Artigo de método

Ensaio de imunoprecipitação cromatina utilizando nucleases Microcócicas em células de mamíferos

DOI:

10.3791/59375

⸱

10 de maio de 2019

 , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Beckman Research Institute of City of Hope

Neste artigo

Resumo

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A imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é uma ferramenta poderosa para a compreensão dos mecanismos moleculares da regulação genética. No entanto, o método envolve dificuldades na obtenção de fragmentação cromatina reprodutível por cisalhamento mecânico. Aqui, nós fornecemos um protocolo melhorado para um ensaio da microplaqueta usando a digestão enzimática.

Resumo

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Para expressar fenótipos celulares nos organismos, as pilhas vivas executam a expressão de gene conformemente, e os programas transcricional jogam um papel central na expressão de Gene. A maquinaria transcricional celular e suas proteínas da modificação da cromatina coordenam para regular a transcrição. Para analisar a regulação transcricional no nível molecular, vários métodos experimentais, tais como deslocamento de mobilidade eletroforética, repórter transiente e ensaios de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) estão disponíveis. Nós descrevemos um ensaio modificado da microplaqueta em detalhe neste artigo por causa de suas vantagens em mostrar diretamente modificações do histona e as interações entre proteínas e ADN nas pilhas. Uma das etapas chaves em um teste bem sucedido da microplaqueta é shearing da cromatina. Embora a sonicação seja comumente usada para a cromatina de corte, é difícil identificar condições reprodutíveis. Em vez de cromatina de corte por sonicação, utilizou-se a digestão enzimática com nuclease microcócica (MNase) para obter resultados mais reprodutíveis. Neste artigo, nós fornecemos um protocolo de ensaio de ChIP simples usando MNase.

Introdução

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A expressão gênica em células de mamíferos é regulada firmemente e dinamicamente, e a transcrição é uma das etapas-chave. A transcrição gênica é regulada principalmente por fatores de transcrição e histonas. Um fator de transcrição é uma proteína que se liga a sequências específicas de DNA e controla a transcrição genética. Estes fatores promovem ou inibem o recrutamento do RNA polymerase II (PolII), que inicia a síntese de mRNA do ADN genomic como um molde1. As modificações da histona tais como a acetilação e a metilação de resíduos da cauda de histona afetam positivamente e negativamente a transcrição do gene alterando a estrutura da cromatina2. Como as alterações na expressão gênica afetam o contexto celular, é essencial examinar os mecanismos moleculares pelos quais a transcrição é regulada.

Até o momento, vários métodos para investigar a regulação da transcrição genética estão disponíveis. O ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforético (EMSA), também denominado ensaio de mudança de gel, é usado para analisar uma interação proteína-DNA3. Um extrato nuclear de células de interesse é incubado com um isótopo radioativo (por exemplo, 32P)-sonda de DNA rotulada e electrophoresed em um gel de poliacrilamida. Seu autoradiograma mostra que o complexo DNA-proteína migra mais lentamente do que a sonda em um gel. Na presença de um anticorpo contra a proteína, o complexo DNA-proteína-anticorpo migra em um gel mais lentamente do que o complexo DNA-proteico. Esta banda superdeslocada revela ligação específica entre o DNA e a proteína. No entanto, a EMSA só determina uma interação DNA-proteína específica em um sistema livre de células e, portanto, permanece desconhecida se a interação controla a transcrição em células vivas. O ensaio transiente do repórter, chamado geralmente o ensaio do repórter do luciferase, foi desenvolvido para endereçar o Regulamento da expressão de gene nas pilhas. Tipicamente, uma região genomic ascendente de um gene do interesse é inserida em um plasmídeo do repórter, transfected transiente nas pilhas, e a atividade do repórter é medida. Uma variedade de mutantes do apagamento permite a identificação das regiões que são responsáveis para a regulação do gene. Mesmo que um ensaio de repórter é uma ferramenta útil para a identificação de fatores de transcrição e seqüências de DNA de ligação controlando a transcrição, este método tem uma grande desvantagem em que um plasmídeo repórter está livre de estrutura cromatina e não reflete "real" máquinas de transcrição. Além disso, as alterações nas modificações de histona não podem ser determinadas pelo sistema.

