Summary
Nuoto indotta paralisi (SWIP) è un'analisi comportamentale consolidata utilizzata per studiare i meccanismi di fondo di dopamina segnalazione in Caenorhabditis elegans (c. elegans). Tuttavia, manca un metodo dettagliato per eseguire il test. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per SWIP.
Abstract
Il saggio di nuoto descritto in questo protocollo è un valido strumento per identificare le proteine che regolano il dopaminergico sinapsi. Simili ai mammiferi, dopamina (DA) controlla diverse funzioni in c. elegans , tra cui attività di apprendimento e motore. Condizioni che stimolano il rilascio di DA (per esempio, trattamenti di anfetamina (AMPH)) o che impediscono DA liquidazione (ad es., gli animali manca il trasportatore DA (dat-1) che sono in grado di reaccumulating DA nei neuroni) generare un eccesso di extracellulare DA che si traduce nella locomozione inibito. Questo comportamento è particolarmente evidente quando animali nuotare in acqua. Infatti, mentre animali di selvaggio-tipo continuano a nuotare per un periodo prolungato, dat-1 mutanti e wild-type trattati con AMPH o inibitori del trasportatore DA depositano sul fondo del pozzo e non si muovono. Questo comportamento viene definito "Nuoto indotta paralisi" (SWIP). Anche se il dosaggio SWIP è ben consolidato, una descrizione dettagliata del metodo è carente. Qui, descriviamo una guida dettagliata per eseguire SWIP. Per eseguire il test, tardi larvali fase-4 animali sono posti in una lastra di vetro posto contenente soluzione di saccarosio di controllo con o senza AMPH. Gli animali sono notati per il loro comportamento di nuoto o manualmente da visualizzazione sotto uno stereoscopio o automaticamente registrando con una telecamera montata sullo stereoscopio. Video vengono poi analizzati utilizzando un software di monitoraggio, che produce una rappresentazione visiva di frequenza thrashing e paralisi sotto forma di mappe di calore. Entrambi i sistemi manuali e automatizzati garantiscono una lettura facilmente quantificabile di abilità nel nuoto degli animali e quindi facilitano lo screening per gli animali recanti mutazioni all'interno del sistema dopaminergico o per geni ausiliari. Inoltre, SWIP utilizzabile per delucidare il meccanismo d'azione dei farmaci di abuso come AMPH.
Introduction
Animali eseguono una serie di comportamenti innati e complessi che sono mediati da diversi neurotrasmettitori coordinati da intricati processi di segnalazione. Il neurotrasmettitore dopamina (DA) media comportamenti altamente conservati tra le specie, compreso l'apprendimento, la funzione di motore ed elaborazione di ricompensa.
C. elegans, il nematode del terreno con un sistema nervoso relativamente semplice e ben mappato consistente solo 302 neuroni, Mostra comportamenti marcatamente complessi, compreso molti che sono disciplinati DA come accoppiamento, apprendimento, foraggiamento, locomozione e deposizione delle uova 1. tra le altre caratteristiche, ciclo di vita breve, facilità di manipolazione e la conservazione delle molecole di segnalazione, evidenziare i vantaggi dell'utilizzo di c. elegans come modello per studiare le basi neurali dei comportamenti conservati.
L'Ermafrodito di c. elegans contiene otto neuroni dopaminergici; Oltre a questi, il maschio contiene sei paia supplementare per scopi di accoppiamento. Come nei mammiferi, questi neuroni sintetizzano DA ed esprimere il trasportatore DA (DAT-1), una proteina di membrana presenti esclusivamente nei neuroni dopaminergici, che trasporta DA rimessi nella fessura sinaptica in neuroni dopaminergici. Inoltre, la maggior parte delle proteine coinvolte in ogni fase di sintesi e rilascio di DA imballaggi sono altamente conservata tra vermi e gli esseri umani e, come nei mammiferi, DA modula alimentazione comportamenti e locomozione in c. elegans2.
