Ensaio de imunoprecipitação cromatina utilizando nucleases Microcócicas em células de mamíferos

Resumo

A imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é uma ferramenta poderosa para a compreensão dos mecanismos moleculares da regulação genética. No entanto, o método envolve dificuldades na obtenção de fragmentação cromatina reprodutível por cisalhamento mecânico. Aqui, nós fornecemos um protocolo melhorado para um ensaio da microplaqueta usando a digestão enzimática.

Resumo

Para expressar fenótipos celulares nos organismos, as pilhas vivas executam a expressão de gene conformemente, e os programas transcricional jogam um papel central na expressão de Gene. A maquinaria transcricional celular e suas proteínas da modificação da cromatina coordenam para regular a transcrição. Para analisar a regulação transcricional no nível molecular, vários métodos experimentais, tais como deslocamento de mobilidade eletroforética, repórter transiente e ensaios de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) estão disponíveis. Nós descrevemos um ensaio modificado da microplaqueta em detalhe neste artigo por causa de suas vantagens em mostrar diretamente modificações do histona e as interações entre proteínas e ADN nas pilhas. Uma das etapas chaves em um teste bem sucedido da microplaqueta é shearing da cromatina. Embora a sonicação seja comumente usada para a cromatina de corte, é difícil identificar condições reprodutíveis. Em vez de cromatina de corte por sonicação, utilizou-se a digestão enzimática com nuclease microcócica (MNase) para obter resultados mais reprodutíveis. Neste artigo, nós fornecemos um protocolo de ensaio de ChIP simples usando MNase.

Introdução

A expressão gênica em células de mamíferos é regulada firmemente e dinamicamente, e a transcrição é uma das etapas-chave. A transcrição gênica é regulada principalmente por fatores de transcrição e histonas. Um fator de transcrição é uma proteína que se liga a sequências específicas de DNA e controla a transcrição genética. Estes fatores promovem ou inibem o recrutamento do RNA polymerase II (PolII), que inicia a síntese de mRNA do ADN genomic como um molde¹. As modificações da histona tais como a acetilação e a metilação de resíduos da cauda de histona afetam positivamente e negativamente a transcrição do gene alterando a estrutura da cromatin....

Protocolo

1. preparação de reagentes

1. Fazer 18,5% paraformaldeído (PFA) solução. Adicione 0,925 g de PFA, 4,8 mL de água (use água ultrapurificada em todo o protocolo) e 35 μL de KOH de 1 M em um tubo de plástico cônico de 50 mL. Feche a tampa firmemente e aqueça o tubo em uma taça de vidro de 400-600 mL contendo aproximadamente 200 mL de água usando um microondas. Retire o tubo antes de a água começar a ferver e vórtice do tubo para dissolver o PFA. Permita que o PFA esfrie à temperatura ambiente e armazene no gelo.
   Nota: Repita o aquecimento e a mistura até que o PFA se dissolve completamente. Prepare a solução de PFA imediatamente antes da reticu....

Resultados

A cromatina digerindo é um dos passos importantes para um ensaio de ChIP. Nós usamos mnase para digerir a cromatina para obter uma mistura de oligomers Nucleossomo. Na etapa de digestão MNase, MNase pode atravessar a membrana nuclear e digerir a cromatina. No entanto, a cromatina digerida não pode atravessar a membrana e permanece nos núcleos. Para liberar a cromatina digerida dos núcleos, sonication breve é necessário. A Figura 1a mostra microfotografias antes e depois da sonicação da suspe.......

Discussão

Embora o sonication é comumente usado para obter cromatina fragmentada, é demorado e complicado para identificar condições reprodutíveis. Neste protocolo, nós usamos a digestão de MNase porque a digestão da enzima deve ser mais fácil identificar circunstâncias reprodutíveis. Um breve passo sonication após a digestão MNase (ver passo 2,2) foi necessário para quebrar a membrana celular e liberar a cromatina digerida. Portanto, o poder sonication em nosso protocolo deve ser o mais baixo possível. Utilizamos as mesmas condiç.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,5 M EDTA (pH 8,0)	Thermo Scientific	AM9010
2 M KCl	Thermo Scientific	AM9010
2x iQ SYBR Green supermix	Bio-Rad	1706862
5 M NaCl	Thermo Scientific	AM9010
50 bp Escada de DNA	New England Biolabs	N3236S
Agarose	Produto de pesquisa International	A20090
Octilfenoxi poli (etilenooxi) etanol ramificado	Millipore Sigma	I8896	IGEPAL CA-630
ChIP Proteína G grânulos magnéticos	de sinalização celular	9006S
Tampão de diluição de imunoprecipitação de cromatina (ChIP)	Millipore Sigma	20-153	Composição do tampão: 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl.
Corante de Carregamento em Gel Roxo (6x)	New England Biolabs	B7024S
Glycine	Bio-Rad	161-0724	Grau de eletroférese
Glicogênio	Millipore Sigma	G1767	19-22 mg/mL
Halt Protease e Inibidor de Fosfatase Coquetel, sem EDTA (100x)	Thermo Scientific	78445
Tampão de Lavagem de Complexo Imune com Alto Sal	Millipore Sigma	20-155	Composição do tampão: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 500 mM NaCl.
Anticorpo histona H3K4me3 (pAb)	Active Motif	39915
LiCl Complexo Imune Wash Buffer	Millipore Sigma	20-156	Composição do tampão: 0,25 M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% de ácido desoxicólico (sal de sódio), 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8,1.
Tampão de lavagem de complexo imune com baixo teor de sal	Millipore Sigma	20-154	Composição do tampão: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 150 mM NaCl.
Rack Magna GrIP (8 poços)	Millipore Sigma	20-400	Qualquer tipo de suporte de separação magnética que seja compatível com um tubo de 1,5 mL está bem.
A nuclease microcócica	New England Biolabs	M0247S	vem com tampão 10x (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7,9 a 25 ° C) e 100x BSA (10 mg/mL)
NaHCO3	JT Baker	3506-01
Coelho normal IgG	Millipore Sigma	12-370
PIPES	Millipore	Sigma P6757
Proteinase K	Millipore Sigma	3115887001
Sistema de PCR em tempo real	Bio-Rad	CFX96, C1000
RNA pol II CTD anticorpo fosfo-Ser5	Active Motif	39749
SDS	Boehringer Mannheim	100155	de grau electroférese
	Millipore Sigma	S5636
Sonicator equipado com uma sonda microtip	QSONICA	Q700	Qualquer tipo de sonicadores que sejam compatíveis com um tubo de 1,5 mL está bem.
Fenol UltraPuro: Clorofórmio: Álcool Isoamílico (25: 24: 1, v / v)	Thermo Scientific	15593031	pH 8,05

Tecnologia Acetato de sódio