Summary
Hier präsentieren wir eine reproduzierbare Methode für die Entwicklung einer orthotopen Mausmodell von Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür. Tumoren zeigen klinisch relevante histopathologischen Merkmale der Krankheit, einschließlich der Nekrose, schlechte Differenzierung und Knotenpunkte Metastasen immun Infiltration. Tumor-tragenden Mäusen Symptome klinisch relevante wie Dysphagie, Kiefer Verschiebung und Gewichtsverlust.
Abstract
Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür (lokal) ist eine schwächende und tödliche Krankheit mit einer hohen Prävalenz von Wiederholung und Therapieversagen. Um bessere therapeutische Strategien zu entwickeln, Verständnis Tumor microenvironmental Faktoren, die die Therapieresistenz ist wichtig. Ein wesentliches Hindernis für das Verständnis der Krankheitsmechanismen und Verbesserung der Therapie wurde ein Mangel an murine Zell-Linien, die die aggressive und metastasierten Natur des menschlichen HNSCCs ähneln. Darüber hinaus ein Großteil der murinen Modellen beschäftigen subkutane Implantationen von Tumoren, die wichtige physiologische Funktionen der Kopf-Hals Region, einschließlich hohe Gefäßdicke, umfangreiche lymphatischen Gefäßsystem und resident Schleimhaut Flora fehlen. Der Zweck dieser Studie ist, zu entwickeln und eine Orthotopic Modell der lokal zu charakterisieren. Wir beschäftigen zwei genetisch unterschiedliche murinen Zelllinien und etablierten Tumoren in der bukkale Schleimhaut von Mäusen. Wir optimieren Kollagenase-basierte Tumor-Verdauung-Methoden für die optimale Verwertung von Einzelzellen aus etablierten Tumoren. Die hier vorgestellten Daten zeigen, dass Mäuse stark vaskularisierte Tumoren entwickeln, die in regionalen Lymphknoten metastasieren. Einzellige multiparametric Masse Zytometrie Analyse zeigt die Anwesenheit von verschiedenen immun Bevölkerungsgruppen mit myeloische Zellen repräsentieren den Großteil aller Immunzellen. Das Modell in dieser Studie vorgeschlagen hat Anwendungen in der Krebsbiologie, Tumorimmunologie und präklinischen Entwicklung neuer Therapeutika. Die Ähnlichkeit des orthotopen Modells zur klinischen Merkmale menschlicher Erkrankungen bieten eine Tool für verbesserte Übersetzung und verbesserte Behandlungsergebnisse.
Introduction
LOKAL ist die fünft häufigste Malignom weltweit, mit über 600.000 Patienten diagnostiziert jährlich1. Trotz der aggressiven Behandlung mit Chemotherapie und Strahlentherapie (RT) bleibt die allgemeine Überlebensrate (OS) für lokal Patienten ohne human Papilloma Virus (HPV) Infektion unter 50 % nach 5 Jahren2. Dies ist weitgehend auf eine hochkomplexe Tumor Mikroumgebung zurückzuführen, wie Tumoren ihren in mehreren unterschiedlichen anatomischen Standorten innerhalb der Kopf-Hals-Region Ursprung können, einschließlich bukkale Schleimhaut, Zunge, Boden des Mundes, Nasenhöhle, Mundhöhle, Rachen, Oropharynx und Hypopharynx. Darüber hinaus die Kopf-Hals-Bereich ist stark durchblutet und enthält fast die Hälfte aller Lymphknoten im Körper3. Ein Großteil der Studien zur Untersuchung von Kopf und Hals Tumorbiologie setzen auf Tumormodellen im Großraum Flanke. Solche Modelle bieten Einblick in Tumor-inneren Mechanismen, aber der Mangel an einheimischen Kopf- und Halskrebs Mikroumgebung kann die translationale Potenzial solcher Befunde erheblich beeinträchtigen. Eine Methode, die verwendet wurde, um orale Tumoren induzieren ist durch den Kontakt mit dem Karzinogen 9,10-Dimethyl-1,2-Benzanthracene (DMBA)4. Jedoch diese Methode zugeordnet ist ein langwieriger Prozess, induziert Tumoren bei Ratten und Hamster, aber nicht bei Mäusen, und die daraus resultierenden Tumoren besitzen nicht viele der histologischen Merkmale von differenzierten SCCs5,6. Die Einführung der carcinogen4-Nitroquinoline 1-oxid (4-Blessings), ein wasserlösliches Chinolon-Derivat, Maus orale Tumoren bei mündlich ergab aber auch litt lange Belichtungszeiten (16 Wochen) und eine begrenzte nehmen Rate innerhalb und zwischen den einzelnen Chargen von Mäusen7,8,9. Mehrere Gruppen genutzt um klinisch relevante Modelle zu entwickeln, gentechnisch hergestellten Modelle mit der Manipulation der Fahrer Onkogene oder Tumor-Suppressor-Gene, darunter TP53, TGFB, KRAS, HRAS und SMAD410. Diese Modelle bieten Einblick in Tumoren mit bekannten Fahrer Gene aber nicht rekapitulieren die komplexen Heterogenität des menschlichen HNSCCs.