C. elegans per indicizzazione su superfici solide e nuota con un comportamento caratteristico thrashing in acqua. È interessante notare che, mutanti privi di espressione di DAT-1 (dat-1) scansione normalmente su superficie solida ma non riescono a sostenere nuoto quando immerso in acqua. Questo comportamento è stato definito nuoto indotta paralisi o SWIP. Precedenti esperimenti hanno dimostrato che SWIP, in parte, è causata da un eccesso di DA nella fessura sinaptica che in ultima analisi overstimulates i recettori postsinaptici D2-like (DOP-3). Anche se originariamente identificato nel dat-1 knockout animali3, SWIP è osservato anche in animali trattati con farmaci che bloccano l'attività del DAT (ad es., imipramina4) e/o indurre il rilascio di DA (ad esempio, anfetamina5). D'altra parte, manipolazioni farmacologiche o genetiche evitanti la sintesi ed il rilascio di DA e blocco della funzione del recettore DOP-3 prevenire SWIP6. Presi insieme, questi dati già pubblicati hanno stabilito SWIP come uno strumento affidabile per studiare gli effetti del comportamento causati da proteine mutate entro dopaminergici sinapsi3,4,7 e possono essere impiegati per avanti schermi genetici per l'identificazione dei nuovi meccanismi normativi nei DA segnalazione7,8,9,10,11,12. Inoltre, fornendo una lettura facilmente quantificabile di comportamento farmaco-indotta in animali viventi, SWIP consente la delucidazione dei meccanismi di azione delle droghe come anfetamina (AMPH) e azaperone presso dopaminergiche sinapsi5, 6 , 13 , 14 , 15.
Protocolli per eseguire i dosaggi SWIP sono state descritte prima16. Qui, descriviamo dettagliatamente la metodologia e il programma di installazione per eseguire l'analisi con l'obiettivo di fornire una guida visiva per la comunità di c. elegans svolgere efficacemente SWIP.
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Protocol
1. preparazione delle soluzioni e dei Media
- Preparare il tampone di M9 sciogliendo KH2PO4 3,0 g (22,05 mM), Na2HPO4 6,0 g (42,2 mM) e NaCl 5.0 g (85,5 mM) in 1 L di acqua deionizzata in autoclave. Aggiungere 1,0 mL di 1 M MgSO4 (12 g in un volume finale di 100 mL di acqua deionizzata in autoclave) dopo la sterilizzazione in autoclave. Mix 100 mL di 10 x risultante M9 con 900 mL di sterilizzato nell'autoclave acqua deionizzata per rendere una soluzione 1x.
- Per rendere il buffer di uovo, sciogliere 6,896 g di NaCl (118 mM), 3,578 g di KCl (48 mM), 0,294 g di CaCl2-2 H2O (2 mM), 0,406 g di MgCl2-6 H2O (2 mM) e 5,958 g (25 mM) di HEPES in 1 L di acqua deionizzata in autoclave. Regolare il pH a 7.3 utilizzo NaOH.
- Preparare la soluzione di ipoclorito di sodio/NaOH fresco aggiungendo 1 mL di 5-6% di ipoclorito di sodio (candeggina) e 180 µ l di NaOH 10 N a 3,8 mL di acqua deionizzata.
- Pesare 60 g di saccarosio e sciogliere in acqua deionizzata in autoclave ad un volume finale di 100 mL per rendere la soluzione di saccarosio al 60%.
- Sciogliere 0,684 g di saccarosio in 10 mL di acqua deionizzata in autoclave per rendere saccarosio 200 mM. Controllare e regolare alla stessa un'osmolarità utilizzando Osmometro. Rendere le aliquote di 1 mL a 1,5 mL microcentrifuga e congelare a-20 ° C.
- Pesare 0,184 g di AMPH (peso molecolare 184.75 g/mol) e sciogliere in 10 mL di acqua deionizzata per rendere una soluzione stock di 100 mM. Mescolare 2 µ l di soluzione madre in 400 µ l di acqua per fare la soluzione di lavoro di 0,5 mM.
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Preparare nutrienti crescita piastre media (NGM)
- Mix 3 g di NaCl (52,65 mM), 20 g di peptone, 25 g di bacto-agar e 975 mL di acqua deionizzata in un matraccio di Erlenmeyer 2L. Includono un ancoretta magnetica ed autoclave (121 ° C, 15 PSI) per 1 ora con ciclo liquido.
