Summary
Svømming indusert lammelse (SWIP) er en veletablert atferdsdata analyse brukes til å studere de underliggende mekanismene av dopamin signalering i Caenorhabditis elegans (C. elegans). Imidlertid mangler en detaljert metode til å utføre analysen. Her beskriver vi en trinnvis protokoll for SWIP.
Abstract
Svømming analysen beskrevet i denne protokollen er et gyldig verktøy for å identifisere proteiner regulere dopaminergic synapser. Ligner på pattedyr, dopamin (DA) kontrollerer flere funksjoner i C. elegans inkludert læring og motor aktivitet. Vilkår som stimulerer DA utgivelsen (f.eks amfetamin (AMFOTÆR) behandlinger) eller det hindre DA klaring (f.eks dyr mangler den DA transporter (dat-1) som er i stand til reaccumulating DA i nervecellene) generere et overskudd av ekstracellulære DA til slutt resulterte i hemmet bevegelse. Dette er spesielt tydelig når dyr svømme i vann. Faktisk, vill-type dyr fortsetter å svømme lengre, dat-1 null mutanter og vill-type behandlet med AMFOTÆR eller hemmere av den DA transporter synke å bunnen av brønnen og ikke flytte. Dette kalles "Svømming indusert lammelse" (SWIP). Selv om SWIP analysen er godt etablert, mangler en detaljert beskrivelse av metoden. Her beskriver vi en trinnvis veiledning for å utføre SWIP. For å utføre analysen, er sent larver scenen-4 dyr plassert i et glass spotplate som inneholder kontrollen sucrose løsning med eller uten AMFOTÆR. Dyr er scoret for svømming virkemåten manuelt ved visualisering under en stereoscope, eller automatisk ved opptak med et kamera montert på stereoscope. Videoer blir deretter analysert ved hjelp av en sporingsprogramvare, som gir en visuell representasjon av juling frekvens og lammelse i form av varme kart. Begge de manuelle og automatiserte systemene garanterer en lett kvantifiserbare avlesning av dyr bading evne og dermed forenkle screening for dyrene bærer mutasjoner i dopaminergic systemet eller Aux gener. I tillegg kan SWIP brukes til å belyse virkningsmekanismen av narkotiske stoffer som AMFOTÆR.
Introduction
Dyr utføre en rekke medfødt og komplekse atferd som er formidlet av ulike nevrotransmittere koordinert av intrikate signalnettverk prosesser. Nevrotransmitter dopamin (DA) formidler høyt konservert atferd over arter, inkludert læring, funksjon og belønning behandling.
Jord-Rundormer C. elegans, med en relativt enkel og godt kartlagt nervesystemet som består av bare 302 neurons, viser markant komplekse atferd, inkludert mange som reguleres av DA som parring, læring, foraging, bevegelse og egglegging 1. blant andre funksjoner, korte livssyklusen, enkel håndtering og bevaring av signalnettverk molekyler, fremheve fordelene med C. elegans som modell for å studere nevrale grunnlag av bevarte atferd.
Hermafroditt C. elegans inneholder åtte dopaminergic neurons; I tillegg til disse inneholder mannlige seks ekstra par parring formål. Som i pattedyr, disse neurons syntetisere DA og uttrykke den DA transporter (DAT-1), en membran protein som finnes i dopaminergic neurons, som transporterer DA sluppet i den synaptiske kløften tilbake i dopaminergic neurons. Videre, de fleste av proteiner involvert i hvert trinn av syntese, emballasje og utgivelsen av DA er svært bevart mellom ormer og mennesker, og som i pattedyr, DA modulerer fôring atferd og bevegelse i C. elegans2.