O desenvolvimento do método da imunoprecipitação da cromatina (microplaqueta) foi baseado em relatórios de Jackson e de Chalkley que a fixação da "pilha inteira" com o formaldehyde preservou a estrutura da cromatina4,5. Desde então, muitas técnicas relacionadas foram desenvolvidas e melhoradas6. Em ensaios de ChIP, as células são fixadas com formaldeído para cross-link DNA e proteínas. A cromatina é fragmentada e, em seguida, imunoprecipitado com anticorpos de interesse. O complexo imunológico é lavado, e o DNA é purificado. A amplificação de PCR com iniciadores direcionados a uma determinada região do genoma revela a ocupação de proteínas de interesse no genoma.

Embora o ChIP seja uma ferramenta poderosa para identificar as interações de proteínas como fatores de transcrição e histonas modificadas com DNA, o método envolve algumas dificuldades, como uma etapa de fragmentação da cromatina, na prática. Sonication tem sido amplamente utilizado para a cromatina de corte; no entanto, é complicado identificar condições reprodutíveis. O tratamento micrococcal do nuclease (MNase) é um método alternativo para o corte da cromatina. MNase é um Endo-exonuclease que digere duplo-encalhado, único-encalhado, o ADN circular e linear e o RNA. É relativamente fácil determinar as condições, incluindo as quantidades de cromatina e enzima, temperatura e tempo de incubação, para uma melhor fragmentação da cromatina. Modificamos e simplificamos os protocolos existentes, e estabelecemos um método simples e reprodutível. Este papel fornece o protocolo para um ensaio da microplaqueta usando MNase em pilhas de mamíferos.

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Protocolo

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1. preparação de reagentes

  1. Fazer 18,5% paraformaldeído (PFA) solução. Adicione 0,925 g de PFA, 4,8 mL de água (use água ultrapurificada em todo o protocolo) e 35 μL de KOH de 1 M em um tubo de plástico cônico de 50 mL. Feche a tampa firmemente e aqueça o tubo em uma taça de vidro de 400-600 mL contendo aproximadamente 200 mL de água usando um microondas. Retire o tubo antes de a água começar a ferver e vórtice do tubo para dissolver o PFA. Permita que o PFA esfrie à temperatura ambiente e armazene no gelo.
    Nota: Repita o aquecimento e a mistura até que o PFA se dissolve completamente. Prepare a solução de PFA imediatamente antes da reticulação (etapa 2.1.3).
  2. Fazer 1,25 M de solução de glicina. Dissolva 14, 7 g de glicina em 150 mL de água e filtre através de um filtro de tamanho de poros de 0,22 μm. Conservar a 4 ° c.
  3. Faça o tampão da lise da pilha da microplaqueta. Dissolva 378 mg de tubos, 10,6 ml de 2 M KCl e 1,25 g de etanol ramificado de octilfenoxi poli (etileneoxi) em água. Ajuste o pH para 8,0 com 1 M de KOH a 4 ° c e faça até 250 mL. Filtre através de um filtro de tamanho de poros de 0,22 μm e armazene a 4 ° c.
  4. Faça o tampão micrococcal da digestão do nuclease (MNase). Para fazer 1 ml, misture 0,1 ml de tampão de digestão de 10x mnase, 10 μL de solução de 100x BSA, 10 μL de ditiotreitol de 0,1 M e 0,88 ml de água.
  5. Fazer 1 M de NaHCO3. Dissolva 4,2 g de NaHCO3 em 50 ml de água e filtre através de um filtro de tamanho de poros de 0,22 μm. Armazene à temperatura ambiente.
  6. Fazer 10% de sódio Dodecil sulfato (SDS). Dissolver 5 g de SDS em 50 mL de água. Armazene à temperatura ambiente.
  7. Faça a reserva de eluição. Misturar 15 μL de 1 M de NaHCO3, 15 ΜL de SDS 10% e 120 μL de água para obter 150 μL de tampão de eluição para uma amostra.
    Nota: Aumente os volumes proporcionalmente, dependendo do número de amostras.
  8. Faça 3 M de acetato de sódio (pH 5,2) solução. Dissolver 24,6 g de acetato de sódio anidro em água. Ajuste o pH para 5,2 com ácido acético e faça 100 mL. Filtre através de um filtro de tamanho de poros de 0,22 μm e armazene à temperatura ambiente.