- Raffreddare e mantenere la temperatura a circa 50 ° C posizionando il pallone su un radiatore continuando a mescolare. Aggiungere 0,5 mL di colesterolo (5 mg/mL in etanolo), 1 mL di 1 M MgSO4, 1 mL di 1 M CaCl2 e 25 mL di tampone di 1m potassio fosfato, pH 7,4 (108,3 g di KH2PO4, 35,6 g di K2HPO4 acqua deionizzata a 1 L).
- Pipettare 25 mL ciascuno in piastre di Petri di 100 x 15 mm e lasciare che i supporti a solidificare. Conservare le piastre capovolte a 4 ° C in una scatola per fino a 4 settimane.
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Preparazione del brodo di brodo (LB) di Lisogenesi
- Sciogliere 5 g di miscela della polvere LB in 200 mL di acqua deionizzata in un matraccio di Erlenmeyer. Ciclo di autoclave per 30 minuti utilizzando la sterilizzazione di liquida. Consentire il brodo si raffreddi. Conservare a temperatura ambiente per 1-2 settimane.
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Preparazione delle piastre batteriche NA22
- Utilizzare una pipetta sterile o un'ansa sterile batterica per inoculare una piastra LB con un piccolo volume di NA22 Escherichia coli batteri da Stock in glicerolo ed incubare la piastra capovolta in un incubatore a 37 ° C durante la notte per far crescere colonie isolate. Scegliere e introdurre una singola Colonia in 200 mL di brodo LB preparata al punto 1.8 e far crescere una notte a 37 ° C su una piattaforma d'agitazione.
- Per le piastre del seme, dispensare 200 µ l di coltura batterica sulle piastre NGM preparata in precedenza al punto 1.7 e si sviluppa con un bastone da hockey vetro sterile. Lasciate le piastre asciugare durante la notte o più a lungo sotto un cofano e conservare capovolta in una scatola ermetica a 4 ° C.
- Per rendere lo strumento ciglia/platino per prendere i vermi, colla una ciglia spesse o un filamento di platino in un bicchiere da Pasteur pipetta utilizzando colla super. Tagliare la punta del ciglio ad un angolo utilizzando una lama di rasoio. In alternativa, un bruciatore di Bunsen può essere utilizzato per fondere la punta della pipetta di vetro intorno il filamento di platino.
2. allevamento di c. elegans
Nota: Cultura di tipo selvatico N2C. elegans ceppo su Escherichia coli NA22 piastre. I metodi di cultura dettagliate sono descritti di seguito.
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Preparazione della cultura di vite senza fine
- Per rendere una coltura starter di vermi, tagliare un piccolo pezzo di agar da una piastra contenente animali ben nutriti e trasferirlo su un piatto di batteri NA22 Escherichia coli preparato al punto 1.9 usando una spatola sterile. Incubare le piastre a 20 ° C per 3-4 giorni. Microscopio stereo, confermare visivamente la presenza di adulti gravid.
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Preparazione della popolazione sincronizzata di vermi
- Raccogliere gravid adulti da almeno 2 piatti di erogazione dell'acqua deionizzata in autoclave tutto intorno la piastra utilizzando una spruzzetta. Agitare delicatamente la piastra per sloggiare i vermi e raccogliere i vermi in un tubo conico in polistirolo di 15 mL utilizzando una pipetta di plastica monouso.
- Rotazione verso il basso il tubo in una centrifuga a 140 x g per 2 minuti per pellet i vermi, poi aspirare il surnatante mediante una pompa a vuoto o con costruito nel vuoto di laboratorio.
- Risospendere e lavare i vermi da riempire il tubo con acqua deionizzata in autoclave e mix e centrifugare a 140 x g per 2 min. aspirare il supernatante e ripetere questo ultimo passo due volte o fino a quando i vermi sono chiare da batteri (acqua appare chiaro quando sono mescolati con i vermi).
- Aggiungere 5 mL di soluzione di ipoclorito di sodio preparata/NaOH (punto 1.3) al pellet di vite senza fine e mescolare rapidamente con un vortex. Incubare la provetta su un rocker per circa 4-8 min. Il tempo di incubazione con soluzione di ipoclorito di sodio/NaOH oscilla tra 4-8 minuti sulla base della qualità della soluzione stock di ipoclorito di sodio (candeggina).