C. elegans kryper på solide flater og svømmer med en karakteristisk juling atferd i vann. Interessant, mutanter mangler uttrykk for DAT-1 (dat-1) gjennomgå normalt på solid overflate, men klarer ikke å opprettholde svømming når nedsenket i vann. Dette ble kalt svømming indusert lammelse eller SWIP. Tidligere eksperimenter har vist at SWIP, delvis er forårsaket av et overskudd av DA i den synaptiske kløften som til slutt overstimulates D2-like postsynaptic reseptorer (DOP-3). Selv om opprinnelig identifisert i dat-1 knockout dyr3, SWIP er også observert i vill-type dyr behandlet med medikamenter som blokkerer aktiviteten av DAT (f.eks imipramin4) og/eller indusere DA utgivelsen (f.eks amfetamin5). På den annen side, forhindrer farmakologiske eller genetiske manipulasjoner avverge syntese og utgivelsen av DA og blokkering DOP-3 reseptor funksjonen SWIP6. Sammen har disse allerede publiserte data etablert SWIP som et pålitelig verktøy å studere atferdsmessige effekten forårsaket av muterte proteiner i dopaminergic synapser3,4,7 og å være ansatt videresende genetisk skjermer for identifikasjon av romanen regulatoriske trasé involvert i DA signalering7,,8,,9,,10,,11,,12. I tillegg tilbyr en lett kvantifiserbare avlesning av narkotikainduserte atferd i levende dyr, SWIP gjør utviklingen av virkningsmekanismer av stoffer som amfetamin (AMFOTÆR) og azaperone på dopaminergic synapser5, 6 , 13 , 14 , 15.
Protokoller for å utføre SWIP analyser har blitt beskrevet før16. Her beskrive vi i detalj metoder og installasjonsprogrammet til å utføre analysen med mål om å gi en visuell guide for C. elegans samfunnet å utføre SWIP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av løsninger og Media
- Klargjør M9 buffer ved oppløsning KH2PO4 3,0 g (22.05 mM), Na2HPO4 6.0 g (42,2 mM), og NaCl 5.0 g (85.5 mM) i 1 L autoklaveres deionisert vann. Tilsett 1,0 mL av 1 M MgSO4 (12 g i et siste volum av 100 mL autoklaveres deionisert vann) etter autoklavering. Mix 100 mL av resulterende 10 x M9 med 900 mL autoklaveres vaskebuffer vann for å lage en 1 x løsning.
- For å gjøre egg buffer, løses 6.896 g av NaCl (118 mM), 3.578 g KCl (48 mM), 0.294 g av CaCl2-2 H2O (2 mM), 0,406 g av MgCl2-6 H2O (2 mM) og 5.958 g (25 mM) av HEPES i 1 L autoklaveres deionisert vann. Justere pH til 7.3 med NaOH.
- Klargjør frisk natriumhypokloritt/NaOH løsning ved å legge til 1 mL av 5-6% natriumhypokloritt (bleke) og 180 µL av 10 N NaOH 3,8 mL deionisert vann.
- Veie 60 g sukrose og løses i autoklaveres deionisert vann til et siste volum 100 ml å 60% sucrose løsning.
- Oppløse 0.684 g av sukrose i 10 mL autoklaveres deionisert vann å gjøre 200 mM sukrose. Kontrollere og justere til samme en osmolaritet bruker osmometer. Lag 1 mL dele i 1,5 mL microcentrifuge rør og fryse på 20 ° C.
- Veie 0.184 g AMFOTÆR (molekylvekt 184.75 g/mol) og løses i 10 mL deionisert vann for å lage en 100 mM lagerløsning. Bland 2 µL av lager løsningen i 400 µL av vann for å lage 0,5 mM fungerende løsning.
-
Forberede næringsstoffer vekst medier (NGM) plater
- Bland 3 g av NaCl (52.65 mM), 20 g pepton 25 g av bacto-agar og 975 mL deionisert vann i en 2 L Erlenmeyer kolbe. Inkluder en magnetic røre bar og autoklav (121 ° C, 15 PSI) i 1 time ved hjelp av flytende syklus.