In dieser Arbeit zeigen wir Ihnen die Möglichkeit der Durchführung einer intramucosal Impfung Plattenepithelkarzinom Zellen in Mäusen. Beimpfte Zellen entwickeln sich zu aggressive Tumoren innerhalb 1 Woche nach der Injektion. Ähnlich wie bei menschlichen HNSCCs, die Tumoren metastasieren in die regionalen Lymphknoten. Wir charakterisieren histologischen und klinischen Merkmale der Krankheit und geben Einblick in den Tumor immun Mikroumgebung. Wir schlagen vor, dass dieses orthotopen Modell der lokal Anwendungen in der Krebsbiologie, Tumorimmunologie und präklinischen Studien hat. Mechanismen des Immunsystems ausweichen, Tumorprogression, Therapieresistenz und Metastasen repräsentieren Bereiche von klinischer Bedeutung, der über das vorgeschlagene Modell angesprochen werden können.
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Protocol
Alle tierische Verfahren wurden nach einem genehmigten institutionelle Tier Pflege und Verwendung Ausschuss (IACUC) Protokoll von der University of Colorado Denver (Protokoll Nr. 00250) durchgeführt.
1. Tumor Zellkultur
Hinweis: B4B8 und LY2 Zelllinien wurden zur orthotopen lokal Tumoren zu generieren: B4B8 Tumorzellen stammen aus Karzinogen-transformierten Schleimhaut Keratinozyten (von BALB/C Mäuse)11. LY2 Tumorzellen stammen aus Lymphknoten-Metastasen von einem spontan transformierte BALB/C Keratinozyten Linie (Pam 212)12,13. Beide Zelllinien wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Nadarajah Vigneswaran (UTHealth, Houston, TX, USA).
- Verwendung Dulbecco geändert Adlers mittlere (DMEM) F/12 mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % antimikrobielle Reagenz für die Zelle Linie Wartung ergänzt. Diese Zell-Linien in einem sterilen Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2zu erhalten. Zellen sollten für die Impfung vor mehr als 15 Passagen verwendet werden.
- Platte 2 x 106 bis 4 x 106 Zellen in 175 cm2 Zellkulturflaschen.
Hinweis: Sicherzustellen, dass die Zellen weniger als 90 % Zusammenfluss, induzieren eine Stress-Reaktion zu vermeiden. - Wenn die Zellen sind 70 % Zusammenfluss (~ 48 h), den Kolben aus dem Inkubator zu entfernen und waschen Sie die Zellen 3 X mit kalten Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
- Lösen Sie die Zellen aus der Flasche mit 0,25 % Trypsin, genug um die Oberfläche der Platte zu decken.
- Dazu 4 mL Trypsin in einem 175 cm2 Kolben mit 70 % konfluierende Zellen zu verzichten. Inkubation der Zellen mit Trypsin für 3 – 4 min. in die Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2.
- Visualisieren Sie die Zellen unter dem Mikroskop zu Zelle Loslösung zu gewährleisten.
- Fügen Sie 12 mL DMEM F/12 Medien mit FBS Trypsin Aktivität zu neutralisieren.
- Aspirieren Sie die Zellsuspension und legen Sie es in ein 50 mL konische Röhrchen.
- Schütteln Sie das Röhrchen mit der Zellen durch invertieren sie 3 x-4 X.
