Summary
本文介绍了利用全细胞生物传感器对岩藻糖类母乳低聚糖 (Hmo) 进行高通量检测和定量的研究。我们还在这里演示了这个平台的适应, 以分析 HMO 生产菌株, 重点是提高信噪比。
Abstract
母乳低聚糖 (Hmo) 是母乳中复杂的碳水化合物成分, 对婴儿健康有丰富的益处。然而, 由于单糖及其联系的检测和定量吞吐量相对较低, 其生物技术合成的优化受到限制。传统的糖类分析技术包括色谱/质谱法, 每天吞吐量约为数百种, 没有自动化。我们在这里演示了一种基因编码的细菌生物传感器, 用于高通量、链接特异性检测和定量的岩藻酰化 HMO 结构, 2 '-岩藻糖乳糖和 3-岩藻淀粉乳糖, 我们通过异源实现岩藻的表达。由于乳糖在牛奶或生物技术过程中的存在可能导致误报, 我们也证明了使用不同的策略来减少乳糖的信号。由于该技术的高吞吐量, 许多反应条件或生物反应器参数可以在几小时内并行检测, 从而优化了 HMO 的制造。
Introduction
母乳低聚糖 (Hmo) 是乳糖衍生的低聚糖, 通常由3至8种糖单体组成。他们有乳糖 (Gal-β1, 4-glc) 减少端, 并进一步拉长糖基链 (Β-1, 3-或β-1, 6-) 到葡萄糖 (Glc), 半乳糖 (Gal), 或 n-乙酰葡萄糖胺 (GlcNAc)。此外, 经常添加岩藻糖 (Fuc, α-1, 2-或α-1, 3-) 或唾液酸 (Sia 或 NeuAc, α-2, 3 或α-2, 6-) 残留物1。
目前对低聚糖和其他碳水化合物的分析在吞吐量和范围上都受到色谱-质谱 (ms) 技术的需要,2,3,4, 5,6,7, 每个样品大约需要一个小时, 更不用说昂贵的设备、专用柱和衍生剂的必要性, 以及对该设备操作的专业知识.低聚糖的联系是特别难以确定, 需要先进的 ms9,10或核磁共振 (nmr)技术 11。因此, 这些低聚糖的合成的快速优化受到这一缓慢分析步骤的吞吐量的限制。
在这项研究中, 我们证明了基于甲丝化三糖乳糖的 Hmo 的联系特异性检测, 重点是 2 '-岩藻糖乳糖 (2 '-fl), 这是人类牛奶中最丰富的 HMO, 使用基因编码的大肠杆菌整个细胞在 4 mgl 时具有检测极限的生物传感器。这种生物传感器的一个重要特点是它能够区分异构三糖。设计原理是基于在大肠杆菌中分离乳糖的特定岩藻糖酶的表达, hmo 中的乳糖的存在被lac操作数检测到, 进而产生荧光信号。我们通过建立一个双质化系统来实现这一目标, 一个是具有链状岩溶酶的系统, 另一个是荧光报告蛋白。该生物传感器平台适用于流式细胞仪或微板读取器的高通量筛选。我们还演示了生物传感器在量化工程菌株12产生的 2 '-fl 中的应用.在这项研究中, 我们还提出了三种策略, 选择性去除乳糖, 这可能会导致来自生物传感器的假阳性信号, 因为工程生产者应变是在乳糖上生长的。
总之, 基因编码的生物传感器使我们能够以特定链接的方式检测和量化 Hmo, 即使使用色谱、MS 或 NMR 技术也很难这样做。由于其高吞吐量和易用性, 该方法应在 Hmo 的代谢工程和合成中得到广泛的应用。
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Protocol
1. 细胞培养和诱导条件
注: 在以下实验中, 使用了三种菌株: 带有空载体的大肠杆菌 BL21 (de3)、带有 pafca 14 和 Pet28:ge18 绿色荧光蛋白 (gfp)的大肠杆菌bl21 (de3) 和带有质粒的大肠杆菌bl21 (de3)pAfcB14和彼得 28: gfp。所有菌株生长在 Luria-Bertani 肉汤 (LB) 或最小的培养基与适当的抗生素。在去离子化 (DI) 水中制备 1, 000倍卡那霉素 (50 Mg/ml) 和卡比西林 (100 Mg/ml) 的库存溶液。
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媒体准备
