Summary
Novel, immunostaining-kompatible vev clearing teknikker som den ultimate 3D Imaging av løsemiddel-ryddet organer tillate 3D visualisering av rabies virus hjerneinfeksjon og komplekse cellulære miljø. Tykk, antistoff-merket hjernevevet skiver er gjort optisk transparent å øke Imaging dybde og for å muliggjøre 3D analyse av konfokalmikroskopi laserskanning mikroskopi.
Abstract
Visualiseringen av infeksjons prosesser i vev og organer ved immunolabeling er en nøkkel metode i moderne infeksjons biologi. Evnen til å observere og studere fordelingen, tropism, og overflod av patogener innsiden av organ vev gir avgjørende data om sykdomsutvikling og progresjon. Ved hjelp av konvensjonelle mikroskopi metoder, er immunolabeling stort sett begrenset til tynne seksjoner Hentet fra parafin-embedded eller frosne prøver. Imidlertid kan den begrensede 2D bildet flyet av disse tynne seksjoner føre til tap av viktig informasjon om den komplekse strukturen i en infisert organ og cellulær sammenheng med infeksjonen. Moderne flerfarget, immunostaining-kompatible vev clearing teknikker nå tilby en relativt rask og rimelig måte å studere høyt volum 3D-bilde stabler av virus-infiserte organ vev. Ved å utsette vevet for organiske løsemidler, blir det optisk transparent. Dette matcher utvalgets brytnings indekser og fører til slutt til en betydelig reduksjon av lysspredning. Således, inne kombinasjonen med lang ledig arbeider avstand målsettinger, stor tissue deler til 1 mm inne størrelse kan avbildet av tradisjonell konfokalmikroskopi laserskanning mikroskopi (CLSM) for høy resolution. Her over, vi beskrive en protokollen å søke dyp-tissue tenkelig etter tissue oppryddingen å visualisere rabiat virus distribusjon inne infisert hjerne for at studere emner like virus patogenesen, spre, tropism, og neuroinvasion.
Introduction
Konvensjonelle histologi teknikker meste stole på tynne deler av orgel vev, som kan iboende gir bare 2D innsikt i en kompleks 3D-miljø. Selv gjennomførbart i prinsippet, 3D rekonstruksjon fra serielle tynne seksjoner krever krevende tekniske rørledninger for både kutting og påfølgende i silisiummangan justering av ervervet bilder1. Videre er sømløs rekonstruksjon av z-volumer etter mikrotomen kutting kritisk, da både mekaniske og beregnings gjenstander kan forbli på grunn av suboptimal bilde registrering forårsaket av nonoverlapping bilde plan, fargevariasjoner og fysiske ødeleggelse av vev av for eksempel mikrotomen bladet. I kontrast, ren optisk kutting av intakt tykke vevsprøver gjør at oppkjøpet av overlappende bilde plan (oversampling) og dermed Letter 3D rekonstruksjon. Dette i sin tur er svært gunstig for analyse av smitte prosesser i komplekse celle populasjoner (f. eks neuronal nettverk i sammenheng med de omkringliggende gliacellene og immunceller). Men iboende hindringer av tykt vev seksjoner inkluderer lysspredning og begrenset antistoff penetrasjon inn i vevet. I de senere årene har en rekke teknikker er utviklet og optimalisert for å overvinne disse problemene2,3,4,5,6,7,8 , 9 andre priser , 10 andre , 11 flere , 12 flere , 13. i hovedsak er målet vev slått optisk transparent ved behandling med enten vandig2,3,4,5,6,7 ,8,9 eller organiske løsningsmiddel BASert 10,11,12,13 løsninger. Innføringen av 3DISCO (3D Imaging av løsemiddel-ryddet organer)11,12 og dens etterfølger uDISCO (ultimate 3D Imaging av løsemiddel-ryddet organer)13 ga en relativt rask, enkel og rimelig verktøy med utmerket clearing evner. De viktigste bestanddelene av clearing-protokollen er organiske løsemidler tert-BUTANOL (TBA), benzylalkohol alkohol (ba), benzylalkohol BENZOATE (bb), og difenyleter ETER (DPE). Utviklingen og tillegg av iDISCO (immunolabeling 3D-avbildning av løsningsmiddel klarerte organer)14, en kompatibel immunostaining-protokoll, utgjorde en annen fordel i forhold til eksisterende metoder og aktiverte den dype vevs merkingen av antigener av interesse, samt langtidslagring av immunostained prøver. Kombinasjonen av iDISCO14 og uDISCO13 gir således Høyoppløselig bilde av antistoff-merket proteiner i store vevs seksjoner (opptil 1 mm) ved bruk av konvensjonelle CLSM.