- Optional mischen Sie eine aliquote 10 µL Zellsuspension mit 10 µL Trypan blau in einem Microcentrifuge Schlauch und zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer. Bestimmen Sie Zellviabilität durch Subtraktion der Zahl der Trypan-blau-positiven Zellen von der Gesamtzahl der Zellen zu und teilen Sie durch die Gesamtzahl der Zellen.
- Zentrifugieren der Zellsuspension bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C.
- Aufschwemmen der Zellen in serumfreien und antibiotikafreien DMEM bei einem entsprechenden Volumen, so dass 1 x 106 Zellen in 50 µL Medien vorhanden sind.
Hinweis: Basierend auf der in-vivo Zelle Zeile Aggressivität (empirisch ermittelt), 1 x 106 Zellen pro Injektionsstelle per Mausklick war angemessen für B4B8 und LY2 Zellen. - Legen Sie das Fläschchen mit der Zellsuspension auf Eis.
- Legen Sie die vorher aufgetaut Basalmembran Matrix auf Eis.
Hinweis: Die Basalmembran Matrix wurde bei 4 ° c über Nacht aufgetaut.
(2) Zelle Injektion in Mäuse
- Bereiten Sie eine 1:1 Mischung von Zellen: Keller Membran Matrix (50 µL).
- Zuerst die Zellen hinzufügen; dann allmählich pipette die Basalmembran-Matrix. Einführung von Luftblasen zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die Mischung sofort vor den tierischen Injektion erfolgt. Hinzufügen von Zellen zu Basalmembran Matrix für einen längeren Zeitraum hinweg kann in Zelle der Matrix-Mischung, die die Mischung gründlich schütteln erschwert sich einleben führen. Dadurch wird eine erhebliche Variabilität in Größe des Tumors zwischen Mäusen.
- Mischen Sie vorsichtig. Stellen Sie sicher, dass alle Schritte mit Matrix auf Eis durchgeführt werden. Basalmembran Matrix wird bei Raumtemperatur polymerisieren.
- Inokulation Spritzen vorbereiten.
- 0,5 mL Insulinspritzen (23 G) mit 100 µL der Zelle/Keller-Membran-Matrix-Lösung zu laden.
- Halten Sie die Spritzen auf Eis, Basalmembran Matrix Polymerisation zu vermeiden.
- Mäuse zu betäuben, indem man sie in eine Kammer mit Isofluran und Sauerstoff (2,5 %).
- Sicherstellen Sie, dass die Mäuse tief betäubt sind, vor der Durchführung der Injektion (dadurch ein Ausbleiben einer Reaktion auf eine Zehe Prise).
- Stechen Sie die Nadel in der rechten oder linken bukkal Region. Dies erfolgt durch den verfügbaren Freiraum auf beiden Seiten des Mundes.
- Stellen Sie sicher, dass die Maus Zunge nicht im Weg ist.
Hinweis: Es ist leicht auf die Zunge, stecken die Zunge Tumoren führt. Wenn nötig, verschieben Sie die Zunge auf die gegenüberliegende Seite. - Halten Sie die Spritze parallel zu der bukkalen Bereich während innerhalb der Mundhöhle.
- Wenn Sie bereit sind, zu injizieren, ziehen Sie die Spritze zurück und legen Sie die Spritze langsam in einem Winkel von 10°.
- Injizieren von 100 µL der Zelle/Keller Membran Matrix Suspension über einen Zeitraum von 5 s.
- Halten Sie die Spritze für weitere 5 s, um das gesamte Material zu gewährleisten wird injiziert.
Hinweis: Injizieren Sie eine Mischung aus serumfreie Medien und Matrix für Kontrolle Nontumor-tragenden Mäusen (wie oben beschrieben) ohne die Tumorzellen. - Die Spritze vorsichtig zurückziehen.
- Das oben beschriebene Verfahren mit den übrigen Mäusen weiter.
- Für 1 Woche bis Tumoren beginnen zu grob erscheinen lassen (50-200 mm3 für B4B8 und LY2 Zellen).
3. Überwachung der Maus
- Führen Sie die erste Messung mit Bremssättel auf 1 Woche nach der Injektion Tumor Zelle. Um das Tumorvolumen mit externen Bremssättel zu berechnen, bestimmen Sie die größte längs-Durchmesser (Länge) und dem größten Querdurchmesser (Breite) und verwenden Sie die modifizierte Ellipsoid Formel14,15.