- Mettere una goccia (2-50 µ l) di soluzione contenente vermi su un vetrino per microscopio e controllare ogni 2 min sotto il microscopio per lisi di verme. Quando circa il 70% dei vermi vengono lisate e uova vengono rilasciate, riempire il tubo con il tampone di uovo preparato al punto 1.2 e immediatamente Centrifugare per 1 min a 140 x g a pellet gli embrioni e le carcasse a vite senza fine.
- Aspirare il supernatante e lavare il pellet 3 più volte, il tubo di riempimento ogni volta con buffer di uovo. Si sono fermati a 140 x g per 1 min e rimuovere il supernatante ogni volta. Il pellet diventa bianco all'estremità di lavaggi.
- Dopo il lavaggio finale, è necessario separare gli embrioni dalle carcasse morte nella soluzione di saccarosio al 30%. Aggiungere 5 mL di acqua deionizzata in autoclave per il pellet, risospendere e aggiungere 5 mL di saccarosio al 60% preparata al punto 1.4. Mescolare accuratamente e centrifugare a 160 x g per 6 min.
- Utilizzare un pipetta Pasteur di vetro per trasferire gli embrioni fluttuante al menisco superiore in una provetta conica fresco 15ml. Non prendere più di 3-4 mL. Per rimuovere qualsiasi residuo saccarosio, lavare gli embrioni 3 volte con acqua in autoclave mediante centrifugazione a 140 x g per 3 min, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet (e il tubo di riempimento) ogni volta.
- Ripetere i lavaggi con 1 tampone di x M9. Dopo il lavaggio finale, risospendere il pellet in 10 mL di M9. Lasciare le provette in un agitatore durante la notte (non più di 14 h) per le uova si schiudono in larve L1. Vermi rimarrà in fase larvale L1 dovuta alla mancanza di cibo.
- Larve di lavare il L1 3 volte con acqua in autoclave per rimuovere qualsiasi feromoni rilasciati dalle larve mediante centrifugazione a 140 x g per 2 min. Risospendere le larve in 1 mL di acqua. Rendere un 01:10 diluizione dei vermi in acqua, pipetta una goccia di 10 µ l su un vetrino, mettere un vetrino coprioggetto e contare il numero di vermi sotto uno stereoscopio. Ripetere l'operazione due volte e la media dei risultati ottenuti.
- Pipetta il volume di vermi che corrisponde a circa 1.000 vermi su un piatto di NA22 (che era precedentemente portato a temperatura ambiente) inserendo piccole gocce sul piatto. Lasciare la piastra semi-aperte fino a quando la goccia si asciuga. Quindi coprire la piastra e incubare a testa in giù in incubatrice di 20 ° C per circa 44-48 h o fino a raggiungono i vermi fase ritardata di L4, come confermato visivamente sotto un microscopio stereoscopico. Ora i vermi sono pronti per essere testati per SWIP.
3. SWIP
Nota: Descriviamo il metodo manuale di valutazione SWIP nel selvaggio-tipo vermi trattati con AMPH. Inoltre brevemente discutiamo il tracciamento delle viti senza fine e un'ulteriore analisi della cinetica di verme utilizzando un tracker di verme automatizzato e un software di monitoraggio che precedentemente sono stati descritti da Hardaway et al.10.
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Metodo manuale per testare per SWIP
- Aliquotare e 40 µ l di soluzione di saccarosio mOsm/L 200 con o senza 0,5 mM AMPH in una lastra di vetro posto. Sotto lo stereoscopio, pick fase tardo-L4 8-10 viti senza fine con un ciglio o platino pick e immergere lo scegliere la piastra che contiene la soluzione fino a quando il worm fa spostare il pick e nuotare nella soluzione. Prendere nota del numero di vermi scelto nel pozzo, avviare il timer, osservare e registrare il numero di vermi che esibiscono SWIP presso ogni minuto mark.
- Copiare i dati grezzi in un foglio di calcolo e calcolare la percentuale di vermi paralizzati dividendo il numero di vermi paralizzato ogni minuto per numero totale di vermi testato durante tutto il test e moltiplicare per 100. Copiare i valori percentuali in qualsiasi grafica e trama e software statistico i dati con i valori di percentuale sull'asse Y e l'ora utilizzando il grafico XY asse X formato.
- Eseguire ANOVA a due vie, seguita da analisi post-hoc (per esempio, Bonferroni post-test) per verificare la significatività statistica tra controllo, gruppi AMPH e tempi di trattamento.
