10 | com filtro |
| Anidrido dodecenilsuccínico | Pinça Fluka | 44160 | |
| Dumont (#3, 12 cm, reta, 0,2 x 0,12 mm) | FST | 11203-23 | |
| barbeador elétrico | Phillips | - | |
| Suturas de Ethicon (Ethilon, 6-0 e 3-0) | poliamida | de Ethicon-Fast | |
| Bepanthene-Fast | |||
| Green | Sigma-Aldrich | F7252 | para visualização de líquidos injetados Interruptor de |
| Roteamento de Gás Conectores 4/2 | Instrumentos Biomédicos (Univentor) | 8433020 | |
| pinça hemostática de Mosquito halsted (12,5 cm, reta) | FST | 13011-12 | |
| Heparina-Natrium | Ratiopharm | 25 000 I.E./5 mL | |
| Caixa de indução para camundongos com tampa que se move horizontalmente. Dimensões internas: CxLxA: 155 mm x 115 mm x 130 mm. Espessura da parede: 6 mm | Instrumentos Biomédicos (Univentor) | -pinça de | |
| íris (10 cm, curva, serrilhada) | FST | 14007-14 | |
| tesoura de íris (11 cm, reta, carboneto de tungstênio) | FST | 14501-14 | |
| Isofluran OP Tisch, aquecido eletricamente, sm Dimensões externas: 257 mm x110 mm x 18 mm. Área de aquecimento: 190 mm x 90 mm A remoção do isoflurano escapando a máscara respiratória é feita para baixo em conformidade com os regulamentos Biomedical | Instruments (Univentor) | - | |
| isoflurano (Attane) | JD medical | anestesia inalatória | |
| LED Luzes RGB | Cameo | CLQS15RGBW | LEDs 2 x 15 W |
| Microscópio óptico Basic DM E | Leica-4x | (N.A. 0,1 ∞/-), 10x (N.A. 0,22 ∞/0,17), 40x (N.A. 0,65 ∞/0,17), 100x (N.A. 1,25 ∞/0,17) objetivas | |
| extrator de micropipetas | Science-Products | P-97 | |
| Pinça hemostática para mosquitos (12,5 cm, curvo) | FST | 13010-12 | |
| Grelhas de níquel, 200 mesh | Ted Pella | 1GC200 | |
| Ósmio (VIII)-óxido | Degussa | 73219 | |
| Óxido de propileno | Fluka | 82320 | |
| lâminas de barbear | Schick | 87-10489 | |
| Pentobarbital de sódio (Narcoren) | Merial GmbH | - | |
| TC01mR 1-Channal controlador de temperatura com feedback | Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| Technovit 4004 cola de dois componentes | Kulzer | ||
| Telemacrodevice | Canon-Canon | Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extensão abaixo de 150 mm, Tubo de extensão manual Anel de 7 mm, Anel de 14 mm, Anel de 28 mm, Anel reverso macro (58 mm), Suporte de cópia Canon. | |
| Termoextrator P-97 | Sutter | Instruments-dispositivo | |
| de lâmina de barbear vibratória fina | Krup-com | lâminas finas Szabo | |
| azul toluidina | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Microscópio eletrônico de transmissão C20 | Phillips-até | 200 kV | |
| Tygon 6/4 Material de tubulação para conexão de todas as peças Diâmetro externo: 6 mm Diâmetro interno: 4 mm Espessura Wa ll: 1 mm | Instrumentos Biomédicos (Univentor) | - | |
| Ultracut E | Reichert-Jung-ultramicrótomo | ||
| Univentor Scavenger | Instrumentos Biomédicos (Univentor) | 8338001 | |
| Tesoura Vannas (8 cm, reta) | FST | 15009-08 |
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE
Solicitar permissão