2. determinação das condições de digestão de MNase

Nota: Na etapa 2 do protocolo, um exemplo que usa o VCaP, pilhas humanas do cancro da próstata é apresentado. Qualquer linha celular de mamíferos pode ser usada; consulte observação nas etapas.

  1. Preparação de cromatina reticulada
    1. Manter células de VCaP em DME-alta glicose suplementada com 10% soro fetal bovino (FBS) em 37 ° c em uma incubadora de dióxido de carbono. Sementes de células VCaP em 4 x 106 células em seis pratos de 6 cm em 4 ml de meios de cultura e cultura por 3 dias.
      Nota: Use a mídia de cultura apropriada para cada linha de célula. Até 10 x 106 células podem ser semeadas em um prato de 6 cm ou 10 cm. Para células suspensas, células de semente em frascos de T25. O número de pratos ou frascos depende de quantas doses são testadas para a digestão de MNase. Se forem testadas 4 doses, prepare 6 pratos ou frascos. Consulte também a etapa 2,2.
    2. Desanexar células vcap de um prato usando tripsina e contar a célula. Calcule o número da célula em um prato. Para células suspensas, remova uma pequena quantidade de suspensão celular de um balão e número de células de contagem.
    3. Adicionar 0,229 mL de 18,5% de PFA a um prato de 6 cm em 4 mL de meios de cultura a uma concentração final de 1%. Delicadamente, mas completamente agitar um prato ou balão para distribuir PFA uniformemente. Incubar à temperatura ambiente por exactamente 10 min.
      Nota: Nesta etapa, a cromatina e as proteínas são reticuladas. Como o PFA é tóxico, realize esta etapa em uma capa de fumaça química e use equipamento de proteção pessoal adequado.
    4. Após 10 min, adicione 0,47 mL de solução de glicina de 1,25 M a uma concentração final de 125 mM. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
      Nota: A glicina neutraliza o excesso de PFA para interromper a reticulação.
    5. Aspirar formaldeído/glicina/meios de cultura. Lave as células adicionando 4 mL de soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS) duas vezes. Para células suspensas, transfira a suspensão da célula para um tubo cônico de 15 mL e centrifugue a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e adicionar um volume médio de PBS e suspender totalmente. Repita este passo. Descarte os resíduos líquidos corretamente, pois eles contêm formaldeído.
    6. Prepare PBS contendo protease e inibidor da fosfatase cocktail (PIC), acrescentando 1/100 volume de 100x PIC para PBS. Aspirar PBS de um prato e adicionar 1 mL por prato de PBS contendo PIC. Raspe as células e transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Para células suspensas, basta transferir a suspensão para um tubo de 1,5 mL.
    7. Centrifugue os tubos em 3.000 x g por 5 minutos na temperatura ambiente para recuperar a pelota da pilha. Retire o PBS completamente usando uma pipeta. Registre o número da célula por tubo e armazene o pellet de células em-80 ° c.
  2. Lise celular e digestão de MNase