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Analisi automatizzata di SWIP
- Eseguire l'analisi automatica su una vite senza fine in un momento. Il protocollo per impostare su fotocamera, il verme Tracking software e script per eseguire il software di monitoraggio analisi sono descritti in dettaglio in Hardaway et al.16.
- Brevemente, inserire un singolo ermafrodita di fase tardo L4 in una lastra di vetro posto utilizzando un prelievo di ciglia, come descritto nel metodo manuale nella sezione 3.1.2. Registrare video di nuoto di un verme al momento e utilizzare il software di tracking di verme per calcolare la frequenza delle curve del corpo.
- Seguire lo script fornito con il software di monitoraggio per ottenere verme thrashing frequenza e per generare mappe di calore dai dati thrashing verme.
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Representative Results
Presentiamo un esempio di analisi SWIP indotta dal trattamento di AMPH. La figura 1 Mostra una rappresentazione schematica dell'apparato di test come descritto sopra. Per il saggio manuale, circa 8-10 anni, sincronizzato tardo L4 fase vermi vengono raccolti con una ciglia o platino pick e inseriti in una lastra di vetro posto riempito con 40 µ l di 200 mOsm/L saccarosio (soluzione di controllo) o saccarosio con 0,5 mM AMPH e testato per SWIP.
Quando gli animali smettere di nuoto (cioè, esibiscono SWIP), sono rapidamente sul fondo del pozzo e non si muovono. Pertanto, la discriminazione tra animali che ancora nuotare sulla superficie dell'acqua rispetto a quelli che sono costante nella parte inferiore del pozzo è molto semplice. La maggior parte dei vermi testato in controllo soluzione nuotare continuamente per almeno 10 minuti, mentre nell'ambito del trattamento di AMPH, aumenta il numero di animali che esibiscono SWIP progressivamente. La massima percentuale di animali che esibiscono SWIP è proporzionale alla concentrazione di AMPH utilizzato1,5,13. Quando vermi knockout (dat-1) DAT-1 vengono testati in soluzione di controllo, 40-70% vermi esibiscono SWIP entro 10 minuti4,13. Questo risultato è paragonabile alla percentuale di animali paralizzati misurata in animali trattati con 0,5 mM AMPH (Figura 2).
Vermi esposti a saccarosio o saccarosio contenenti AMPH non mostrano SWIP nel primo minuto di osservazione (Figura 2). Tuttavia, mentre i vermi trattati con saccarosio continuano a nuotare per 10 minuti, vermi trattati con AMPH iniziare a mostre SWIP dopo 2 minuti di trattamento e dopo 10 minuti, 66 ± 3% animali mostrano SWIP (Figura 2).
Per l'analisi automatizzata, si registrano video di vermi sotto controllo o trattamenti di AMPH un verme alla volta utilizzando un software di registrazione video. Un computer software di monitoraggio è utilizzato per tenere traccia di botte di vite senza fine e i dati risultanti sono importati ed analizzati con la tuta di software. Esempi di mappe di calore degli animali esposti a controllo o AMPH, visualizzazione in movimento attivamente animali in vermi rossi e paralizzati in verde, sono illustrato nella Figura 3.