- Weiterhin regelmäßige Bremssattel Messungen für Tumorvolumen (1 x-2 x pro Woche in regelmäßigen Abständen) ausführen.
- Messen Sie Tier Gewicht über die Auswirkungen des Tumorwachstums zu füttern.
4. Ernte Tumoren
- Wenn der experimentellen Endpunkt erreicht ist, einschläfern Sie die Tiere durch geeignete Maßnahmen (z. B. CO2 Erstickung, Enthauptung oder zervikale Dislokation).
Hinweis: In dieser Studie wurde der Endpunkt erreicht, wenn die Mäuse moribund wurden (mit einem Gewichtsverlust von > 15 % ihres ursprünglichen Gewichts, ein Mangel an Pflege, Kachexie) und/oder wenn die Größe des Tumors 1.000 mm3erreicht. -
Zerlegen das Tier durch die Schaffung eines langen Schnitt durch die Mittellinie in der Hals-Region zu beginnen.
- Verwenden Sie stumpfe Pinzette zu greifen die Haut und einer scharfen Schere zum Schneiden der Haut.
- Legen Sie die Schere vorsichtig unter die Haut über dem Tumor und schaffen Sie Lufteinschlüsse zu, indem man die Schere über und in die Haut.
- Sobald die Haut ausreichend abgetrennt aus dem Tumor ist, identifizieren Sie die drainierenden Lymphknoten (DLNs) und Verbrauchsteuern Sie, um zu vermeiden, dass das Tumorgewebe durch die Anwesenheit von Lymphknoten verwechselt.
Hinweis: Große Tumoren können zu erreichen und/oder decken die DLN. Je nach Art des Tests, die durchgeführt wird unbedingt die Isolierung intakt Lymphknoten Auslaufen von Immunzellen in den Tumor zu vermeiden, die Schiefstellung der Untersuchungsergebnisse zur Folge. - Die Grenzen des Tumors durchtrennt, bis das gesamte Volumen gelöst ist.
(5) Tumor Verarbeitung für Downstream-Anwendungen
- Legen Sie für die nachgeschalteten histologische Prüfung Tumoren in 10 % Formalin bei Raumtemperatur. Um Overfixation zu vermeiden, ersetzen Sie die Formalin mit 70 % Ethanol. Verarbeiten Sie für Flow-Zytometrie-Analyse die Tumoren wie unten beschrieben.
Hinweis: Das Gewebe kann in Formalin für 72 h gehalten werden, bevor Overfixation für bestimmte Arten der Färbung problematisch werden kann. - Den Tumor in 1 – 2 mm geschnitten-große Stücke mit einem sterilen Rasierklinge oder einem scharfen Schere.
- Legen Sie die Stücke geschnittenen Tumor in einem 50 mL konische Röhrchen mit Kollagenase III (4.250 Einheiten pro Probe), DNase I (0,1 mg pro Probe) und Trypsin-Inhibitor (1 mg pro Probe).
- Inkubation bei 37 ° C für 30 min mit schütteln alle 10 Minuten.
Hinweis: Die Proben können in einem wiederverschließbaren Beutel mit 90 % Ethanol sterilisiert und in eine Zelle Kultur Inkubator platziert werden. - Fügen Sie nach 30 min 20 mL Hank Salzlösung (HBSS) und Spin bei 300 X g für 5 min ausgeglichen.
Hinweis: HBSS besteht aus Kaliumchlorid, Natriumchlorid, Natrium Bicarbonat, Diabas-Natriumphosphat, Natriumphosphat monobasic und Glukose. - Den Überstand verwerfen und das Pellet in 2 – 3 mL Erythrozyten (RBC) Lysis Puffer Aufschwemmen. Pipette rigoros.
Hinweis: RBC Lyse Puffer besteht aus Ammoniumchlorid, Natriumbicarbonat und Binatrium. - 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.
Hinweis: Längere Inkubationszeit kann giftig für andere Zell-Populationen. - Fügen Sie 20 mL HBSS, die Wirkung der Lyse Puffer zu neutralisieren.
- 300 X g für 5 min Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
- Das Pellet in 10 mL HBSS aufzuwirbeln.
- Übergeben Sie die Lösung durch einen 70 µm Nylon einschränkende und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min. Überstands verwerfen.
