Artigo de método

Preparação de fungos e materiais vegetais para a elucidação estrutural usando polarização Nuclear dinâmica NMR Solid-State

DOI:

10.3791/59152

⸱

12 de fevereiro de 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Louisiana State University, 2National High Magnetic Field Laboratory, 3Departments of Pediatrics, and Microbiology, Immunology and Parasitology, Louisiana State University Health Sciences Center

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Um protocolo para a preparação de 13C,15amostras de fungos e plantas N-etiquetados para investigações de polarização nuclear dinâmica (DNP) e espectroscopia NMR Solid-State multidimensional é apresentado.

Resumo

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Este protocolo mostra como uniformemente 13C, 15N-rotulado materiais fúngicos podem ser produzidos e como estes materiais macios devem ser procedeu para NMR Solid-State e DNP sensibilidade melhorada dos experimentos. O procedimento de processamento da amostra de biomassa de planta também é detalhado. Este método permite a medição de uma série de 1D e 2D 13C -13C / espectros de correlações15N, que permite a elucidação estrutural de alta resolução de biomateriais complexos em seu estado nativo, com mínima perturbação. O isótopo-rotulagem pode ser examinado através da quantificação da intensidade em espectros de 1D e a eficiência de transferência de polarização em espectros de correlação 2D. O sucesso da preparação da amostra de polarização nuclear dinâmica (DNP) pode ser avaliado pelo fator de aumento de sensibilidade. Novas experiências, examinando os aspectos estruturais dos polissacarídeos e proteínas conduzirá a um modelo da arquitetura tridimensional. Esses métodos podem ser modificados e adaptados para investigar uma ampla gama de materiais ricos em carboidratos, incluindo as paredes celulares naturais de plantas, fungos, algas e bactérias, bem como sintetizado ou projetado, polímeros de carboidratos e seus complexos com outros moléculas.

Introdução

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Hidratos de carbono desempenham um papel central em vários processos biológicos, tais como armazenamento de energia, construção estrutural e reconhecimento celular e adesão. Eles são enriquecidos na parede celular, que é um componente fundamental em plantas, fungos, algas e bactérias1,2,3. Parede celular serve como uma fonte central para a produção de biocombustível e biomateriais, bem como um alvo promissor para terapias antimicrobiana4,5,6,7,8 , 9.

A compreensão contemporânea destes materiais complexos tem sido substancialmente avançada por décadas de esforços que foram dedicados à caracterização estrutural usando quatro principais métodos bioquímicos ou genéticos. O primeiro método principal se baseia em tratamentos sequenciais usando produtos químicos ou enzimas para quebrar as paredes celulares em porções diferentes, que é seguido por composição e análise de enlace de açúcares em cada fração de10. Este método lança luz sobre a distribuição de domínio de polímeros, mas a interpretação pode ser enganosa devido às propriedades físicas e químicas das biomoléculas. Por exemplo, é difícil determinar se a fração alcaloide extraíveis origina-se de um único domínio de moléculas menos estruturadas ou de moléculas espacialmente separadas com solubilidade comparável. Em segundo lugar, a porções extraídas ou paredes de célula inteira pode também ser medidas usando solução NMR para determinar as ligações covalentes, também denominadas como reticulação, entre diferentes moléculas11,12,13, 14,15. Desta forma, a estrutura detalhada das ligações covalentes âncoras poderia ser sondada, mas limitações podem existir devido a baixa solubilidade de polissacarídeos, o número relativamente pequeno de sites de reticulação e a ignorância dos efeitos não-covalente que estabiliza embalagem de polissacarídeo, incluindo a ligação do hidrogênio, força de van der Waals, interação eletrostática e entrelaçamento de polímero. Em terceiro lugar, a afinidade obrigatória tem sido determinada em vitro usando polissacarídeos isolados16,17,18,19, mas a purificação procedimentos podem alterar substancialmente a estrutura e propriedades destas biomoléculas. Esse método também não consegue replicar a deposição sofisticada e montagem de macromoléculas após a biossíntese. Finalmente, o fenótipo, morfologia celular e propriedades mecânicas dos mutantes genéticos com produção atenuada de determinado componente da parede celular lançar luzes sobre as funções estruturais dos polissacarídeos, mas evidências moleculares mais é necessário para colmatar estas observações macroscópicas com a função engenharia de proteína machineries20.