Figura 1 : Dosaggio impostato per SWIP. Gravid vermi adulti di (N2) di selvaggio-tipo sono stati lisati con ipoclorito di sodio/NaOH trattamento per rilasciare gli embrioni. Gli embrioni erano ammessi a schiudersi e si sviluppano in sincronizzato larve L1 nel buffer di M9 per 14 h su un agitatore e poi placcati su una piastra di NGM seminata con NA22 batteri. Dopo 42-48 h tardo L4 le larve erano visivamente identificate sotto lo stereoscopio e scelto con un prelievo di ciglia in una piastra posto con o senza anfetamine in soluzione di saccarosio al controllo e segnate per SWIP manualmente o tramite analisi automatizzata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Indotta da anfetamina SWIP utilizzando il saggio manuale. Vermi nel saccarosio o saccarosio con anfetamina di 0.5 mM (AMPH) visivamente sono stati segnati per comportamento SWIP ogni minuto utilizzando uno stereoscopio. La percentuale di animali di che espositrici SWIP è stato calcolato dividendo il numero paralizzato vermi per il numero totale di worms analizzati per ogni punto di tempo e poi moltiplicando il risultato per 100. La percentuale di vermi esposti a AMPH (quadrati blu) mostrando SWIP aumenti straordinari, mentre i vermi non trattati (cerchi rossi) continuano a nuotare durante l'intervallo di 10 minuti. N rappresenta il numero di animali testati in ogni gruppo. Barre di errore indicano l'errore standard di mezzi (SEM). Significatività statistica è stata valutata eseguendo ANOVA a due vie con Bonferroni più test di confronto (p < 0.0001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Indotta da anfetamina SWIP tramite analisi automatizzata. Video di vermi in saccarosio o saccarosio con 0,5 mM AMPH sono stati registrati usando una telecamera montata su uno stereoscopio. Video di nuoto di vermi individuali sono stati monitorati con un software di rilevamento e analizzati usando vestito di software di monitoraggio. Mappe di calore sono state generate dai dati dove zone rosse mostrano i vermi che si muovono attivamente, e aree verdi indicano vermi paralizzati. Ogni gruppo sperimentale è rappresentante di 6 animali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per eseguire un'analisi comportamentale, SWIP, c.elegans. Questo protocollo è semplice e lineare con nessun principali ostacoli tecnici, rendendo questo test molto facile da usare. Tuttavia, ci sono alcuni aspetti critici che devono essere considerati al fine di svolgere efficacemente il dosaggio.
Prestare la massima attenzione per garantire che i vermi utilizzati per il dosaggio sono ben nutriti, dal momento che la restrizione dietetica colpisce SWIP17. Gentle handling di vermi durante la raccolta come trattamento di ipoclorito di sodio/NaOH come momento giusto durante la lisi sono passaggi critici, come trauma durante la raccolta (più comune quando si utilizza un pick platino) o l'esposizione prolungata degli embrioni alla soluzione di ipoclorito di sodio/NaOH può causare danni permanenti al worm18 e quindi compromettere la loro capacità di nuotare.
Tecniche sterili devono essere seguite per evitare contaminazione. Contaminazione delle piastre agar compromette la salute degli animali e quindi altera la loro capacità di nuotare. Leggera differenza nella percentuale di animali che esibiscono SWIP può essere osservato mediante piastre di agar insemenzato con diversi ceppi di batteri e. coli (NA22, OP50, ecc.). Nel nostro protocollo, usiamo NA22 per produrre un gran numero di vermi.
Piastre di vetro-spot, utilizzati durante il test i SWIP sono preferiti piatti di plastica perché possono essere accuratamente lavati, sterilizzati in autoclave e riutilizzati quando diversi tipi di farmaci sono testati.
Un altro fattore importante da considerare in un'analisi SWIP è l'osmolarità di mezzi liquidi in cui gli animali sono testati19. Nel nostro protocollo, usiamo il saccarosio per portare l'osmolarità dell'acqua fino a 200 mOsm/L che precedentemente è stato indicato per essere una condizione ottima per gli animali (comunicazione personale Rd. Blakely). Acqua con una controllata osmolarità è preferito perché elimina possibili differenze nella qualità dell'acqua sopra le analisi multiple eseguite diversi giorni, settimane o mesi. In particolare, dat-1 e selvaggio-tipo animali trattati con AMPH non esibiscono SWIP se soluzioni saline (ad es., soluzione di M9) vengono utilizzati come mezzi di controllo.
Il tempo richiesto per la maggior parte degli animali ad esporre SWIP può variare leggermente tra fasi diverse vite senza fine (L1-L4). Ad esempio, Pedro et al (2014) ha riferito che dopo 5 min 80% degli animali di dat-1 L1 ancora nuotare, così solo il 20% degli animali esibiscono SWIP. D'altra parte, solo il 50% degli animali di dat-1 L4 ancora nuotare dopo 5 min20. Pertanto, è importante che gli animali sottoposti per SWIP sono analizzati alla stessa età. Abbiamo ottimizzato la nostra analisi usando sempre tardi L4 in scena gli animali. Tardo L4 larve hanno il vantaggio di essere facilmente riconoscibile tra gli altri stadi larvali, perché, in questa fase, gli animali hanno raggiunto la loro dimensione adulta e presentano una caratteristica linea sottile dividendo la macchia bianca al centro del loro corpo che sarà più tardi differenziarsi in una vulva matura. L'intervallo di tempo del dosaggio è anche critico. Ad esempio, dopo 15 minuti il 90% dei mutanti di dat-1 L4 esibiscono SWIP ma in secondo momento (30 min), solo il 60% di loro esibiscono SWIP20.