Bevaring av et organ er kompleks struktur i alle tre dimensjoner er spesielt viktig for hjernevevet. Neurons utgjør en svært heterogen mobilnettet pasientpopulasjonen med svært varierte 3D-morfologier basert på deres neurite anslag (gjennomgått av Masland15). Videre består hjernen av en rekke avdelinger og subcompartments, hver bestående av forskjellige cellulære subpopulasjoner og forhold derav, inkludert gliacellene celler og neurons (gjennomgått av von Bartheld et al.16). Som neurotropisk virus, den rabies virus (RABV, gjennomgått av Fooks et al.17) infiserer hovedsakelig neurons, bruker deres transport maskiner til å reise i retrograd retning langs axons fra den primære stedet for smitte til sentralnervesystemet (CNS). Protokollen som beskrives her (figur 1A) tillater immunostaining-assistert deteksjon og VISUALISERING av RABV og RABV-infiserte celler i store, sammenhengende bilde stabler Hentet fra infiserte hjernevev. Dette muliggjør en objektiv, 3D høyoppløselig vurdering av infeksjons miljøet. Det er aktuelt å hjernevev fra en rekke arter, kan utføres umiddelbart etter fiksering eller etter langtidslagring av prøver i paraformaldehyde (PFA), og tillater lagring og reimaging av farget og ryddet prøver i månedsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
RABV-infiserte, PFA-faste arkiverte hjerne materiale ble brukt. De respektive dyr eksperimentelle studiene ble evaluert av ansvarlig dyr omsorg, bruk og etikk komité av statens kontor for landbruk, mattrygghet og fiskeri i Mecklenburg-Vorpommern (LALFF M-V) og fikk godkjenning med tillatelser 7221.3-2.1-002/11 (mus) og 7221.3-1-068/16 (oppspore). Generell omsorg og metoder som brukes i dyre eksperimenter ble utført i henhold til de godkjente retningslinjene.
FORSIKTIG: denne protokollen bruker ulike giftige og/eller skadelige stoffer, inkludert PFA, metanol (MeOH), hydrogen peroxide (H2O2), Sodium Natriumazid (Nan3), TBA, ba, bb, og DPE. MeOH og TBA er svært brannfarlig. Unngå eksponering ved å bruke egnet personlig verneutstyr (en Laboratoriefrakk, hansker og øyebeskyttelse) og utføre eksperimenter i en avtrekksvifte. Samle opp avfallet separat i egnede beholdere og kast det i henhold til lokale bestemmelser. Rabies virus er klassifisert som en biosafety nivå (BSL)-2 patogen og kan derfor generelt håndteres under BSL-2 forhold. Noen aktiviteter, inkludert prosedyrer som kan generere aerosoler, arbeide med høye virus konsentrasjoner, eller arbeide med romanen lyssaviruses, kan kreve BSL-3 klassifisering. Forebygging av før eksponering anbefales for høy risiko personell, inkludert dyre vaktmester og laboratorie arbeidere18,19. Se forskrifter for lokale myndigheter.