- Wiederholen Sie die Schritte 5,8 – 5.10 und übergeben Sie die Zellsuspension durch eine 40 µm Nylon Restrainer um sicherzustellen, dass jegliche zusätzliche Ablagerungen aus der Suspension entfernt wird.
6. Zelle Färbung und Datenerfassung
- Die Zelle Pellet in 1 mL HBSS aufzuwirbeln.
- Zählen der Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer oder einem automatisierten Zelle Zähler, wie unter Schritt 1,7
-
Bestimmen Sie die gesamte Zellzahl und geeignete Konzentration zum Beizen.
Hinweis: die ideale Zellkonzentration für Flow Cytometry Färbung ist 1 Million Zellen. Zum Beispiel wenn Färbung in einer 96-Well-Platte erfolgt, und es 10 Millionen Zellen gibt, Aufschwemmen der Probenmaterials in 1 mL und Platte 100 µL für 1 Million Zellen pro Bohrloch. -
Fügen Sie Fc Block (CD16/CD32) in einer Konzentration von 1: 100, um Nonantigen-spezifische Bindung von Immunglobulinen, die FcγIII und FcγII-Rezeptoren zu verhindern. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Zentrifugieren und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 100 µL Flow Cytometry Zelle Färbung Puffer (bestehend aus Kochsalzlösung mit 5 % FBS, 2 % EDTA und 1 % HEPES).
-
Durchführen Sie Zelloberfläche Färbung nach Lieferanten bereitgestellten Anweisungen (Hinzufügen von jeder Antikörper bei der entsprechenden Verdünnung). 60 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Zentrifugieren und die Zelle Pellet in 100 µL HBSS Aufschwemmen. Wiederholen Sie 2 X get rid of überschüssige Antikörper.
-
Laufen Sie auf eine entsprechende Durchflusszytometer Proben.
- Wenn intrazelluläre Marker (z. B. foxp3) zu analysieren, führen Sie Zelle Permeabilisierung und Färbung gemäß den Anweisungen des Lieferanten.
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Representative Results
Die in-vitro-Beurteilung der Zellproliferation LY2 und B4B8 haben gezeigt, dass beide Zelllinien ähnliche Verdoppelung Zeiten (21 h und 23 h, beziehungsweise). In-vivo, beide Zelllinien gebildet eine einzelne, sichtbare und fühlbar Masse innerhalb 1 Woche nach der Impfung (Abbildung 1A). Bei Mäusen mit LY2 Tumoren wurde der Kiefer von 3 Wochen wegen Tumorlast (Abbildung 1A) abgelöst. Kontroll-Mäusen, die keine Tumorzellen erhielten entwickeln nicht Tumoren wie erwartet. LY2 Tumoren wuchs zu einem höheren Preis im Vergleich zu B4B8 Tumoren. Die durchschnittliche Tumorvolumen am Tag 21 in LY2 Tumor-tragenden Mäusen wurde 632 ± 10 mm3 im Vergleich zu 162 ± 4 mm3 bei B4B8 Tumoren (Abbildung 1 b). Mäuse, die ausstellenden Kiefer Verschiebung schnell entwickelten Gewichtverlust wegen Dysphagie (Abbildung 1). Mäuse ausstellenden erheblichen Gewichtsverlust definiert als > 15 % ihres ursprünglichen Gewichts und/oder mit einem Tumorvolumen von > 1 cm3 wurden innerhalb eines Tages die bekannte Beobachtung eingeschläfert. Die mediane Überlebenszeit bei LY2 Mäusen war 22,5 Tage, im Vergleich zu 52,0 Tage in B4B8 Tumor-tragenden Mäusen (Abbildung 1).