- Cool til og opprettholde temperaturen på ca 50 ° C ved å plassere kolbe på en ovn under omrøring. Legge til 0,5 mL av kolesterol (5 mg/mL i etanol), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL av 1 M CaCl2 og 25 mL 1 M kalium fosfatbuffer, pH 7.4 (108.3 g KH2PO4, 35,6 g K2HPO4 vaskebuffer 1 L vann).
- Pipetter 25 mL til 100 x 15 mm Petri plater og lar media å stivne. Lagre platene opp ned på 4 ° C i en boks for opptil fire uker.
-
Utarbeidelse av Lysogeny kjøttkraft (LB) kjøttkraft
- Oppløse 5 g av LB pulver blanding i 200 mL deionisert vann i en Erlenmeyer kolbe. Autoclave i 30 minutter utnytte den flytende sterilisering syklus. Tillate kjøttkraft avkjølt. Lagre ved romtemperatur for 1-2 uker.
-
Utarbeidelse av NA22 bakteriell plater
- Bruk et sterilt pipette tips eller en steril bakteriell loop strek en LB plate med en liten mengde NA22 E. coli bakterier fra glyserol lager og ruge platen opp ned i en inkubator 37 ° C over natten for å vokse isolert kolonier. Plukke og innføre en enkelt koloni i 200 mL LB kjøttkraft i trinn 1,8 og la vokse over natten på 37 ° C på en risting plattform.
- For å frø platene, dispensere 200 µL av bakteriell kultur på NGM platene forberedt tidligere i trinn 1,7 og spres med en bakteriefri glass hockey kølle. La platene tørke over natten eller lenger under hette og lagre opp ned i en lufttett boks 4 ° C.
- For å gjøre øyenvippe/platina verktøyet å plukke ormer, fest en tykk øyenvippe eller en platina filament i et glass Pasteur Pipetter bruker superlim. Kutte spissen av øyenvippe i vinkel med et barberblad. Alternativt kan en Bunsen brenner brukes til å smelte spissen av glass pipette rundt platina filament.
2. C. elegans dyrehold
Merk: Kultur vill-type N2C. elegans belastning på Escherichia coli NA22 plater. Detaljert kultur metoder er beskrevet nedenfor.
-
Utarbeidelse av ormen kultur
- En startkulturer ormer, klippe et lite stykke agar fra en plate som inneholder velfødde dyr og overføre den til en NA22 E. coli bakterier plate i trinn 1,9 bruker en steril slikkepott. Inkuber platene på 20 ° C til 3-4 dager. Under en stereo mikroskop, visuelt bekrefte tilstedeværelse av gravid voksne.
-
Utarbeidelse av synkronisert befolkningen av ormer
- Samle gravid voksne fra minst 2 plater av dispensing autoklaveres deionisert vann hele platen med en sprøyting flasken. Forsiktig snurr til å fjerne ormer og samle ormer i en 15 mL polystyren konisk rør med en engangs plast pipette.
- Nedspinning røret i en sentrifuge 140 x g i 2 min pellets ormer, og Sug opp av supernatant med en vakuumpumpe eller bygget i laboratoriet vakuum.
- Resuspend og vask ormer ved å fylle røret med autoklaveres deionisert vann og mikse sentrifuge 140 x g for 2 min. Sug opp nedbryting og gjenta denne siste trinn to ganger eller til ormer er klart fra bakterier (vann synes klart når med ormer).
- Legge 5 mL av nystekte natriumhypokloritt/NaOH stoppløsningen (trinn 1.3) til ormen pellet og bland raskt med en vortex. Inkuber røret på en rocker i ca 4-8 min. Tidspunktet for inkubasjon med natriumhypokloritt/NaOH løsning varierer mellom 4-8 minutter basert på kvaliteten på lager natriumhypokloritt løsningen (bleke).
- Sette en dråpe (2-50 µL) løsning som inneholder ormer på en barometer microscope skyve og sjekke hver 2 min under mikroskop for ormen lysis. Når omtrent 70% av ormer er lysed og egg er utgitt, fylle røret med egg buffer i trinn 1.2 og umiddelbart sentrifuge for 1 min 140 x g pellets embryoene og orm skrotter.