1. fiksering av hjernevev og snitting
- Fix hjerne prøver i et passende volum på 4% PFA i fosfat-bufret saltvann (PBS [pH 7,4]) i minst 48 h ved 4 ° c (med et omtrentlig vev-til-bindemiddel ratio på 1:10 [v/v]).
- Vask vevsprøvene 3x i PBS i minst 30 min hver vask og oppbevar dem i 0,02% NaN3/PBS ved 4 ° c til bruk.
- § Vevet i 1 mm-tykke seksjoner ved hjelp av en vibratome (blad fôr rate: 0.3 – 0,5 mm/s, amplitude: 1 mm, skive tykkelse: 1 000 μm).
- For å beholde riktig skive sekvensen, lagre hver vev seksjon separat i en brønn av en multiwell cellekultur plate. Tilsett 0,02% NaN3/PBS og oppbevar vevs delene ved 4 ° c til bruk.
2. prøve forbehandling med metanol
Merk: Utfør alle inkubasjons trinn med forsiktig bevegelse og, hvis det ikke indikeres noe annet, ved romtemperatur. Beskytt prøvene mot lys. Prøven forbehandling tjener det overordnede formål å forbedre antistoff diffusjon og redusere vev autofluorescence ved eksponering til MeOH og H2O2, henholdsvis14.
- Forbered 20% (v/v), 40%, 60% og 80% MeOH løsninger i destillert vann. For eksempel, for 20% MeOH, tilsett 10 mL av 100% MeOH til 40 mL destillert vann i et egnet sealable fartøy og bland ved invertere det.
- Overfør prøvene til et forholdsvis stort fartøy (f.eks. 5 mL reaksjons rør). Pass på å bruke materialer kjemisk resistente mot reagensene som brukes i denne protokollen. For eksempel oppmerksom på at mens polypropylen er egnet, er polystyren ikke.
Merk: volum spesifikasjonene i denne protokollen refererer til 5 mL reaksjons rør. Hvis det brukes et annet fartøy, justerer du volumene tilsvarende. - Ruge prøvene i 4 mL av hver konsentrasjon av den forberedte serien av MeOH løsninger i stigende rekkefølge for 1 time hver.
- Ruge prøvene 2x for 1 time hver i ren (100%) MeOH.
- Avkjøl prøvene til 4 ° c (f. eks, i et laboratorium-safe kjøleskap).
- Forbered bleking løsning (5% H2O2 i MeOH) ved, for eksempel, fortynning en 30% H2O2 Stock løsning på 1:6 i ren (100%) MeOH, og chill det ved 4 ° c.
- Fjern 100% MeOH fra kjøle prøvene og tilsett 4 mL prechilled blekemiddel (5% H2O2 i MeOH). Ruge over natten ved 4 ° c.
- Bytt bleking løsning for 4 mL 80% MeOH og ruge for 1 h. Fortsett å bruke den tilberedte serien med MeOH-løsninger i synkende rekkefølge for 1 time hver til prøvene har blitt inkubert i 1 time i 4 mL 20% MeOH.
- Vask prøvene 1x for 1 time med 4 mL PBS.
3. Immunostaining
Merk: Utfør alle inkubasjons trinn med forsiktig bevegelse og, hvis det ikke indikeres noe annet, ved romtemperatur. Beskytt prøvene mot lys. For å hindre mikrobiell vekst, Legg NaN3 til en endelig konsentrasjon på 0,02% til løsningene i denne delen. Vevsprøver blir ytterligere permeabilized ved behandling med ioniske rengjøringsmidler Triton X-100 og mellom 20. Normal serum brukes til å blokkere løs antistoff binding. Glycine og heparin tilsettes for å redusere immunolabeling bakgrunn14.
- Vask prøvene 2x for 1 time hver i 4 mL 0,2% Triton X-100/PBS.
- Permeabilize prøvene i 2 dager ved 37 ° c med 4 mL 0,2% Triton X-100/20% DMSO/0,3 M Glycine/PBS.