Il test automatizzato SWIP Elimina gli errori umani e migliora high throughput screening per quanto riguarda le analisi manuale. Tuttavia, software di monitoraggio programmi sono molto tempo poiché possono tracciare solo una vite senza fine in un momento.
Per quanto riguarda altri comportamenti DA c. elegans -dipendente, SWIP è un tipo richiede meno tempo di dosaggio. Per esempio, il rallentamento basale risposta2 non è un immediato-tipo di dosaggio. Infatti, vermi devono essere cronicamente alimentati con le droghe, e questo potrebbe portare a effetti penetranti e fuori bersaglio. Così, potrebbe non essere altrettanto efficace per lo screening per le droghe.
Una delle principali applicazioni di SWIP è allo schermo per vari farmaci che hanno come destinazione la via dopaminergica. In casi dove i farmaci non sono solubili in acqua (ad es., mazindolo), diluizioni corretta devono essere eseguite per ottenere concentrazioni dove la soluzione di elemento portante non è tossica per i vermi. Inoltre, se diverse concentrazioni del farmaco stesso usato5,13,14, curve dose-risposta possono anche essere analizzate. Ad esempio, il tasso di progressione (pendenza della curva di animali al minuto, Figura 2) può essere segnalato come funzione della concentrazione e utilizzato per confrontare gli effetti di diversi farmaci (ad esempio, la cocaina vs AMPH).
Quando SWIP è utilizzato per studiare il meccanismo d'azione dei farmaci alle sinapsi dopaminergiche, occorre prestare attenzione se risultati vengono estesi ad altri animali. Per esempio, imipramina, un inibitore specifico del trasportatore della noradrenalina dei mammiferi (NET) è stato utilizzato per indurre SWIP DA mediare in N2 animali4. C. elegans non non sintetizzare norepinefrina e di conseguenza non esprime NET. Tuttavia, il trasportatore di c. elegans DA condivide omologia con mammiferi netto21. Per questo motivo, farmaci che sono inibitori specifici della rete dei mammiferi e hanno effetti limitati sugli DAT dei mammiferi (ad es., imipramina) mostrano elevata selettività al c. elegans DAT. Quindi, selettività specie potrebbe limitare la nostra capacità di estrapolare i risultati da c. elegans agli esseri umani.
Il fattore più importante da considerare quando progetta SWIP saggi è l'inclusione di esperimenti dimostrando che SWIP è mediata dal sistema dopaminergico. Infatti, nuoto alterata potrebbe essere generata da fattori diversi geni correlati al sistema DA (ad es., difetti generali in contrazione i muscoli). Per garantire che SWIP è infatti mediato DA, protocolli dovrebbero includere gli esperimenti condotti con gli animali in cui è stato impoverito DA. Ciò può essere ottenuto mediante utilizzo di animali knockout privi di espressione di gatto-2, l'omologo di c. elegans di tirosina idrossilasi, che è l'enzima limitante per la sintesi DA, o dagli animali di selvaggio-tipo pre-trattamento con reserpina, un farmaco che causa lo svuotamento DA vescicole3. Per esempio, McDonald et al.3 ha mostrato che SWIP basale osservata nei mutanti di dat-1 è stato recuperato quando questi animali sono stati pretrattati con reserpina. Questo risultato suggerisce che SWIP è mediata DA. D'altra parte, utilizzando gatto-2, dat-1 e mutanti privi di espressione di ciascuno dei recettori dopaminergici, Safratowich et al (2014) dimostrato che la traccia ammina β-feniletilammina (βPEA) induce SWIP entro 1 minuto di trattamento indipendentemente da, ma di attivazione diretta dello ione ligando canale LGC-5514. Gli autori hanno indicato che SWIP indotta da βPEA e DA sono meccanicisticamente diversa e può essere facilmente discriminate sperimentalmente. Infatti, mentre βPEA-indotto SWIP è DA - e dop-3-indipendente, raggiunge valori massimali entro 1 min e rapidamente diminuisce dopo 2 min14, mediata DA SWIP è gatto-2 e dop-3 dipendenti ed è essenzialmente zero dopo 1 minuto (Figura 2). Così, c'è una grande differenza nel tempo richiesto per raggiungere gli effetti massimi, e questo consente di discriminare rapidamente tra i due fenomeni: 1) il veloce βPEA-indotto SWIP entro 1 minuto ottenuto mediante attivazione diretta dei canali LGC-55 e 2) il lento SWIP DA-mediata che si verifica quando un surplus di DA extracellulare si accumula nel tempo (10-15 min) e i recettori DA DOP-3 sono overstimulated3.