- Sug opp nedbryting og vask pellet 3 ganger ved å fylle røret hver gang med egg buffer. Nedspinning 140 x g for 1 min og fjerne nedbryting hver gang. Pellet blir hvit på slutten av vasker.
- Etter siste vask, skille embryoene fra de døde skrottene i 30% sukrose løsning. Legge til 5 mL autoklaveres deionisert vann i pellet, resuspend og legge 5 mL av 60% sukrose forberedt i trinn 1.4. Bland godt og sentrifuge 160 x g for 6 min.
- Bruke et glass Pasteur pipette for å overføre embryoene flytende på den øvre meniscus i en fersk 15 mL konisk rør. Ikke ta mer enn 3-4 mL. For å fjerne eventuelle gjenværende sukrose, vaske embryoene 3 ganger med autoklaveres vann av sentrifugering 140 x g for 3 min, fjerne nedbryting og resuspending pellet (og fylle røret) hver gang.
- Gjenta vasker med 1 x M9 buffer. Etter siste vask, resuspend pellet i 10 mL av M9. La rør på en shaker natten (ikke mer enn 14 h) for eggene klekkes i L1 larvae. Ormer forblir i L1 larvestadiet skyldes mangel på mat.
- Vask av L1 Larvene 3 ganger med autoklaveres vann for å fjerne alle feromoner utgitt larver av sentrifugering 140 x g for 2 min. Resuspend larver i 1 mL vann. Lage en 1:10 fortynning av ormer i vann, Pipetter en 10 µL dråpe i et glass lysbilde, sette en dekkglassvæske på og antall ormer under en stereoscope. Gjenta dette to ganger og gjennomsnittlig resultatene.
- Pipetter volumet av ormer som tilsvarer ca 1000 ormer på en NA22 plate (som tidligere ble brakt til romtemperatur) ved å plassere små dråper på platen. La platen halvåpen til drop tørker ut. Deretter dekk platen og ruge opp ned i 20 ° C inkubator for ca 44-48 h eller til ormer kommer sent L4 Stadium, som bekreftet visuelt under en stereomicroscope. Nå er ormer klar å bli testet for SWIP.
3. SWIP
Merk: Vi beskriver den manuelle metoden vurdere SWIP i vill-type ormer behandlet med AMFOTÆR. Vi diskuterer også kort sporing av ormer og videre analyse av ormen kinetics bruker en automatisert ormen tracker og en sporingsprogramvare som tidligere ble beskrevet av Hardaway et al.10.
-
Manuell metode til å teste SWIP
- Aliquot 40 µL av 200 mOsm/L sucrose løsning med eller uten 0,5 mM AMFOTÆR i en flekk glassplate. Under stereoscope, plukke 8-10 sen-L4 scenen ormer med en øyenvippe eller platinum plukke og senk hakke i platen som inneholder løsningen til ormer flytte av plukkingen og svømme i løsningen. Merk antall ormer plukket i brønnen, starte tidtakeren, observere og registrere antall ormer stille SWIP på hvert minutt merke.
- Kopiere rådataene til et regneark og beregne prosentandelen av ormer lammet ved å dele antall ormer lammet på hvert minutt totalt antall ormer testet gjennom analysen og multiplisere med 100. Kopiere prosent verdier til noen grafiske og statistisk programvare og plotte dataene med prosentverdier på Y-aksen og tid på X-aksen ved hjelp av XY grafen format.
- Utføre toveis VARIANSANALYSE etterfulgt av innlegg-hoc analyse (f.eks Bonferroni etter test) for å teste for statistiske betydning kontroll, AMFOTÆR grupper og tidspunktet for behandling.
-
Automatisk analyse av SWIP
- Utføre automatisk analyse på en enkelt orm samtidig. Protokollen for å sette opp kameraet, ormen tracker programvare og skript å kjøre sporingsprogramvare analyse er beskrevet i detalj i Hardaway et al.16.