- 在1升的 di 水中加入25克 LB 粉末, 制备 LB 介质。在121°c 下对溶液进行高压灭菌20分钟消毒。等到灭菌的 LB 介质温度低于 60°c, 再为 LB 介质的每1毫升添加1Μl 的抗生素。
- 要制备 LB 板, 在灭菌前在 LB 介质中加入15克琼脂。在添加抗生素之前, 请等到灭菌后的 LB 琼脂温度低于60°c。
- 1.1.3 生物传感细胞, 用双抗生素、卡那霉素和卡比西林制备培养基或板材。
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碳水化合物诱导剂
- 在乳糖的摩尔当量下制备碳水化合物诱导剂的库存溶液:29 gl 的 2 '-fl 和3-FL。
注: 每个200Μl 的电池将需要20μl 的 2 '-fl 或3-FL。 - 产生200Μl 的细胞, 乳糖的最终浓度为 2.0 gl 或2.9Gl 最终浓度为 2F/-fl, 在37°c 时持续晃动, 让培养物生长一夜。
- 在乳糖的摩尔当量下制备碳水化合物诱导剂的库存溶液:29 gl 的 2 '-fl 和3-FL。
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细胞培养
- 实验前一天, 采用无菌技术, 对新鲜菌落中的 lb 培养基5毫升补充卡那霉素和卡比西林。
- 在37°c 的环境下, 以搅拌的条件培育所有的培养物, 并在夜间种植所有的培养物。
- 用卡那霉素和卡比西林将50μl 隔夜培养物转化为5毫升新鲜的 lbm9 培养基。在37°c 时进行连续晃动和生长, 直到培养在0.5–0.7 的 600 nm (OD600) 处达到光学密度。在这个日志中期阶段, 细胞可以被诱导。
2. 荧光测量和检测极限
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流式细胞仪细胞的制备
- 将隔夜培养物转移到 1.5 mL 管和离心机, 以 12 500 x g 的速度进行1分钟。
- 丢弃上清液并重新悬浮颗粒500Μl 的1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS; 6 mM Na 2 hpo 4, 1.8 mM NaH2 po 4, 145 mm 氯化钠在di 水中, ph 7.2) 制备单个细胞悬浮液并转移单个细胞悬浮到5毫升流式细胞术管。
- 在4°C 时保持细胞黑暗, 直到在流式细胞仪上运行样品。为了获得最佳结果, 请尽快分析细胞。
- 选择488纳米激光来激发 GFP。使用 525/50 纳米带通滤波器收集荧光素异硫氰酸酯 (fitc) 荧光水平 (20000–40000事件, 用于正向和侧向散射门控, 以避免聚集细胞和碎片)。
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校准生物传感器
- 要制作校准曲线, 请在 0–2500 Mg/l 范围内对标准 2 '-fl 进行8-10 稀释。
- 培养 2 '-fl 生物传感器 (含 pAfcA 和 pET28:GFP), 并采用标准稀释剂诱导它们, 如上文第1.3 节所述。每次稀释都会进行三次生物复制。
3. 在生产者应变中检测和定量 2 '-fl
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生产者菌株的培养
- 为制造最小介质, 请分别制备 1 Mk 2 Hpo4、feso4·7h2o、柠檬酸钠和 1 m 硫胺-hcl 的溶液, 使用0.22Μm 过滤器对溶液进行灭菌。将 M9 培养基与1升的 DI 水混合。在121°c 下将 M9 溶液高压灭菌 15分钟, 将溶液冷却至50°c。加入 MgSO4、ccl2、k2hpo4、feso 4·7h2o、柠檬酸钠和硫胺素, 最终浓度分别为2毫米、0.1 mm、12 g\ l、11 mgl、75 mgl 和 7.5μgl.