Recentes avanços no desenvolvimento e aplicação de espectroscopia NMR Solid-State multidimensional introduziram uma oportunidade única para resolver estes enigmas estruturais. 2D/3D Solid-State NMR experimentos permitem investigação high-resolution da composição e arquitetura de materiais ricos em carboidratos no estado nativo, sem grandes perturbações. Estudos estruturais têm sido realizados com sucesso no primário e paredes celulares secundárias de plantas, a biomassa tratada cataliticamente, biofilme bacteriano, o pigmento fantasmas em fungos e, recentemente pelos autores, as paredes celulares intactos em um fungo patogênico Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. o desenvolvimento da polarização nuclear dinâmica (DNP)32,33,34,35,36,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42 substancialmente facilita a elucidação estrutural de NMR como o aprimoramento da sensibilidade pela DNP marcadamente encurta o tempo experimental em biomateriais estes complexos. O protocolo descrito aqui detalha os procedimentos para o fungo a. fumigatus isótopo-rotulagem e preparando fúngicas e amostras da planta para a caracterização do estado sólida NMR e DNP. Procedimentos de rotulagem semelhantes devem ser aplicáveis a outros fungos com meio alterado, e os procedimentos de preparação de amostra devem ser geralmente aplicáveis a outros biomateriais ricos em carboidratos.

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Protocolo

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1. crescimento de 13C, 15N-rotulado Aspergillus fumigatus meio líquido

  1. Preparação de sem rótulo e 13C, meio de crescimento N-rotulado de 15
    Nota: Os dois meio de levedura extrato peptona Dextrose (YPD) e o melhor médio mínimo43 foram utilizados para a manutenção da cultura fúngica. Todas as etapas após a autoclavagem são executadas em uma capa de fluxo laminar para minimizar a contaminação.
    1. Preparação de meio líquido sem rótulo: dissolver 6,5 g de pó YPD em 100 mL de água destilada e, em seguida, autoclave para 25 min a 134 ° C.
    2. Preparação de meio sólido sem rótulo
      1. Adicione 1,5 g de ágar-ágar e 6,5 g de pó YPD em 100 mL de água destilada.
      2. Autoclave a médio para 25 min a 121 ° C e, em seguida, cool até aproximadamente 50 ° C.
      3. 13-15 mL do meio de transferência em cada plástico pre-estéril de Petri e cubra o prato com uma tampa imediatamente.
    3. Preparação de 13C, 15N-rotulado de meio líquido
      Nota: Para preparar a solução de crescimento para o isótopo etiquetando, um meio mínimo contendo 13C-glicose e 15N-sódio nitrato e uma solução de oligoelementos são preparados separadamente e depois misturados antes do uso.
      1. Prepare 100 mL do meio mínimo contendo isótopos conforme listado na tabela 1. Ajuste o pH para 6.6 usando NaOH (1 M) ou uma solução de HCl (1M).
      2. Autoclave o meio mínimo para 25 min a 121 ° C.
      3. Preparar 100 mL (1, 000 x) da solução de oligoelementos, dissolver os sais listados na tabela 2 na água destilada. Autoclave a solução durante 25 minutos a 134 ° C. Esfriar e armazenar a solução a 4 ° C para uso a curto prazo. O pH será cerca de 6,5 e pode ser verificado utilizando um medidor de pH.
      4. Adicione 0,1 mL de solução de oligoelementos para 100 mL de 13C, 15N-rotulado meio mínimo conforme listado na tabela 2 , antes do uso.
  2. Crescimento dos fungos materiais
    1. Transferi uma pequena quantidade de fungos de armazenamento em um prato YPD usando um loop inoculando numa vizinhança de fluxo laminar. Manter a cultura a 30 ° C durante 2 dias na incubadora.
    2. Use um loop inoculando para transferir um ativa borda fúngica crescente para a 13C,15N-rotulagem solução em uma capa de fluxo laminar. Manter a cultura a 30 ° C por 3-5 dias a 220 rpm numa incubadora de agitação.
    3. Centrifugar a 4.000 x g por 20 min. remover o sobrenadante e coletar o sedimento.
    4. Use uma pinça para coletar ~0.5 g de pelota bem hidratada (> 50 hidratação de wt %) para estudos de NMR. Perda de hidratação em qualquer ponto agravarão substancialmente a resolução espectral.
      Nota: Se necessário, uma pequena quantidade (0,1 g) dos micélios hidratados pode ser separada e totalmente secas sob fluxo de gás de2 N em uma capa ou um Liofilizador para estimar o nível de hidratação e calcular a porcentagem de massa seca. Geralmente, um sedimento contendo ~0.3 g massa seca pode ser obtida após 3 dias. Se a experiência NMR para ser realizado é longa (> 7 dias) e/ou se o estado dos fungos precisa ser corrigido, o material fúngico pode ser profundamente congelado no líquido N2 por 10-20 min antes processamento adicional. Se o experimento será curto (3 a 6 dias), o congelamento pode ser ignorado para que a amostra pode permanecer fresca.
    5. Misturar o material em excesso com 20% (v/v) de glicerol num tubo de centrífuga e mantê-lo em um freezer-80 ᵒC para armazenamento a longo prazo.