- Blokker løs binding av antistoffer ved å incubating prøvene i 2 dager ved 37 ° c i 4 mL 0,2% Triton X-100/10% DMSO/6% normal serum/PBS.
Merk: Bruk vanlig serum fra samme art som det sekundære antistoff ble reist i for å oppnå ideelle blokkerings resultater. - Ruge prøvene i 2 mL primær antistoff løsning (3% normal serum/5% DMSO/PTwH [PBS-mellom 20 med heparin] + primære antistoff/antistoffer) i 5 dager ved 37 ° c. Oppdater den primære antistoff løsningen etter 2,5 dager.
- For PTwH, Rekonstituer heparin natrium salt i destillert vann for å lage en 10 mg/mL lagerløsning (Oppbevar denne løsningen, aliquoted, ved 4 ° c). Legg lager løsningen til 0,2% mellom 20/PBS til en endelig konsentrasjon på 10 μg/mL.
Merk: å velge riktig antistoff fortynning kan kreve optimalisering. Vanligvis er standard immunhistokjemi konsentrasjoner et godt utgangspunkt.
- For PTwH, Rekonstituer heparin natrium salt i destillert vann for å lage en 10 mg/mL lagerløsning (Oppbevar denne løsningen, aliquoted, ved 4 ° c). Legg lager løsningen til 0,2% mellom 20/PBS til en endelig konsentrasjon på 10 μg/mL.
- Vask prøvene for 1 dag i 4 mL PTwH, utveksle vaskebuffer minst 4X – 5x i løpet av dagen og forlater siste vask på over natten.
- Ruge prøvene i 2 mL sekundær antistoff oppløsning (3% normal serum/PTwH + sekundær antistoff/antistoffer) i 5 dager ved 37 ° c. Oppdater den sekundære antistoff løsningen etter 2,5 dager.
- Fortynne sekundær antistoff/antistoffer ved 1:500 i sekundær antistoff oppløsning (dvs. 4 μL i 2 mL).
- Vask prøvene i 1 dag som beskrevet i trinn 3,5, og la den siste vasken være på over natten.
4. kjernefysiske flekker
Merk: Utfør alle inkubasjons trinn med forsiktig bevegelse og, hvis det ikke indikeres noe annet, ved romtemperatur. Beskytt prøvene mot lys. Hvis ingen kjernefysisk farging er nødvendig eller eksitasjon bølgelengde/utslipp spekteret av til-PRO-3 er nødvendig for eksitasjon eller påvisning av en annen fluoroforen, hoppe over dette trinnet.
- Fortynne nukleinsyre syre flekken til-PRO-3 ved 1:1000 i PTwH og ruge prøvene i 4 mL av kjernefysisk farge løsning for 5 h.
- Vask prøvene i 1 dag som beskrevet i trinn 3,5, og la den siste vasken være på over natten.
Merk: etter vasken kan prøvene oppbevares i PBS ved 4 ° c til optisk lysning.
5. fjerning av vev
Merk: Utfør alle inkubasjons trinn med forsiktig bevegelse og, hvis det ikke indikeres noe annet, ved romtemperatur. Beskytt prøvene mot lys. Vevsprøvene er dehydrert i en gradert serie av TBA-løsninger. Etter hvert som immunostaining krever vandige løsninger, må alle farge prosedyrene være ferdige før vevs oppryddingen. Optisk klaring og brytningsindeks Matching oppnås ved behandling med en blanding av BA, BB, og DPE. Clearing løsningen er supplert med DL-α-tokoferol som en antioksidant13.
- Forbered 30% (v/v), 50%, 70%, 80%, 90% og 96% TBA-løsninger i destillert vann. For eksempel, for 30% TBA, tilsett 15 mL 100% TBA til 35 mL destillert vann i et egnet sealable fartøy og bland med invertere.