- 在 lb 介质的5毫升中, 开始培养 2 '-FL 生产菌株, 例如 Jm109 Gwbc-法尔, 并让它在37°c 下过夜生长, 如 Baumgartner 等人所述。
- 如前面的步骤1.3.3 中所述, 在步骤3.1.1 中准备的最小介质中, 亚培养为1%。将甘油加入 10 gl 的最终浓度, 在37°c 孵育培养。
- 当培养达到 OD600 0.5–0.7 时, 将异丙基Β-d-1-硫代丙醇苷 (iptg) 添加到 0.5 mm 的最终浓度中, 乳糖最终浓度为 2 G/l。
- 在37°c 下持续晃动, 让培养物生长24小时。
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2 '-fl 的提取
- 将隔夜培养物转移到 900 x g 的50毫升管和离心机上无菌15分钟。
- 3.2.2 丢弃上清液, 在 DI 水中重新悬浮颗粒。重复三次清洗步骤, 去除残余乳糖, 最后在5毫升的 di 水中重新悬浮。
- 要使细胞悬浮液裂解, 请在30s 脉冲中使用功率为30% 的声纳。任何时候都要把细胞放在冰上。
- 在 2, 000 x 克的情况下离心裂解细胞 25分钟。取出上清液, 通过无菌 (例如 0.22μm) 过滤器, 并将其保存在 4°c, 直到进行分析。
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生物传感器的定量
- 接种 2 '-Fl 生物传感细胞的培养物, 并在日志中阶段诱导细胞裂解液, 相当于用于制作校准曲线的估计浓度 2 '-fl。在与要分析的样品 (例如细胞裂解液) 相同的环境中进行校准, 方法是在诱导生物传感器细胞之前添加 2 '-fl 的稀释物来控制 (即非生产商) 过滤细胞裂解液。
- 在流式细胞仪上运行样品。通过绘制针对低聚糖浓度的荧光输出, 生成剂量-响应曲线。比较标准对细胞裂解液的反应。
4. 有选择地去除乳糖
注: 生物传感器对乳糖敏感, 生物传感器最好通过乳糖选择性地检测 Hmo。其中一项战略将包括如第3.2 节所述, 清洗牢房。下文介绍了另外三种战略。
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商业纯化β-半乳糖苷酶的治疗
- 将冻干β-半乳糖苷酶溶解到 1, 000 (FCC 乳糖酶) Unitss\ ml, 在 1 mM MgCl2中或在溶液中使用商业β-半乳糖苷酶。
- 为了确定所需酶的最佳浓度, 在测井中期培育 2 '-fl 生物传感细胞, 并在测井中期用 2 G/l 和 2.9 g/L 2 '-fl 诱导。
- 在100μl 培养中, 添加可变数量的β-半乳糖苷酶, 最多12个单位, 并让培养物在37°c 下生长, 并持续晃动。
- 测量第2.1 节所述的荧光, 并通过确定最小酶浓度来计算所需的最佳酶单位, 以实现所需的信号衰减。
- 在24小时内生长的 2 '-fl 生产细胞中, 加入β-半乳糖苷酶的最佳单位, 在37°c 下孵育过夜。按照第3.3 节所述, 继续执行确定 2 '-fl 滴度的协议。
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LacZ + 菌株的预处理
- 开始 2 '-FL 生产菌株的25毫升培养, 一旦在日志中诱导, 在37°c 孵育24小时。
- 在 LB 中接种大肠杆菌BL21 (de3) 培养物, 在37°c 时生长到日志中阶段, 并在24小时培养中加入50毫升 (2:1)。
- 在37°c 下孵化 3小时. 按照第3.3 节所述的确定 2 '-fl 滴度的协议进行。
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乳糖沉淀与乙醇
注: 本节改编自 Matkki 等人。- 开始 2 '-FL 产生菌株的25毫升培养, 一旦在日志中诱导, 在37°c 孵育24小时。