    Nota: O volume de reagente nas etapas a seguir é baseado em um tubo contendo 6 x 106 células. Ajustar o volume do reagente proporcionalmente, dependendo do número da célula; Quando um tubo contiver 2 x 106 células, utilize 100 μl de tampão de lise de células de chip (passo 2.2.1), tampão de digestão de MNase (passo 2.2.3) e tampão de diluição de chip (passo 2.2.5) e 10 μL de 0,5 M de EDTA (pH 8,0) (passo 2.2.4).
    1. Descongelar o pellet celular armazenado (células VCaP, contendo 6 x 106 células por tubo) preparado na etapa 2.1.7 no gelo. Prepare o tampão da lise da pilha da microplaqueta suplementado com o PIC adicionando o volume 1/100 de 100x PIC ao amortecedor. Adicionar 300 μL de tampão de lise de células de ChIP suplementado com PIC e ressuscitem a pelota completamente. Vórtice do tubo para 15 s e incubar a suspensão no gelo por 10 min.
    2. Centrifugue a 9.000 x g durante 3 min a 4 ° c e retire o sobrenadante completamente. Ressuscitem o pellet em 300 μL de tampão de digestão de MNase.
    3. Diluir MNase (2.000 unidade de gel/μL) com tampão de digestão MNase para dar 50 unidades de gel/μL. Adicionar 0, 0,5, 1, 2,4 μL de 50 unidades de gel/μL de MNase à suspensão e incubar a 37 ° c por exactamente 10 min, misturando por inversão a cada 2,5 min.
      Nota: a tabela 1 mostra as quantidades ideais de MNase em várias linhas celulares.
    4. Adicionar 30 μL de 0,5 M EDTA (pH 8,0) para terminar a digestão de MNase e vórtice brevemente. Incubar por 5 min no gelo. Centrifugue a 9.000 x g durante 5 min a 4 ° c e retire o sobrenadante completamente.
    5. Prepare o tampão da diluição da microplaqueta suplementado com o PIC adicionando o volume 1/100 do PIC 100x ao amortecedor. Ressuscitem o pellet em 300 μL de tampão de diluição de ChIP suplementado com PIC.
    6. SONICATE a suspensão no gelo usando um sonicador equipado com uma sonda microtip. Use as seguintes condições de sonication: amplitude 2, tempo processado 15 s, pulso em 5 s, pulso desligado 30 s. Tome 1 μL da suspensão e coloque-o sobre um vidro deslizante e observe-os utilizando um microscópio. Certifique-se de que a estrutura da célula está quase quebrada.
      Nota: A Figura 1a mostra microfotografias representativas da suspensão da célula vcap antes e depois da sonicação. Esta etapa é para liberar a cromatina digerida no sobrenadante quebrando as membranas nucleares. Uma configuração de energia deve ser ajustada para menos de 5% da potência máxima e tentar sonication por 5 s três vezes com mais de um intervalo de 30 s. Se o controle da wattagem está disponível, ajuste o ajuste da potência a 5 W e processe as amostras para o total 15 s como mencionado acima para dar a potência total de 70-75 J. Verifique se a estrutura da célula está quebrada como mencionado acima. Se não for suficiente, repita mais uma vez. A condição descrita acima é praticamente aplicada a todas as linhas de células testadas.