2. preparação da . fumigatus de DNP estudos e NMR Solid-State

  1. Preparação da . fumigatus para experimentos de NMR Solid-State
    1. Dialize 13C, 15N-rotulado fungos amostra (etapa 1.2.4.) contra 1 L de 10 mM de tampão fosfato (pH 7.0) a 4 ° C, usando um saco de diálise com 3.5 peso molecular kDa corte para remover pequenas moléculas do meio de crescimento para um período total de 3 dias. Altere a reserva duas vezes por dia.
      Nota: Como alternativa, a amostra pode ser lavada para 6 - 10 vezes com água desionizada para remover residuais pequenas moléculas.
    2. Transferi a amostra para um tubo de 15 mL e centrifugar por 5 min (10.000 x g) utilizando uma centrífuga de bancada. Remover o sobrenadante e recolher os materiais restantes de fungos.
    3. Pacote de 70-80 mg do uniformemente 13C-etiquetado e bem hidratado amostra Cole um ZrO2 rotor de 4 mm ou 30-50 mg de rotores de 3,2 mm para experiências NMR. Repetidamente, espremer a amostra suavemente usando uma haste de metal e absorver o excesso de água usando papel.
    4. Firmemente a tampa do rotor e inserir a amostra no espectrómetro para caracterização de NMR Solid-State.
      Nota: Os novíssimo rotores são sugeridos para minimizar a possibilidade de travamento do rotor e vazamento no espectrómetro NMR da amostra. Se necessário, uma inserção de Kel-F descartável com parafusos de vedação pode ser usada para servir como um recipiente secundário dentro do rotor.
  2. Preparação de amostras da . fumigatus para experimentos DNP
    1. Prepare-se 100 µ l de DNP solventes29,44 (também conhecida como a matriz DNP) em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL para 13C,15amostras de fungos N-rotulados. Esta matriz DNP contém uma mistura de d8-glicerol/D2O/H2O (60/30/10% de Vol).
      Nota: Se amostras sem rótulo devem ser investigados, então prepare-se a matriz DNP usando 13d empobrecido C8-glicerol (12C3, 99,95%; D8, 98%) e D2O e H2O para evitar 13C sinal contribuição de solventes.
    2. Dissolva 0,7 mg de AMUPol45 em 100 µ l de solventes DNP para formulário 10mm radical solução-mãe. Vórtice para 2-3 minutos garantir que os radicais são totalmente dissolvidos na solução.
    3. Mergulhe 10mg dos dializados 13C, 15N-rotulado materiais fúngicos como descrito nos passos anteriores (etapas 2.1.1 e 2.1.2) em 50 µ l de solução de AMUPol e triture levemente a mistura usando um pilão e almofariz para garantir a penetração dos radicais em as paredes celulares porosas.
      Nota: Para reduzir a taxa de perda de hidratação, a moagem pode também ocorrer em um tubo de microcentrifugadora usando um micropestle.
    4. Adicione outro µ l 30 da solução radical ao pellet moído para hidratar mais a amostra fúngica.
    5. Embalar o pellet em um rotor de safira de 3,2 mm, aperte levemente e retire o solvente DNP em excesso. Adicione um plug de 3,2 mm do silicone para impedir a perda de hidratação. Normalmente, 5-30 mg da amostra pode ser embalado para o rotor. A quantia exata que precisa de ser determinado pela exigência das experiências NMR sensibilidade para ser conduzido.
    6. Inserir e girar a amostra em um espectrômetro DNP, medir um espectro DNP aprimorado sob irradiação de microondas e compará-lo com o espectro de microondas. Isto levará a um reforço fator εligar/desligar, que deve ser de 20-40 para estes materiais complexos. Execute os experimentos projetados para determinar a estrutura da parede celular.