- Kort, plassere en enkelt sent L4 scenen Hermafroditt i et glass spotplate utnytte en øyenvippe hakke, som beskrevet i den manuelle metoden i delen 3.1.2. Registrer svømming videoer av ettall orm samtidig og bruke ormen tracker-programvaren til å beregne frekvensen av kroppen svinger.
- Følg manuset leveres med sporing skaffer ormen juling frekvens og generere varme kart fra ormen juling dataene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi presenterer et eksempel på SWIP analysen av AMFOTÆR behandling. Figur 1 viser en skjematisk fremstilling av analysen som beskrevet ovenfor. For manuell analysen, om 8-10 alder synkronisert sent L4 scenen ormer er samlet med en øyenvippe eller platinum plukke og plassert i et glass-spotplate fylt med 40 µL av 200 mOsm/L sukrose (kontrolløsning) eller sukrose med 0,5 mM AMFOTÆR og testet for SWIP.
Når dyr stoppe svømming (dvs. exhibit SWIP), de raskt synke å bunnen av brønnen og ikke flytte. Forskjellen mellom dyr som fortsatt svømmer på overflaten av vannet mot de som er stødig på bunnen av brønnen er derfor veldig grei. De fleste ormer testet i kontroll løsning svømme kontinuerlig i minst 10 minutter, mens under AMFOTÆR behandling, antall dyr viser SWIP gradvis øker. Maksimal andelen dyr viser SWIP er proporsjonal med konsentrasjonen av AMFOTÆR brukes1,5,13. Når DAT-1 knockout (dat-1) ormer er testet i kontrolløsning, utstilling 40-70% ormer SWIP innen 10 minutter4,13. Dette resultatet kan sammenlignes med andelen lammet dyr målt i vill-type dyr behandlet med 0,5 mM AMFOTÆR (figur 2).
Ormer utsatt sukrose eller sukrose inneholder AMFOTÆR viser ikke SWIP i første minutt observasjon (figur 2). Men ormer behandlet med sukrose fortsetter å svømme i 10 minutter, begynne ormer behandlet med AMFOTÆR å vise SWIP etter 2 minutter og etter 10 minutter, 66 ± 3% dyr viser SWIP (figur 2).
Videoer av ormer under kontroll eller AMFOTÆR behandlinger registreres for automatisert analyse, ettall orm samtidig benytter en video innspillingen programvare. En datamaskin sporing brukes til å spore ormen juling og resultatdataene er importert til og analysert med programvare dress. Eksempler på varme kart av dyr utsatt for kontroll eller AMFOTÆR, viser flytte aktivt dyr i rødt og lammet ormer i grønt, er vist i Figur 3.
Figur 1 : Analysen definert for SWIP. Gravid voksen vill-type (N2) ormer ble lysed med natriumhypokloritt/NaOH behandling å løslate embryoer. Embryoene ble tillatt å klekkes og utvikle i synkroniserte L1 larvae i M9 buffer for 14 h i en shaker og deretter belagt på en NGM plate seeded med NA22 bakterier. Etter 42-48 h var sent L4 scenen Larvene visuelt identifisert under stereoscope og plukket med en øyenvippe plukke i en flekk tallerken med eller uten amfetamin kontroll sucrose løsning og scoret for SWIP manuelt eller via automatisk analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Amfetamin-indusert SWIP bruker manuell analysen. Ormer i sukrose eller sukrose med 0,5 mM amfetamin (AMFOTÆR) ble visuelt scoret SWIP oppførsel hvert minutt med en stereoscope. Prosent av dyr stiller SWIP ble beregnet ved å dele antall lammet ormer av antall ormer assayed for hvert punkt, og deretter multiplisere resultatet med 100. Prosent av ormer utsatt for AMFOTÆR (blå ruter) viser SWIP øker overtid, mens ubehandlet ormer (røde sirkler) å svømme i løpet av 10 minutter. N representerer antall dyr testet i hver gruppe. Feilfelt viser standardfeil betyr (SEM). Statistisk betydning ble vurdert ved å utføre toveis VARIANSANALYSE med Bonferroni flere sammenligningen test (p < 0,0001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Amfetamin-indusert SWIP via automatisk analyse. Videoer av ormer i sukrose eller sukrose med 0,5 mM AMFOTÆR ble spilt inn med et kamera montert på en stereoscope. Svømming videoer av personlige ormer ble sporet med en sporing og analysert ved hjelp av sporing programvare dress. Varme kart ble generert fra dataene der røde områder viser ormene som aktivt går, og grønne områder viser lammet ormer. Hver forsøksgruppen er representant for 6 dyr. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en trinnvis protokoll for å utføre en opptreden analyse, SWIP, i C. elegans. Denne protokollen er enkel og grei med ingen store tekniske hekk gjør denne analysen meget bruker vennlig. Det er imidlertid noen viktige aspekter som må vurderes for å utføre analysen.