    7. Centrifugador a 9.000 x g durante 10 min a 4 ° c, transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e guarde 20 μl da cromatina digerida para o passo 2,3. Guarde o restante em-80 ° c.
  3. Reticulação reversa, purificação de DNA e análise de cromatina digerida
    1. Adicionar 75 μL de água, 4 μL de NaCl de 5 M e 1 μL de proteinase K a um tubo de parafuso de 1,5 mL. Adicionar 20 μL de cromatina digerida de várias condições de digestão de MNase preparadas na etapa 2.2.7 a tubos contendo água, NaCl e proteinase K. Feche a tampa firmemente, misture completamente, e incubar o tubo em 65 ° c durante a noite.
      Nota: Este passo é para a remoção de reticulação entre proteínas e DNA.
    2. Prepare dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mL por condição. Adicionar 100 μL de fenol: clorofórmio: isoamylalcohol (25:24:1) (PCI) a um tubo de 1,5 mL. Adicionar 10 μL de acetato de sódio a 3 M (pH 5,2) e 2 μL de glicogênio a outro tubo.
      Nota: O uso de clorofórmio: isoamylalcohol não é necessário7. O aumento do volume pode resultar em baixa recuperação do DNA após a precipitação do etanol8.
    3. Centrifugue o tubo contendo cromatina digerida da etapa 2.3.1 brevemente e adicione 100 μL de PCI. Feche a tampa firmemente e vórtice vigorosamente para formar emulsão. Centrifugue o tubo na velocidade máxima (por exemplo, 20.000 x g) para 30 s na temperatura ambiente.
    4. Tome com cuidado a fase superior que contem o ADN e adicione ao tubo que contem o PCI preparado na etapa 2.3.2. Vórtice vigorosamente e centrifugar o tubo como passo 2.3.3.
      Nota: Se a fase mais baixa estiver contaminada, centrifugue o tubo novamente, ou remova a maior parte da fase inferior primeiro, centrifugue o tubo e tome a fase superior.
    5. Tome cuidadosamente a fase superior conforme descrito no passo 2.3.4 e acrescente ao tubo contendo acetato de sódio e glicogênio preparados no passo 2.3.2. Adicionar 250 μL de etanol. Misture por inversão e incubar por 10 min à temperatura ambiente. Centrifugue o tubo na velocidade máxima (por exemplo, 20.000 x g) por 30 min a 4 ° c.
      Nota: A incubação da solução à temperatura ambiente não afeta a recuperação do DNA8,9.
    6. Confirme as pelotas na parte inferior do tubo. Retire cuidadosamente o sobrenadante para não perturbar a pelota e adicionar 500 μL de etanol a 70%. Centrifugue o tubo na velocidade máxima (por exemplo, 20.000 x g) por 5 min a 4 ° c.
    7. Retire o sobrenadante completamente e seque o pellet por aproximadamente 5 min à temperatura ambiente. Dissolver a pelota em 20 μL de Tris de 10 mM · HCl/1 mM EDTA (pH 8,0) (TE). Medir a concentração de DNA usando um espectrofotômetro UV.
    8. Misture 0,5 μg de DNA com um corante de carregamento de gel e aplique a 2% de gel de agarose. Electrophorese as amostras em 100 V no tampão do Tris-Acetato-EDTA até que a tintura roxa migrou ao dois-terço do gel e mancha um gel com o brometo do etídio de 0,5 μg/ml por 10 minutos. Tire uma foto do gel.
      Nota: Consulte a Figura 2 para obter detalhes.