3. preparação da planta de biomassa para NMR e estudos DNP

  1. Preparação de materiais vegetais para NMR Solid-State
    1. Produzir uniformemente 13C-rotulado plantas in-house usando 13CO2 suprimentos em uma câmara ou 13C-glicose meio crescimento conforme descrito anteriormente,,4647 ou aquisição directa de materiais rotulados de empresas de criação de etiquetas de isótopo.
      Nota: 13C-glicose pode somente ser usado em crescimento escuro para evitar a introdução de 12C pela fotossíntese.
    2. Cortar o uniformemente 13C rotulado material vegetal em pedaços pequenos (tipicamente 1-2 mm de dimensão) usando uma lâmina de laboratório.
      Nota: Dependendo da finalidade, as paredes celulares extraídas são por vezes utilizadas para caracterização estrutural e os protocolos detalhados são relatados em anteriores estudos21,46.
    3. Se a amostra foi previamente secos, adicionar 100 µ l de água a 30 mg de materiais vegetais em um tubo de 1,5 mL microcentrifuga, vórtice, equilibrar à temperatura ambiente por 1 dia. Centrifugar a 4.000 x g durante 10 minutos e remover o excesso de água com uma pipeta.
    4. Se a amostra era nunca seca em qualquer ponto, use diretamente a amostra sem tratamento adicional.
    5. Embale os materiais de planta resultante em 3,2 mm ou 4 mm ZrO2 rotores para experimentos de NMR Solid-State.
  2. Preparação de materiais vegetais para estudos DNP
    1. Prepare 60 µ l solução stock de 10mm AMUPol radical como descritos passos 2.2.1 e 2.2.2.
    2. Cortar o uniformemente 13C rotulado material vegetal a ser estudado em pedaços pequenos (1-2 mm de dimensão) usando uma lâmina de laboratório e pesar 20 mg dos materiais vegetais.
    3. Mão-moer os pedaços de planta em pequenas partículas (~ 1-2 mm de tamanho) usando um almofariz e um pilão. Os pós finais têm uma aparência homogênea.
    4. Adicionar 40 µ l da solução-mãe DNP preparado na etapa anterior (etapa 2.2.2) para o material de planta e triture levemente por 5 min garantir homogênea mistura-se com o radical.
    5. Adicione outro 20 µ l da solução estoque para hidratar mais o material vegetal após a moagem.
    6. Embale a amostra de planta equilibrada em um rotor de safira de 3,2 mm para experimentos DNP. Introduza um tampão de silicone para evitar a perda de hidratação.

4. padrão NMR Solid-State experimentos para caracterização inicial dos biomateriais ricos em carboidratos

Nota: Uma breve visão geral das experiências NMR é fornecida nesta seção. No entanto, a elucidação estrutural normalmente requer vastos conhecimentos. Portanto, recomenda-se esforços de colaboração com Rydberg NMR.

  1. Medida 1D 13C Cruz polarização (CP), 13C polarização direta (DP) com 2-s e 35-s reciclar atrasos e 1H -13C INEPTO48,49 espectros para obter uma compreensão geral do que os dinâmicos distribuição de componentes celulares (Figura 1a). As paredes celulares são tipicamente parte relativamente rígida e exibem sinais dominantes no espectro de CP.
  2. Medir uma série de experimentos de correlação 2D padrão 13C -13. C para atribuições de ressonância dos sinais de 13C. Comece com Recentrado inadequada50,51 para obter conectividade de carbono, que precisa ser assistido por uma série de experiências através do espaço como 1.5-ms RFDR52 (Figura 1b) e cabo de 50-ms/Marcos de Oliveira53 experiências.
    Nota: Se é de interesse para encontrar uma amostra rico em um componente específico, por exemplo, a primária ou paredes celulares secundárias, então vários segmentos ou várias plantas podem precisar de ser medidos separadamente para encontrar a amostra com a composição ideal.
  3. Conduza experimentos de correlação de13C 2D 15N - que podem ser medidos para facilitar as atribuições de ressonância de proteínas e carboidratos nitrogenados.
    Nota: A atribuição de ressonância é normalmente demorada. Atualmente está sendo desenvolvido um método para facilitar a atribuição de ressonância dos sinais de carboidrato para aqueles cientistas sem experiência prévia.
  4. Medir mais especializados experimentos para determinar as proximidades espaciais (Figura 1 c, d), hidratação e mobilidades de biomoléculas complexas para determinar a estrutura tridimensional dos materiais ricos em carboidratos como sistematicamente descrito anteriormente22,29.