Omsorg bør tas for å sikre at ormer brukes for analysen er frisk matet, siden kosttilskudd restriksjon påvirker SWIP17. Forsiktig håndtering av ormer mens plukke godt timet natriumhypokloritt/NaOH behandling under lysis er avgjørende skritt, traumer under plukking (mer vanlig når du bruker en platina plukke) eller lengre utsettelse av embryo natriumhypokloritt/NaOH løsning kan føre til permanent skade ormer18 og dermed skade deres evne til å svømme.
Sterilt teknikker bør følges for å unngå forurensning. Forurensning av agar platene kompromisser helsen til dyrene, og dermed endrer deres evne til å svømme. Liten forskjell i prosent for dyr viser SWIP kan observeres bruker agar plater seeded med ulike stammer av E. coli bakterier (NA22, OP50, etc.). I vår-protokollen bruker vi NA22 til et stort antall ormer.
Glass-spot plater, brukt under SWIP analysen, er foretrakk å plast-plater fordi de kan være grundig vasket, autoklaveres og brukes på nytt når ulike typer narkotika er testet.
En annen viktig faktor som skal vurderes i en SWIP analysen er osmolaritet av flytende media der dyrene er testet19. I vår-protokollen bruker vi sukrose for å bringe osmolaritet vann opp til 200 mOsm/L som tidligere viste seg å være en optimal tilstand for dyrene (Blakely RD. personlig kommunikasjon). Vann med en kontrollert osmolaritet er foretrukket fordi det eliminerer mulige forskjeller i vannkvalitet over flere analyser utført på forskjellige dager, uker eller måneder. Spesielt, viser dat-1 og vill-type dyr behandlet med AMFOTÆR ikke SWIP hvis salt løsninger (f.eks M9 løsning) brukes som kontroll media.
Tiden som kreves for de fleste av dyrene viser SWIP endrer litt blant annet ormen fase (L1-L4). For eksempel rapporterte Masoudi et al. (2014) at etter 5 min 80% av dat-1 L1 dyr fortsatt svømme, dermed bare 20% av dyrene ha SWIP. På den annen side, svømme bare 50% av L4 dat-1 dyr fortsatt etter 5 min20. Derfor er det viktig at dyr testet for SWIP er assayed på samme alder. Vi har optimalisert våre analysen bruke alltid sent L4 iscenesatt dyr. Sen L4 Larvene har fordelen av å være lett gjenkjennelig blant andre larver stadier fordi, på dette stadiet, dyr har nådd sin voksen størrelse og viser en karakteristisk tynn linje dele hvit flekk i midten av kroppen som vil senere skille ut en moden vulva. Tidsrommet for analysen er også kritisk. For eksempel etter 15 minutter 90% av L4 dat-1 mutanter utstillingen SWIP men på senere tidspunkt (30 minutter), bare 60% av dem viser SWIP20.