Magnetresonanztomographie (MRT) des Tumor-tragenden Mäusen zeigte gut abgegrenzte Tumoren erstreckt sich in die innere Schicht der bukkale Schleimhaut (Abbildung 2A). Tumoren nicht in der Zunge oder anderen nahe gelegenen Organen (Speiseröhre, Bronchus, Thymus) einzudringen, wie histologische Bewertung dargestellt. Signal-Heterogenität auf MRT-Bilder war Vertreter der Anwesenheit von vaskularisierte hyperintens (gekennzeichnet mit V) und nekrotische Hypointense Regionen (mit N bezeichnet) (Abbildung 2A). Eine grobe pathologische Untersuchung zeigte erweiterten DLNs (Abb. 2 b). Wir bewerten weiter Tumorvolumen mit der Computertomographie (CT), um die Zuverlässigkeit der Bremssattel Messungen bestimmen. Tumoren wurden mittels digitaler Bildbearbeitung und Kommunikation in Medicine (DICOM) Bild-Analyse Software16abgegrenzt. Beurteilung der LY2 Tumorvolumen von Bremssätteln und CT-Bildgebung zeigte eine ausgezeichnete Korrelation zwischen den beiden Methoden (R2 = 0.8493; Abbildung 2). Dies bedeutet, dass Tumorwachstum in erster Linie Exophytic ist und Bremssattel-Messung eine zuverlässige Methode für die Bewertung des Tumorwachstums ist. Histologische Untersuchung zeigte, dass alle LY2 Tumor-tragenden Mäusen schlecht entwickelte Squamous Zelle Krebsgeschwür (Bild 2D) unterschieden. Neun von neun LY2 Tumor-tragenden Mäusen entwickelt Metastasen in die Lymphknoten der ersten und zweiten Echelon. Nodal Metastasen waren in erster Linie subkapsuläre (mit sieben von neun Mäuse) und innerhalb der Nasennebenhöhlen (mit fünf von neun Mäuse), mit zwei von neun Mäusen demonstriert Intrakapsuläre Invasion. Im Gegensatz dazu Mäuse mit B4B8 Tumoren entwickelt mäßig differenzierte Plattenepithelkarzinome (Abb. 2E) und nicht an regionale oder entfernte Standorte metastasieren, einschließlich DLNs. Nekrose wurde beurteilt, basierend auf einer vorher festgelegten drei-Klasse Skala: 0 = keine sichtbare Nekrose, 1 = kaum, 2 = mäßig und 3 = schwere17. Alle LY2 Tumor-tragenden Mäusen hatten histologisch Nekrose mit der Mehrheit (sieben von zehn) zeigen mäßiger bis schwerer Nekrose (Abb. 2F) bestätigt. Keine Hinweise auf Nekrose bei B4B8 Tumoren beobachtet.
Wir konzentrieren auf das LY2-Tumor-Modell zur weiteren Charakterisierung von Tumor-Immunantwort Mikroumgebung. Tumoren wurden 3 Wochen nach der Inokulation Tumor geerntet und verdaut mit Kollagenase III, gefolgt von der Färbung der Zelloberfläche und intrazellulären Marker für Strom/Masse Zytometrie (Abb. 3A). Proben wurden mit einer Masse Cytometer an der University of Colorado Denver Flow Cytometry Shared Resource verarbeitet. Herbeirufung und Datenanalyse wurden mit Flow Cytometry kommerzieller Software durchgeführt. Die gewonnenen Daten zeigte die Anwesenheit von zahlreichen Immunzelle Populationen in unterschiedlichem Maße. Insgesamt Immunzellen (CD45+) 7,3 % des gesamten Tumors (Abb. 3 b) vertreten. In absoluten Zahlen, beobachteten wir im Durchschnitt 26 CD45+ Zellen (SD = 0,81) pro Milligramm des Tumorgewebes (Abb. 3 b). Myeloische Zellen (CD11b+) vertreten alle CD45 37,8 %+ Zellen (Abbildung 3). Myeloische Zellen wurden weitgehend bestehend aus Makrophagen (F4 / 80 + 63,0 %), gefolgt von myeloischen abgeleitet Suppressor-Zellen (MDSCs) (Gr1 + 8.51 %) und Neutrophile (Ly6G + 5.87 %). Gesamt-T-Zellen enthalten 15,9 % der CD45+ mit CD4-Zellen die Mehrheit aller T-Zellen (79,4 %) bestehend aus+ T-Zellen, welche 53,4 % waren regulatorischen T-Zellen (Tregs) (CD4+FoxP3+) (Abbildung 3D). Natürliche Killerzellen (NK) umfasste alle CD45 1,75 %+ Zellen. Diese Daten zeigen die Anwesenheit von verschiedenen immunen infiltriert in LY2 orthotopen lokal Tumoren, die wahrscheinlich eine Rolle bei der Vermittlung der Tumorprogression und immun ausweichen.