- 在培养物中加入两卷100% 乙醇, 摇匀, 在37°c 孵育4小时。
- 以 900 x g离心悬浮液15分钟收集上清液, 在4°c 下孵育, 从而沉淀乳糖。
- 通过滤纸 (11μm) 传递溶液, 取出沉淀的乳糖。收集含有 2 '-fl 的细胞裂解液滤液, 可通过以下第3.3 节进行量化。
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Representative Results
我们设计了一个专门针对 2 '-fl 的完整细胞生物传感器, 可与低聚糖的生物技术生产结合使用。这依赖于特定的酶裂解产生乳糖, 从而激活乳酸操作子, 导致在乳糖诱导启动子下的报告荧光蛋白的表达, 与2 '-fl 的数量。为了证明其连锁特异性, 还对异构体--3-岩藻糖 (3-FL) 进行了测试。基因电路包含两个部分: 一个岩藻苷酶基因, Afc或afcA, 由一个构成启动子驱动, 导致本构表达克隆到一个向量上, 其信号序列是由岩藻酶基因上游编码的 pelb促进周围的血浆出口, 以及含有 T7 启动子驱动 GFP 表达的荧光记者系统。第一部分是质粒 pAfcA 和第二个质粒 pET28:GFP 的报告系统。最后的结构被转化为大肠杆菌BL21 (de3), 这是一种广泛可用的菌株, T7 rna 聚合酶在乳糖反应 placuv5 启动子的控制下集成到基因组中。图 1a显示了原理图设计, 以便读者能够遵循生物传感器的工作原理。图 1 b显示了在流式细胞仪上分析的不同诱导条件下的荧光信号。与我们的假设一致, 2 '-fl 生物传感器与仅矢量控制或 3-fl 生物传感器相比, 荧光增加了100倍以上。这表明了生物传感器的高链接特异性。为了确保信号确实是由于去甲酰化, 我们通过在诱导过程中向培养物中添加商业α-1, 2-岩藻苷酶来进行控制, 这一点被证实在右侧的条形上。该检测的灵敏度可以通过生成具有不同碳水化合物水平的剂量-反应曲线来确定 (图 2a)。从图中看, 2 '-fl 检测的动态线性范围在40到 400 mgl 之间, 检测的极限为 4 mg l。这种分析可以在一个工作日的过程中进行, 如报告表达式动态的快照测量所示 (图 2b)。
最后, 我们介绍了如何利用生物传感细胞从工程 2 '-fl 生产商应变中检测和量化 2 '-fl。由于这种菌株使用乳糖作为底物, 我们制定了减少来自外源乳糖的信号的策略, 以便信号读出直接对应于 2 '-fl 浓度 (图 3 a)。一种策略是使用不对改性乳糖起作用的β-半乳糖苷酶对乳糖进行酶降解。这可以通过商业β-半乳糖苷酶, 优先作用于乳糖, 减少乳糖信号的20% 的原始 (图 3B) 或通过孵育与 lacz + 应变, 野生型 BL21 (de3), 这在3小时内下降乳糖信号到背景级别 (图 3c)。最后的策略是使用乙醇, 它不仅有选择地沉淀乳糖, 而且还裂解产生细胞, 细胞裂解是下游的一个必要步骤 (图 3d)。这是一个简单的提取过程, 但由于 2 '-fl 的回收率低于其他方法, 可能由于 2 '-fl 的某些结晶而造成的损失, 因此应注意。尽管添加了乙醇, 但我们没有观察到生物传感细胞的生长受到显著抑制, 很可能是因为培养物中的最终乙醇浓度很低 (lt;2%, v/v)。最后, 我们演示的最有效但最耗时的方法是在细胞裂解前对细胞进行颗粒和清洗, 以释放细胞内的 2 '-fl (图 3e)。我们建议读者根据效率和时间及试剂的可用性, 酌情选择适当的乳糖去除方法。
图 3E还显示了我们在生物技术环境中可靠量化 2 '-fl 的能力。我们用乳糖培养了 2 '-fl 产生的 2 '-fl 菌株11或岩藻基转移酶阴性突变体 (负对照), 以监测细胞裂解液中 2 '-fl 的生产。在培养细胞后, 我们使用生物传感器和高效液相色谱 (HPLC) 测量浓度进行验证 (补充图 1)。2 '-fl 对生产过程和控制裂解液的剂量响应曲线非常相似, 这表明在细胞裂解液的背景下对 2 '-fl 进行了定量测量。