Automatisert SWIP analysen eliminerer menneskelig feil og forbedrer høy gjennomstrømming screening forhold til manuelle analyser. Imidlertid sporing programmer er tidkrevende siden de bare kan spore en enkelt orm samtidig.
Med hensyn til andre C. elegans DA avhengig atferd er SWIP en mindre tidkrevende analysen. For eksempel er den basale bremse svar2 ikke en umiddelbar-type analysen. Faktisk ormer må fôres kronisk med narkotika, og dette kan resultere i penetrant og off-målet. Dermed kan det ikke være like effektiv til skjermen for narkotika.
En av de store programmene av SWIP er å skjermen for ulike stoffer som mål dopaminergic veien. I tilfeller der narkotika ikke er vannløselige (f.eks mazindol) skal riktig fortynninger utføres for å oppnå konsentrasjoner der carrier løsningen er ikke giftig for ormer. Videre, hvis ulike konsentrasjoner av samme stoffet er brukt5,13,14, dose-respons kurver kan også analyseres. For eksempel kan progresjon (helningen på kurven av dyr per minutt, figur 2) bli rapportert som funksjon av konsentrasjonen og brukes til å sammenligne effekten av ulike legemidler (f.eks AMFOTÆR vs kokain).
Når SWIP undersøke virkningsmekanismen av narkotika på dopaminergic synapser, bør oppmerksomhet vies Hvis resultatene er utvidet til andre dyr. For eksempel er imipramin, en bestemt inhibitor av pattedyr noradrenalin transporter (NET) brukt til å indusere DA-megle SWIP i N2 dyr4. C. elegans ikke ikke synthetize noradrenalin og følgelig uttrykker ikke nettet. Imidlertid deler den C. elegans DA transporter homologi med pattedyr netto21. Derfor vise stoffer som er bestemt hemmere av pattedyr NET og har begrenset effekter på pattedyr DAT (f.eks imipramin) høy selektivitet C. elegans DAT. Dermed kan arter selektivitet begrense vår evne til å ekstrapolere funnene fra C. elegans til mennesker.
Den viktigste faktoren å vurdere når utforme SWIP analyser er inkluderingen av eksperimenter beviser at SWIP er formidlet av dopaminergic systemet. Faktisk bli svekket svømming generert av andre faktorer enn gener relatert til DA systemet (f.eks generell feil i musklene sammentrekning). For å sikre at SWIP er faktisk formidlet av DA, skal protokoller inneholde eksperimenter utført med dyr som DA frigitt. Dette kan oppnås ved enten bruke knockout dyr mangler uttrykk for katten-2, C. elegans homologue av tyrosin hydroksylase, som er hastighetsbegrensningen enzymet DA syntese, eller ved pre behandling av vill-type dyr med reserpine, en stoff som forårsaker DA uttømming blemmer3. For eksempel viste McDonald et al.3 at basale SWIP observert i dat-1 mutanter ble gjenopprettet når disse dyrene var pre-behandlet med reserpine. Dette resultatet antyder at SWIP er DA-mediert. På den annen side, viste bruker katten-2, dat-1 og mutanter mangler uttrykk for hver av dopaminergic reseptorer, Safratowich et al. (2014) at spor Amin β-phenylethylamine (βPEA) induserer SWIP like behandling uavhengig fra DA kanal ved direkte aktivisering av ligand-gated ion LGC-5514. Forfatterne viste at βPEA - og DA-indusert SWIP er mechanistically forskjellige og de kan være lett diskriminert eksperimentelt. Faktisk, mens βPEA-indusert SWIP er DA- og dop-3-uavhengig, den når maksimal verdier innenfor 1 min og raskt avtar etter 2 min14, DA-mediert SWIP er katten-2 og dop-3 avhengige og er i hovedsak null etter 1 minutt (figur 2). Dermed er det en stor forskjell i tiden det tar å nå maksimal effekter, og kan raskt skille mellom de to fenomenene: 1) i Fort βPEA-indusert SWIP ett minutts oppnås ved direkte aktivering av LGC-55 kanalene og 2) treg DA-mediert SWIP som oppstår når et overskudd av ekstracellulære DA bygger opp over tid (10-15 min) og DA receptors DOP-3 er overstimulert3.