Merk: TBA har et Smeltepunkt på 25 – 26 ° c; Derfor pleier det å være solid ved romtemperatur. For å forberede TBA-løsninger, varm opp den godt forseglede flasken ved 37 ° c i en inkubator eller vannbad. - Tørke prøvene med 4 mL hver konsentrasjon av den tilberedte serien av TBA-løsninger i stigende rekkefølge for 2 timer hver. La 96% TBA på over natten.
- Tørke prøvene videre i ren (100%) TBA for 2 t.
- Forbered clearing løsning BABB-D15.
Merk: BABB-D15 er en kombinasjon av BA og BB (BABB) som er blandet med DPE i forholdet x: 1, der x er angitt i løsningen navn, i dette tilfellet 15.- For BABB, bland en del BA med to deler BB.
- Bland BABB og DPE i forholdet 15:1.
- Tilsett 0,4 Vol% DL-α-tokoferol (vitamin E).
Merk: for eksempel, for 20 mL BABB-D15, bland 6,25 mL BA med 12,5 mL BB. Tilsett 1,25 mL av DPE og supplere den med 0,08 mL DL-α-tokoferol.
- Fjern prøvene i fjernings løsning til de er optisk gjennomsiktige (2 – 6 timer).
- Prøvene kan oppbevares ved 4 ° c i BABB-D15, beskyttet mot lys, til montering og bildebehandling.
6. prøve montering
- Ved hjelp av en 3D-skriver skriver du ut bilde kammeret og lokket (materiale: copolyester [CPE], munnstykke: 0,25 mm, lag høyde: 0,06 mm, veggtykkelse: 0,88 mm, vegg telling: 4, infill: 100%, ingen støtte struktur; tilsvarende. STL-filen finnes i supplerende materialer av denne protokollen).
- Monter bilde kammeret (figur 2).
- Monter en rund dekkglass (diameter: 30 mm) på bilde kammeret med RTV-1 (en-komponent rom-temperatur-vulcanizing) silikon gummi. Fjern overflødig silikon gummi med en vann-fuktet bomullsdott og kur over natten.
- Monter en rund dekkglass (diameter: 22 mm) på lokket med RTV-1 silikon gummi. Fjern det overskytende silikon gummi med en vann-fuktet bomullsdott og kur over natten.
- Plasser prøven i et bilde kammer, tilsett et lite volum av BABB-D15, og sett lokket. Fyll kammeret opp med BABB-D15 gjennom innløpet, ved hjelp av en sprøyte nål (27 G x 3/4 tommer [0,40 mm x 20 mm]).
- Plugg inn innløpet og forsegle bilde kammeret med RTV-1 silikon gummi. Cure over natten i mørket.
7. avbildning og bildebehandling
- Sett opp bilde anskaffelsen ved å velge de respektive laserlinjene slik at de samsvarer med fluorophores som brukes. Juster deteksjons områdene for hver detektor for å forhindre at signalet overlapper mellom kanaler.
Merk: eksempler på gjenkjennings områder for Alexa fluor 488, Alexa fluor 568 og TO-PRO-3 er 500 – 550 NM, 590 – 620 NM og 645 – 700 NM, henholdsvis. - Velg anskaffelses parametrene, Definer den øvre og nedre grensen for z-stakken, og Hent bilde stabelen.
Merk: eksempler på anskaffelses parametre er en sekvensiell skanning med en pikselstørrelse på 60-90 NM, en z-trinns størrelse på 0,5 μm, et linje gjennomsnitt på 1, en skannehastighet på 400 Hz og en pinhole størrelse på 1 luftig enhet. - Behandle bildes takken med riktig bildeanalyse programvare (for eksempel Fiji) for å generere 3D-prognoser eller utføre grundige analyser.
Merk: på grunn av den store størrelsen på de kjøpte bildefilene, er bruk av en arbeidsstasjon vanligvis nødvendig.- Åpne oppkjøpet eller bildefilen (e) i Fiji (fil | Åpne | Velg filer).