图 1: 2 '-fl 生物传感器设计示意图和代表性数据.(A) 2 '-富西淀粉乳糖 (2 '-fl) 进入细菌外质, 并通过异源表达的岩溶酶转化为乳糖。乳糖被输送到细胞质并转化为烯丙糖。这激活了大肠杆菌 bl21 (DE3) 中的原生 lacuv5 启动子, 产生 T7 rnap, 在 t7 启动子下转录 gfp, 从而导致荧光蛋白表达。(B) 检测 2 '-fl 和 3-fl. 含有 Pet28:gfp 和 pafc (绿色)、pAfcB (品红色) 或空矢量控制 (蓝色) 的细胞被诱导过夜, 不含糖, 2 '-fl, 2 '-fl 与外生添加α-1, 2-岩溶酶, 3-fl, 或乳糖。所有数据平均为三个生物副本, 每个副本分析一式三份, 其中误差条表示标准与平均值的偏差。通过 Tukey 的多重对比试验确定了统计意义, * * 表示 p < 0.01。 这一数字最早出现在 Enam 和 Mansalell14 中, 经允许再使用。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 用于 2 '-fl 检测的生物传感器的特性.(A) 生物传感器探测和传递功能的限制。描述不同量 2 '-fl 培养的 Pafca\ fl (绿色圆圈) 或空对照向量 (蓝色钻石) 的平均荧光的响应曲线。(B) 记者表达的时间过程。用 2 '-Fl (绿色正方形) 孵育菌株 pAfcA, 在诱导8小时内对荧光进行监测。用乳糖孵育菌株是一种对照。所有数据平均为三个生物副本, 每个副本分析一式三份, 其中误差条表示标准与平均值的偏差。这一数字最早出现在 Enam 和 Mansalell14 中, 经允许再使用。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 从生产者应变检测和定量 2 '-fl.(A) 工作流程, 演示生物传感器在一个简单的协议中的使用, 重点是消除残余乳糖的噪音。(B) 通过β-半乳糖苷酶酶消化去除乳糖。采用诱导时含有不同数量外源β-半乳糖苷酶的生物传感器培养物, 对含有 0.3% 2 '-fl (绿色正方形) 或0.2% 乳糖 (蓝圈) 的培养物进行了荧光检测。(C) 用野生型 lacz + 菌株孵育乳糖。含有 0.3% 2 '-fl (绿色圆圈) 的 LB, 0.2% 乳糖 (蓝色正方形) 或1:1 混合物 (0.2% 乳糖当量, 即0.1% 乳糖 + 0.15 2 '-fl, 品红色三角形) 用 BL21 (DE3) 细胞孵育不同时间, 然后添加到生物传感器培养物中, 用于孵育后的荧光测量。(D) 乳糖沉淀和乙醇预处理细胞裂解。用2体积乙醇对 JM109 Gwbc-导向 (蓝三角) 细胞进行发酵, 并在孵育前用荧光生物传感器细胞进行过滤, 并与未处理的 JM109 Gwbc-银培养的荧光进行比较 (绿色正方形)。(E) 细胞裂解液中 2 '-fl 的定量。对生物传感器进行了评估, 认为它能够从代谢工程的生产者菌株中检测到 2 '-fl。由 JM109 Gwbc-助酚 (品红色圆圈) 的粗裂解物的加入所产生的荧光测量, 2 '-fl, 如 lysate 量化), 2 '-fl 的定义金额为非生产者菌株 JM109 GwBC-细胞裂解物 (绿色正方形), 或 JM109 GwBC-菌株粗裂解物 (蓝色钻石)。采用高效液相色谱法定量测定生产菌株中的 2 '-fl, 验证了结果。所有数据平均为三个生物复制, 每个副本分析一式三份, 其中垂直误差条代表标准偏差与平均荧光和水平误差条代表标准偏差 2 '-FL 测量在 triplicate三重奏。这一数字最早出现在 Enam 和 Mansalell14 中, 经允许再使用。请点击这里查看此图的较大版本.