Som konklusjon, med de riktige sett av eksperimenter, som inkluderer bruk av knockout dyr for nøkkelspiller gener av dopaminergic (katten-2, dat-1, dop-3) og bruk av narkotika tappe DA lagringen (reserpine), har SWIP vært brukt å belyse virkningsmekanismen stoffer som AMFOTÆR5,13, βPEA14,15 og azaperone6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Dr. Osama Refai fra Dr. Randy Blakely lab for veiledning med automatisk analyse av SWIP. Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra NIH R01 DA042156 til LC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | Reynolds wrap | 1091835 | |
| Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
| Autoclave | |||
| Bacterial Incubator | New Brunswick scientific | M1352-0000 | |
| Bacteriological grade, Agar | Lab Scientific, Inc | A466 | |
| Bacto (TM) Peptone | BD | REF 211677 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Thorlabs | U-CMAD3 | |
| Centrifuge | Eppendorf 5810R 15amp | E215059 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | |
| Deionized water | Millipore | Z00QSV0WW | Milli-Q |
| Depression glass spot plate | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
| Erlenmeyer flask | ThermoFisher | 4103-0250PK | |
| Eye lash | |||
| Glass slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Graphing and statistical software | Prism | Graphpad 5 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | RB=H3375 & H7006 | |
| Hypochlorite | Hawkins | Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal | |
| LB Broth, Miller | Fisher | BP1426 | |
| Magnesium Chloride (Hexahydrate) | Sigma-Aldrich | RB=M0250 | 500 g |
| Magnesium sulfate (heptahydrate) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| Magnetic stir bar | Fisherbrand | 16-800-510 | |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| NA 22 bacteria | CGC | ||
| Nystatin | Sigma | 1400-61-9 | |
| Osmometer | Advanced Instruments, Inc | Model 3320 | |
| Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Petriplates | Falcon | 351007 | |
| pH Meter | Orion VersaStar Pro | IS-68X591202-B 0514 | |
| Polystrine conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Potassium Phosphate - DIBASIC | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| Potassium Phosphate - MONOBASIC | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Serological pipettes | VWR | 10ml=89130-898 | |
| Shaker | Reliable Scientific | 55S 12x16 | |
| Sodium Chloride | Fisher | RB=BP358-1 | |
| Sodium dihydrogen Phosphate | Fisher | RB=S381 | |
| Spreadsheet | MS office | Microsoft Excel | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model tlb3. 1 stemi2000 | |
| Sterile Pipette tips | Various | 02-707-400 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
| Superglue | Loctite | 1647358 .14 oz. | |
| SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
| Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
| Video recording software | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |
References
- de Bono, M., Villu Maricq, A. Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).
- Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
- McDonald, P. W., et al. Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1. Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).
- Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).
- Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans. Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).
- Refai, O., Blakely, R. D. Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone. Neurochemistry International. , (2018).
- Bermingham, D. P., et al. The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).
- Nass, R., et al. A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).
- Hardaway, J. A., et al. Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis. G3. 2 (8), Bethesda, Md. 961-975 (2012).
- Hardaway, J. A., et al. Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling. Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).
- Felton, C. M., Johnson, C. M. Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels. G3. 4 (6), Bethesda, Md. 1081-1089 (2014).
- Lanzo, A., et al. Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans. Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).
- Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).
- Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel. Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).
- Carvelli, L. Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel. Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).
- Hardaway, J. A., et al. et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis. Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).
- Lüersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -C., Döring, F. Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental Biology. 217, Pt 14 2480-2488 (2014).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).
- Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -L., Holmes, A., Gartner, A. Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans. PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).
- Jayanthi, L. D., et al. The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter. Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).