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Resultados

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A rotulagem de isótopo substancialmente aumenta a sensibilidade de NMR e torna possível para medir uma série de 13C -15N correlação espectros para analisar a composição, hidratação, mobilidade e 2D 13C -13C e embalagem de polímeros, que serão integrados para construir um modelo tridimensional de arquitetura da parede celular (Figura 1). Se a rotulagem uniforme for bem-sucedido, um conjunto completo de espectros de <...

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Discussão

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Comparado com os métodos bioquímicos, NMR Solid-State tem vantagens como uma técnica não-destrutiva e em alta resolução. NMR também é quantitativa na análise composicional, e ao contrário da maioria dos outros métodos analíticos, não terá as incertezas introduzido pela solubilidade limitada de biopolímeros. Estabelecimento do protocolo atual facilita estudos futuros sobre biomateriais ricos em carboidratos e polímeros funcionalizados. No entanto, deve notar-se que a análise de dados e atribuição de ressonância pode ser d...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nós não temos nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation através da NSF OIA-1833040. O laboratório nacional de campo magnético elevado (NHMFL) é suportado pela National Science Foundation através de DMR-1157490 e o estado da Flórida. O sistema MAS-DNP no NHMFL é financiado em parte pelo NIH S10 OD018519 e NSF CHE-1229170.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Molibdato de amônio tetrahidratadoAcros Organics12054-85-2
AMUPolCortecnetC010P002
Balança de pesagem analíticaOhausB730439218Modelo PA84C
Bioclave 16 LVWR470230-598
Gabinete de biossegurançaLabconco corporation302319100
Ácido bóricoA VWRBDH9222loja em 15-30 & C
Cloreto de Cobalto (II) HexahidratadoHoneywell|Fluka60820≥ 98
Sulfato de Cobre (II) PentahidratadoBDHBDH9312≥ 98 %
Corning LSE incubadora de agitaçãoThermo Fisher Scientific7202152
D2OSigma Aldrich15188299,9 átomos % D
d6-DMSOSigma Aldrich15187499,9 átomos % D
d8-glicerolSigma Aldrich447498≥ 99 átomos % D
Tubulação de diálise 3,2 kDaSigma AldrichD2272132724
Fosfato DipotássicoVWRBDH9266≥ 98 %
GlicerolSigma AldrichG5516≥ 99,5 %
Centrífuga Heraus Megafuge 16RThermo Fischer Scientific750004271Máximo RCF 25,830 x g
Kit de Inserção Descartável HR-MASBrukerB4493Kel-F
Sulfato de Ferro(II) HeptahidratadoAlfa Aesar14498≥ 99+ %
Sulfato de magnésio heptahidratadoVWR10034998armazenar a 18-26 > C
Manganês(II) Cloreto TetrahidratadoAlfa Aesar11563≥ 99 %
Fosfato MonopotássicoVWR470302-254≥ Medidor de pH 99
Mettler ToledoB706689216
Etilenodiaminotetraacetato TetrassódicoAcros Organics13235-36-9≥ 99,5 %
Sulfato de Zinco HeptahidratadoAlfa Aesar33399≥ 98%
12C3, d8-glicerolCambridge Isotope LaboratoryCDLM-866012C3, 99,95%; D8, 98%
13C6-glicoseSigma Alrdrich364606≥ 99 % (CP)
15N-nitrato de sódioSigma Aldrich364606≥ 98 % 15N, ≥ 99 (cp)
3,2 mm de safira NMR rotorCortecnetB6939
3,2 mm plugue de siliconeBrukerB7089
4 mm MAS Kit de rotorBrukerH14355Zircônia
% %

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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