3. Chromatinimmunoprecipitação

  1. Preparação de cromatina digerida
    1. Preparem-se. Para células aderentes, semente 2-10 x 106 células por prato em 2 pratos (6 cm ou 10 cm) por grupo de tratamento e permitir que as células para anexar ao fundo de pratos para mais de 1 dia. Para células suspensas, semente em 2 T25 frascos por grupo de tratamento. Trate as células como desejado.
    2. Tomar um prato ou balão de cada grupo e contar o número da célula conforme descrito no passo 2.1.2. Prepare a cromatina reticulada como mencionado nas etapas 2.1.3-2.1.7.
    3. Lyse a pelota da pilha e a digestão de MNase como descrito nas etapas 2.2.1-2.2.7. Use a quantidade ideal de MNase para digerir a cromatina conforme determinado na etapa 2. Cromatina digerida da loja em-80 ° c.
    4. Inverter a ligação cruzada 20 μL de cromatina digerida e purificar o ADN tal como descrito no passo 2.3.8. Medir a concentração de ADN conforme descrito no passo 2.3.7. Electrophorese as amostras em gel de agarose 2% para verificar o tamanho da cromatina digerida como mencionado na etapa 2,3.
      Nota: A concentração de DNA é idêntica à da cromatina digerida armazenada preparada na etapa 3.1.3.
    5. Diluir uma amostra de cromatina digerida Cross-linked reversa da etapa 3.1.4 para dar 10 ng/μL com água e diluir serialmente para fazer concentrações de 1, 0,1, e 0, 1 ng/μL. armazene a-20 ° c.
      Nota: Estas amostras são usadas para padrões do PCR do tempo real.
  2. Imunoprecipitação
    Nota: nas etapas 3.2-3.5 do protocolo, a ocupação anti-trimethylated da histona H3 lisina 4 (H3K4me3) em pilhas de vcap é determinada. Veja também a Figura 3.
    1. Thaw cromatina digerida do passo 3.1.3. Mantenha todas as amostras no gelo.
    2. Prepare o tampão da diluição da microplaqueta suplementado com o PIC adicionando o volume 1/100 do PIC 100x ao amortecedor. Diluir a cromatina digerida para 5 μg/500 μL com tampão de diluição de ChIP suplementado com PIC. Prepare 1.000 μL mais extra para (1) IP com IgG não imune (controle IgG), (2) IP com H3K4me3.
    3. Adicionar 5 μL de 5 μg/500 μL de cromatina digerida a um tubo de parafuso de 1,5 mL como uma amostra de entrada (1% de um IP). Armazene a amostra em-80 ° c.
    4. Adicionar 500 μL cada um de 5 μg/500 μL de cromatina digerida a um tubo de parafuso de 1,5 mL como uma amostra de IP. Adicionar 2 μg de anticorpo ao tubo. Feche a tampa e incubar o tubo a 4 ° c durante a noite com mistura suave usando uma plataforma de balanço.
      Nota: Embora a quantidade óptima do anticorpo deva ser determinada empirically, 2 μg por o IP é recomendado no início.
    5. Adicione 30 μL de grânulos magnéticos da proteína G da microplaqueta-classe por o IP. Incubar o tubo a 4 ° c por 2 h com mistura suave usando uma plataforma de balanço.
      Nota: Pré-lavagem de contas magnéticas não é necessário.
  3. Lavagem do complexo imunológico e inversão de reticulação
    1. Gire para baixo o tubo do passo 3.2.5 brevemente. Coloque o tubo em um rack de polietileno contendo ímãs de poderosos por 1 min. Retire cuidadosamente o sobrenadante por aspiração.
    2. Adicionar 0,5 mL por tubo de baixo sal imune complexo tampão de lavagem. Dispersar as contas tocando suavemente ou brevemente vortexing o tubo. Incubar o tubo a 4 ° c por 5 min com mistura suave usando uma plataforma de balanço. Após 5 min, repita o passo 3.3.1.
    3. Adicionar 0,5 mL de tampão de lavagem do complexo imunológico de sal elevado por tubo. Dispersar e lavar as contas como passo 3.3.2. Após a lavagem, repita o passo 3.3.1.
    4. Adicione 0,5 mL de tampão de lavagem do complexo imune de LiCl por o tubo. Dispersar e lavar as contas como passo 3.3.2. Após a lavagem, repita o passo 3.3.1.
    5. Coloque o tubo em um rack magnético por 1 min. Retire o sobrenadante restante completamente.
    6. Adicionar 150 μL de tampão de eluição ao tubo. Vortex o tubo para dispersar os grânulos completamente. Feche a tampa e incubar o tubo a 65 ° c por 30 min, misturando por inversão ou vortexing a cada 5 min para dispersar as contas completamente.