Abbildung 1: Überwachung von Mäusen mit orthotopen lokal Tumoren. (A) repräsentative Bilder von Tumor-tragenden Mäusen. Die beimpften bukkal entwickelt sich einen Tumor innerhalb 1 Woche nach der Impfung. Nach 3 Wochen wird die Verschiebung des Kiefers beobachtet. (B) Tumor Wachstumsrate bei B4B8 und LY2 Tumor-tragenden Mäusen durch Bremssattel Messungen bestimmt. (C) Änderungen des Körpergewichts von Mäusen mit B4B8 oder LY2 Tumoren. (D) Überleben von B4B8 und LY2 Tumor-tragenden Mäusen. Die Balken repräsentieren den Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von 7 – 10 Mäusen pro Gruppe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Imaging und histologischen Merkmale der murinen lokal Tumoren. (A) repräsentative koronale MR-Bild einer LY2 Tumor-tragenden Maus. Anatomische Websites sind beschriftet. Bereiche des Signal Hyperintensity darstellen vaskularisierte Regionen (V bezeichnet). Regionen der Signal Hypointensity nekrotischen Bereiche darstellen (bezeichnen N). (B) repräsentative grobe Bild einer seziert Tumor-haltigen Region. Weiße Pfeile zeigen auf vergrößerte Lymphknoten (DLNs). (C) Korrelation von Tumorvolumen wie Bremssattel Messung im Vergleich zu Computertomographie (CT) bewertet-Beurteilung. Neigung, Korrelationskoeffizient (R2) und Ausgleichsgerade werden angezeigt. (D) repräsentative Hämatoxylin und Eosin (H & E) Bild von LY2 Tumor. (E) Vertreter H & E Bild B4B8 Tumor. (F) Quantifizierung der Nekrose in LY2 Tumoren, basierend auf einem H & E vier hochwertigen scoring-System. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Analyse der Baseline intratumorale immun Populationen mit Cytometry durch Time-of-Flight (CyTOF). Tumoren wurden in eine einzelne Zelle Suspension mit Kollagenase-basierte enzymatische Verdauung verarbeitet und dann gefärbt mit Zelle Oberfläche und intrazellulären Marker. (A) Masse Zytometrie erfolgte mittels der CyTOF-Plattform. (B) Absolute und relative quantitative Bewertung der gesamten Immunzellen (CD45+). (C) Quantifizierung der myeloischen Immune Subpopulationen. (D) Quantifizierung der lymphoiden Subpopulationen immun. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Genaue Analyse und Charakterisierung von Tumor Mikroumgebung repräsentieren eine wichtige Strategie für Verständnis Mechanismen der Tumorentstehung, Progression und Metastasen und für die Entwicklung von wirksamen Therapien. Kopf-Hals-Tumoren ist eine komplexe Erkrankung, die aus mehreren anatomischen Standorten innerhalb der Kopf-Hals-Region stammen kann. Ein wesentliches Hindernis für das Verständnis der Krankheitsmechanismen und Verbesserung der Therapie wurde ein Mangel an murine Maus-Zell-Linien, die die aggressive und metastasierten Natur des menschlichen HNSCCs ähneln. Darüber hinaus beschäftigen zahlreiche murinen Modelle eine subkutane Implantation von Tumoren, die wichtige physiologische Funktionen der Kopf-Hals Region, einschließlich eine hohe Gefäßdicke, eine umfangreiche lymphatischen Gefäßsystem und resident Schleimhaut Flora fehlen.
In dieser Studie gekennzeichnet wir eine Orthotopic Modell der murinen lokal. Wir entschieden uns für die bukkale Schleimhaut als Standort des Tumor-Impfung für eine Reihe von Gründen, einschließlich der Anbindung an die Region ohne die Notwendigkeit für Bildführung, die Fähigkeit, Tumorwachstum mit Bremssättel, das Vorhandensein des Tumors innerhalb der Schleimhaut Flora, beurteilen die Vorhandensein von umgebenden Lymphgefäße, und die Leichtigkeit der Reproduzierbarkeit. Obwohl die Injektion von Zellen in die bukkale Schleimhaut sehr einfach ist, die Positionierung der Nadel und der Eindringtiefe sind entscheidend für die Punktion durch die Haut zu verhindern und sicherzustellen, dass die Zellen nicht subkutan injiziert werden. Wir empfehlen intra-oral Nadel einsetzen, während es perfekt parallel zu den bukkalen Region ist und Kippen in einem Winkel nicht größer als 10 ° Wenn Sie bereit sind, zu injizieren.