In conclusione, con il giusto set di esperimenti che prevedono l'uso di animali knockout per geni giocatore chiave del sistema dopaminergico (gatto-2, dat-1, dop-3) e l'uso di farmaci che riducono lo strato DA Sorage (reserpina), è stato SWIP usato con successo per delucidare il meccanismo d'azione dei farmaci come AMPH5,13, βPEA14,15 e azaperone6.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare il dottor Osama Refai dal laboratorio del Dr. Randy Blakely per guida con l'analisi automatizzata di SWIP. Quest'opera è stata sostenuta da finanziamenti da NIH R01 DA042156 LC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | Reynolds wrap | 1091835 | |
| Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
| Autoclave | |||
| Bacterial Incubator | New Brunswick scientific | M1352-0000 | |
| Bacteriological grade, Agar | Lab Scientific, Inc | A466 | |
| Bacto (TM) Peptone | BD | REF 211677 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Thorlabs | U-CMAD3 | |
| Centrifuge | Eppendorf 5810R 15amp | E215059 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | |
| Deionized water | Millipore | Z00QSV0WW | Milli-Q |
| Depression glass spot plate | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
| Erlenmeyer flask | ThermoFisher | 4103-0250PK | |
| Eye lash | |||
| Glass slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Graphing and statistical software | Prism | Graphpad 5 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | RB=H3375 & H7006 | |
| Hypochlorite | Hawkins | Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal | |
| LB Broth, Miller | Fisher | BP1426 | |
| Magnesium Chloride (Hexahydrate) | Sigma-Aldrich | RB=M0250 | 500 g |
| Magnesium sulfate (heptahydrate) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| Magnetic stir bar | Fisherbrand | 16-800-510 | |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| NA 22 bacteria | CGC | ||
| Nystatin | Sigma | 1400-61-9 | |
| Osmometer | Advanced Instruments, Inc | Model 3320 | |
| Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Petriplates | Falcon | 351007 | |
| pH Meter | Orion VersaStar Pro | IS-68X591202-B 0514 | |
| Polystrine conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Potassium Phosphate - DIBASIC | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| Potassium Phosphate - MONOBASIC | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Serological pipettes | VWR | 10ml=89130-898 | |
| Shaker | Reliable Scientific | 55S 12x16 | |
| Sodium Chloride | Fisher | RB=BP358-1 | |
| Sodium dihydrogen Phosphate | Fisher | RB=S381 | |
| Spreadsheet | MS office | Microsoft Excel | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model tlb3. 1 stemi2000 | |
| Sterile Pipette tips | Various | 02-707-400 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
| Superglue | Loctite | 1647358 .14 oz. | |
| SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
| Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
| Video recording software | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |
References
- de Bono, M., Villu Maricq, A. Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).
- Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
- McDonald, P. W., et al. Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1. Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).
- Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).
- Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans. Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).
- Refai, O., Blakely, R. D. Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone. Neurochemistry International. , (2018).
- Bermingham, D. P., et al. The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).
- Nass, R., et al. A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).
- Hardaway, J. A., et al. Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis. G3. 2 (8), Bethesda, Md. 961-975 (2012).
- Hardaway, J. A., et al. Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling. Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).
- Felton, C. M., Johnson, C. M. Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels. G3. 4 (6), Bethesda, Md. 1081-1089 (2014).
- Lanzo, A., et al. Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans. Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).
- Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).
- Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel. Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).
- Carvelli, L. Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel. Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).
- Hardaway, J. A., et al. et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis. Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).
- Lüersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -C., Döring, F. Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental Biology. 217, Pt 14 2480-2488 (2014).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).
- Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -L., Holmes, A., Gartner, A. Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans. PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).
- Jayanthi, L. D., et al. The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter. Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).