    7. Durante a incubação, prepare um tubo de parafuso de 1,5 mL e adicione 6 μL de NaCl de 5 M e 2 μL de proteinase K. Thaw 1% amostra de entrada preparada na etapa 3.2.3. Adicionar 150 μL de tampão de eluição, 6 μL de NaCl de 5 M e 2 μL de proteinase K a 1% de amostra de entrada.
    8. Após a incubação, gire para baixo o tubo. Coloque o tubo em uma cremalheira magnética por 1 minuto e transfira o sobrenadante ao tubo do parafuso que contem o NaCl e o proteinase K preparados na etapa 3.3.7.
    9. Feche a tampa e vórtice todos os IP e amostras de entrada para misturar completamente. Incubar o tubo a 65 ° c durante a noite.
  4. Purificação de DNA
    1. Prepare o tubo como descrito em 2.3.2 e adicione 150 μL de PCI em vez de 100 μL. Em outro tubo, adicione 12 μL de acetato de sódio a 3 M (pH 5,2) e 2 μL de glicogênio.
    2. Retire o tubo da incubadora. Gire para baixo o tubo e adicione 150 μL de PCI.
    3. Vortex vigorosamente o tubo para formar emulsão. Centrifugue o tubo na velocidade máxima (por exemplo, 20.000 x g) por 30 s à temperatura ambiente.
    4. Transfira cuidadosamente 140 μL da fase superior para o tubo contendo PCI preparado no passo 3.4.1. Repita o passo 3.4.3.
      Nota: Consulte também nota no passo 2.3.4.
    5. Transfira cuidadosamente 120 μL de fase superior para o tubo contendo acetato de sódio e glicogênio preparados no passo 3.4.1.
      Nota: Consulte também nota no passo 2.3.4.
    6. Adicionar 300 μL de etanol. Misture por inversão e incubar por 10 min à temperatura ambiente.
    7. Centrifugue o tubo na velocidade máxima (por exemplo, 20.000 x g) por 30 min a 4 ° c. Lave o pellet como descrito no passo 2.3.6.
    8. Depois de secar o pellet como descrito na etapa 2.3.7, dissolva a pelota em 50 μL de TE. Conservar a-20 ° c.
  5. Detecção de fragmentos de DNA usando PCR em tempo real
    1. Descongelar as seguintes amostras: (1) IP com controle IgG, (2) IP com anti-H3K4me3, (3) 1% de amostra de entrada. Thaw também 4 doses de normas preparadas no passo 3.1.5 (total de 7 amostras).
      Nota: Use padrões do mesmo grupo para a quantificação de quantidades de DNA nas amostras de entrada e IP.
    2. Faça a solução de trabalho do PCR para 8 amostras. Misturar 40 μL de 2x Supermix de PCR em tempo real, 8 μL cada um dos 4 μM de primers para a frente e reverso, e 8 μL de água.
      Nota: Uma mistura de reação de PCR contém 5 μL de 2x Supermix de PCR em tempo real, 1 μL cada um dos 4 μM de primers para frente e reverso e 1 μL de água. As sequências da cartilha estão listadas na tabela 2.
    3. Alíquota 8 μL da solução de trabalho do PCR em um poço de uma placa do PCR. Adicione 2 μL de amostras do passo 3.4.8 ou normas a partir do passo 3.1.5.
    4. Sele a placa do PCR e execute o PCR usando as seguintes circunstâncias: 1) 95 ° c por 3 minutos para a desnaturação inicial, 2) 95 ° c para 10 s para a desnaturação, 3) 56 ° c para 30 s para o recozimento, 4) 72 ° c para 30 s para a extensão e a coleta de dados , repita os passos 2) para 4) para 55 ciclos. Após o ciclismo, medir uma curva de fusão do produto PCR. Analise os dados.
      Nota: Os dados brutos para a Figura 3 são mostrados na tabela 3. Calcule a quantidade inicial (SQ) das amostras usando uma curva padrão. Multiplicar SQ em 1% de entrada por 100 para ajustar um SQ de 1% de amostra de entrada para um IP para dar SQ ajustado na entrada (EQ. 1). Divida SQ na amostra IP por SQ ajustado na entrada para dar o valor de entrada% (método de entrada por cento, EQ. 2). Para calcular o enriquecimento de dobra, divida SQ em IP com anti-H3K4me3 por SQ em IP com controle de IgG (método de enriquecimento de dobra, EQ. 3).
      SQ ajustado na entrada = (SQ em 1% de entrada) x 100 (1)
      Percentagem de entrada de H3K4me3 = 100 x (SQ em IP com anti-H3K4me3)/(SQ ajustado na entrada) (2)
      Enriquecimento de dobra de H3K4me3 = (SQ em IP com anti-H3K4me3)/(SQ em IP com controle de IgG) (3)