Die Zelllinien verwendeten wir waren murinen Zell-Linien, so dass ihre Implantation bei immunkompetenten Mäusen von der Belastung, die, der Sie von abgeleitet wurden. Es gibt mehr als 39 lokal humanen Zelllinien, die in der Literatur untersucht worden, aber nicht in der Gegenwart eine native Mikroumgebung18verwendet werden. Jüngsten Entwicklungen dürfen für die Gestaltung der humanisierte Mausmodelle die menschlichen Knochen Knochenmark gewonnenen Chimären in NOD scid Gamma Mäuse (auch bekannt als NSG Mäuse), integrieren soll die Entwicklung eines menschlichen Immunsystems, die Interaktion mit menschlichen Tumoren in einem immungeschwächt Maus Modell19. Aber solche Modelle sind teuer, erfordern aufwändige Zuchtmethoden und nicht alle Komponenten des Tumor-Mikroumgebung, einschließlich Endothelzellen, Fibroblasten und Lymphbahnen rekapitulieren. Der murinen Maus-Modellen, die wir in dieser Studie beschäftigt rekapitulieren kritische Komponenten des menschlichen HNSCCs, einschließlich das Vorhandensein von verschiedenen immun Infiltrate. Um maximale Abruf von lebensfähigen einzelne Zellen von Tumoren zu gewährleisten, ist die Verwendung der Verdauung Enzyme notwendig. Kollagenase-basierte Verdauung Enzyme können hart sein, auf Zellen und die Optimierung der Konzentration und Art der Kollagenase kann für verschiedene Tumorarten notwendig sein. Wir haben fünf Verdauung Enzyme vor der Bestimmung, dass die Kollagenase III, die in dieser Studie verwendet wurde, ist die optimale Methode für die Verdauung von Plattenepithelkarzinom Tumoren verglichen.
In dieser Studie verwendeten Tumor-Modelle sind besonders nützlich für Studium Mechanismen der lokal immun ausweichen und präklinische Bewertung der verschiedenen Therapien. Wir zeigten bisher, dass B4B8 und LY2 Tumoren radioresistenten und feuerfesten immun Checkpoint Inhibitor Anti-PD-L120. Dies steht im Einklang mit der Mehrheit der menschlichen HNSCCs. Neue klinische Studien zeigten, dass weniger als 15 % der Patienten lokal auf Anti-PD-1/PD-L1-Therapie21,22,23,24,25reagieren. Darüber hinaus ist es auch festgestellt, dass HNSCCs radioresistenten26,27. Targeting Wege verantwortlich für Radioresistance im Lokal ist ein wichtiger Schritt zur Verbesserung der Behandlungserfolg. Das Wahrzeichen studieren Bonner Et Al. zeigten einen signifikanten Vorteil im Gesamtüberleben mit der Zugabe von Cetuximab zu RT RT allein im lokal fortgeschrittenen lokal Patienten28gegenüber. Neuere Daten zeigen, dass die Hemmung der EphB4-Ephrin-B2-Signalisierung im orthotopen HNSCCs die Reaktion auf RT oder Cetuximab-RT weiter verbessern kann, durch die Förderung Tumor Apoptose und Hemmung der Tumor Verbreitung29,30. RT mit rationalen Immuntherapien kombinieren kann darüber hinaus ergänzen Antitumor-Immunantworten und Verbesserung der lokalen Tumorkontrolle und Kontrolle von Fernmetastasen31. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass targeting Tregs in Kombination mit immun Checkpoint Blockade und RT Beseitigung der Tumor und immunologischen Gedächtnis32führt. Zukünftige Studien beschäftigt orthotopen Modelle von lokal besser informiert das Design von klinischen Studien und verbessern das Verständnis der Mechanismen der Tumor immun Steuerhinterziehung und Therapieresistenz.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
nichts
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase III | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | |
| DNase I | Worthington Biochemical Corp. | LS006328 | |
| Fc Block (CD16/32) | BD Biosciences | 553141 | Clone 2.4G2 |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no pheno red |
| Helois mass cytometer | Fluidigm | NA | |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB-40234B | |
| MRI Scanner | Bruker | NA | 7.4 Tesla |
| RBC lysis buffer | BioLegend | 420301 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington Biochemical Corp. | LS002830 |
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