补充图 1:2 '-fl 的 HPLC-MS 分析.(A) 2 '-fl (m/z511) 的外量离子色谱图。商业标准的色谱图显示在顶部。底部显示了 Jm109gwbc-f2 菌株 (10倍稀释) 中 2 '-Fl 的色谱图。511 mz 的峰值是加钠。(B) 从300-800 扩大了质谱, 其中最丰富的信号集中在商业标准 (顶部) 和 2 '-fl 从生产商应变 (底部)。(C) 通过 LC-MS 分析建立了一个标准曲线, 其商业 2 '-fl 水平不同。误差线表示三次测量的标准偏差。请点击此处下载此文件.
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Discussion
我们提出了一种高通量的策略, 用于检测有豆科乳脂质的母乳低聚糖的链接。这是通过基因工程大肠杆菌构建整个细胞生物传感器来实现的, 在与特定糖类诱导时, 大肠杆菌会以荧光信号做出反应。该协议还详细介绍了如何利用生物传感器检测和量化代谢工程细菌株中的 Hmo。
与色谱质谱方法相比, 我们的协议具有较高的吞吐量, 并具有较高的替代方法优势。低检测极限和广泛的动态范围允许直接测量 Hmo。
该协议中的关键步骤发生在制备生成菌株的细胞裂解物中。为了确保 2 '-fl 的最大滴度, 提供最佳条件至关重要。由于超声参数或感应时间的原因, 批次的变化可能会产生。在生物传感器的特性描述过程中, 应注意。还建议对实验中的所有步骤运行适当的控件, 以确保结果一致。
我们的协议的一个局限性是它依赖乳糖进行诱导, 当乳糖自然存在时, 如母乳中, 或用作 Hmo 生物技术生产中的底物时, 乳糖就成为瓶颈。我们已经解决了这一问题, 有四个不同的策略来消除信噪比, 以便生物传感器可以有选择地检测乳糖。
这里介绍的基因编码全细胞生物传感器将允许优化 Hmo 的制造, 因为许多反应条件或生物反应器参数可以在几个小时内平行检测。当在96或384个井板上进行时, 该方法显示了每天筛选数千个样本的可能性。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了爱荷华州立大学创业基金的支持。F. e. 的部分资金来自 NSF Trecect 研究金和 Manley Hoppe 教授职位。T. j. m. 得到了 Karen 和 Denny Vaughn 学院研究金的部分支持。作者感谢爱荷华州立大学流式细胞仪设施和 w. m. Keck 代谢代谢研究实验室在荧光和 LC-MS 研究方面提供的协助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2’-Fucosyllactose | Carbosynth | 41263-94-9 | |
| 3-Fucosyllactose | Carbosynth | 41312-47-4 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Flow Cytometer | BD | FACSCanto Plus RUO | |
| HPLC | Agilent Technologies | 1100 Series HPLC system | |
| HPLC Column | Luna | C18 reversed phase column | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | 11815024 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Lactose | Fisher Scientific | 64044-51-5 | |
| M9, Minimimal Salts, 5x | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| MS | Agilent Technologies | Mass Selective Trap SL detector | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 13472-35-0 |
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