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Resultados

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A cromatina digerindo é um dos passos importantes para um ensaio de ChIP. Nós usamos mnase para digerir a cromatina para obter uma mistura de oligomers Nucleossomo. Na etapa de digestão MNase, MNase pode atravessar a membrana nuclear e digerir a cromatina. No entanto, a cromatina digerida não pode atravessar a membrana e permanece nos núcleos. Para liberar a cromatina digerida dos núcleos, sonication breve é necessário. A Figura 1a mostra microfotografias antes e depois da sonicação da suspe...

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Discussão

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Embora o sonication é comumente usado para obter cromatina fragmentada, é demorado e complicado para identificar condições reprodutíveis. Neste protocolo, nós usamos a digestão de MNase porque a digestão da enzima deve ser mais fácil identificar circunstâncias reprodutíveis. Um breve passo sonication após a digestão MNase (ver passo 2,2) foi necessário para quebrar a membrana celular e liberar a cromatina digerida. Portanto, o poder sonication em nosso protocolo deve ser o mais baixo possível. Utilizamos as mesmas condiç...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Esta pesquisa é apoiada por royalties Genentech para a cidade da esperança. Este trabalho não é apoiado, no todo ou em parte, pelos institutos nacionais de saúde.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,5 M EDTA (pH 8,0)Thermo ScientificAM9010
2 M KClThermo ScientificAM9010
2x iQ SYBR Green supermixBio-Rad1706862
5 M NaClThermo ScientificAM9010
50 bp Escada de DNANew England BiolabsN3236S
AgaroseProduto de pesquisa InternationalA20090
Octilfenoxi poli (etilenooxi) etanol ramificadoMillipore SigmaI8896IGEPAL CA-630
ChIP Proteína G grânulos magnéticosde sinalização celular9006S
Tampão de diluição de imunoprecipitação de cromatina (ChIP)Millipore Sigma20-153Composição do tampão: 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl.
Corante de Carregamento em Gel Roxo (6x)New England BiolabsB7024S
GlycineBio-Rad161-0724Grau de eletroférese
GlicogênioMillipore SigmaG176719-22 mg/mL
Halt Protease e Inibidor de Fosfatase Coquetel, sem EDTA (100x)Thermo Scientific78445
Tampão de Lavagem de Complexo Imune com Alto SalMillipore Sigma20-155Composição do tampão: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 500 mM NaCl.
Anticorpo histona H3K4me3 (pAb)Active Motif39915
LiCl Complexo Imune Wash BufferMillipore Sigma20-156Composição do tampão: 0,25 M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% de ácido desoxicólico (sal de sódio), 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8,1.
Tampão de lavagem de complexo imune com baixo teor de salMillipore Sigma20-154Composição do tampão: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 150 mM NaCl.
Rack Magna GrIP (8 poços)Millipore Sigma20-400Qualquer tipo de suporte de separação magnética que seja compatível com um tubo de 1,5 mL está bem.
A nuclease microcócicaNew England BiolabsM0247Svem com tampão 10x (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7,9 a 25 ° C) e 100x BSA (10 mg/mL)
NaHCO3JT Baker3506-01
Coelho normal IgGMillipore Sigma12-370
PIPESMilliporeSigma P6757
Proteinase KMillipore Sigma3115887001
Sistema de PCR em tempo realBio-RadCFX96, C1000
RNA pol II CTD anticorpo fosfo-Ser5Active Motif39749
SDSBoehringer Mannheim100155de grau electroférese
Millipore SigmaS5636
Sonicator equipado com uma sonda microtipQSONICAQ700Qualquer tipo de sonicadores que sejam compatíveis com um tubo de 1,5 mL está bem.
Fenol UltraPuro: Clorofórmio: Álcool Isoamílico (25: 24: 1, v / v)Thermo Scientific15593031pH 8,05
Tecnologia Acetato de sódio

Referências

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  1. Nikolov, D. B., Burley, S. K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).
  2. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  3. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  4. Jackson, V., Chalkley, R. Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).
  5. Jackson, V., Chalkley, R. A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA. Cell. 23 (1), 121-134 (1981).
  6. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
  7. Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K. Preparation of Genomic DNA. Short Protocols in Molecular Biology. , Second Edition, Unit 2.1, 2-4 (1992).
  8. Crouse, J., Amorese, D. Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate. Focus. 9 (2), 3-5 (1987).
  9. Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
  10. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  11. Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells. Cell. 130 (1), 77-88 (2007).
  12. Louie, M. C., et al. Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).
  13. Liu, X., et al. Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer. Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).
  14. Zhao, H., et al. Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines. Scientific reports. 8 (1), 1949(2018).
  15. Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nature. 1 (1), 179-185 (2006).
  16. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods in molecular biology. 809, Clifton, N.J. 85-104 (2012).
  17. Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin. Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).
  18. Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).
  19. Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells. Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).

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Nuclease Microc cicaEnsaio de ChIPModifica es de HistonasIntera es Prote na DNACisalhamento de CromatinaDigest o por MNaseLise CelularPurifica o de DNA

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