- Hvis du for eksempel bruker. LIF-filer, velger du eller fjerner markeringen for de ønskede alternativene i dialogvinduet bio-formater. Vis stakk med Hyperstack. Annet enn det, nei spesifikk utvalgene eller flått er på krevd. Trykk på OK.
- Hvis filen inneholder flere bildestakker, velger du dem som skal analyseres, og bekrefter ved å trykke på OK.
- Utfør blekemiddel korrigering ved å dele det sammenslåtte bildet inn i individuelle kanaler (bilde | Farge | Kanaler-verktøyet, og velg deretter mer | Delte kanaler). Velg blekemiddel korreksjon for hver kanal (bilde | Juster | Blekemiddel korreksjon) og velg enkelt forhold (bakgrunns intensitet: 0,0).
Merk: i noen tilfeller, for eksempel når det ikke er lineær nedbrytning av signalet eller signalet er for svakt generelt, kan enkelt forhold mislykkes. Alternativt kan du prøve eksponentiell Fit eller hoppe over blekemiddel korreksjon. - Juster lysstyrken og kontrasten for hver kanal ved hjelp av glidebryterne (bilde | Juster | Lysstyrke | Kontrast).
- Slå sammen kanalene (bilde | Farge | Slå sammen kanaler), lage en sammensatt (bilde | Farge | Kanaler-verktøyet, og velg deretter mer | Lag kompositt), og konvertere den til RGB-format (bilde | Farge | Kanaler-verktøyet, og velg deretter mer | Konvertere til RGB).
- Endre om nødvendig størrelsen på bildes takken for å redusere beregningstiden og filstørrelsen (bilde | Juster | Størrelse, begge alternativene krysset pluss Bilineær interpolering).
- Generer en 3D-projeksjon (bilde | Stabler | 3D-prosjekt). Velg lyseste punkt som projeksjons metode, og Angi avstands avstanden slik at den samsvarer med z-trinns størrelsen til den hentede bildes takken. For maksimal kvalitet, angi rotasjonsvinkel økning til 1 og Aktiver interpolering. Endre total rotasjon, gjennomsiktighet terskler og tetthet etter behov.
- Juster om nødvendig kontrasten og lysstyrken ved å konvertere 3D-projeksjon tilbake til 8-biters format (bilde | Type | 8-biters). Bruk de respektive glidebryterne (Image | Juster | Lysstyrke | Kontrast) og konvertere bildet stabelen til RGB-format som beskrevet i trinn 7.3.4.
- Lagre 3D-projeksjon som. TIF-fil (bildefilformat) og. AVI-fil (videofil format).
- Åpne oppkjøpet eller bildefilen (e) i Fiji (fil | Åpne | Velg filer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kombinasjonen av iDISCO14 og uDISCO13 kombinert med høyoppløselig CLSM gir dyp innsikt i spatiotemporal oppløsning og plastisitet av RABV-smitte av hjernevev og den omliggende cellulære konteksten.
Bruke immunostaining av RABV phosphoprotein (P), komplekse lag av infiserte neuronal celler kan bli sett i tykke deler av mus hjerner (Figur 3). Deretter kan sømløs 3D-projeksjoner av de oppnådde bilde stabler bli rekonstruert (Figur 3A, B, høyre panel; Animert figur 1). Forsiktighet må utvises ved bruk av primær antistoffer fra og sekundære antistoffer mot arten som organ materialet stammer fra. Bruken av anti-mus IgG-antistoffer på mus hjernevevet resulterte i en distinkt farging av det vaskulære systemet (Figur 3B, venstre panel). På grunn av den høye oppløsningen bildet stabler er ervervet med, kan smitte bli vurdert opp til en enkelt-cellenivå (Figur 4), slik at påstander om for eksempel, overflod og fordeling av antigen i cellen (Figur 4C ).
Bortsett fra mus hjernevev, kan protokollen også brukes til hjernevev fra andre dyrearter (f. eks, oppspore) (figur 5; Animert figur 2). Avsnitt tatt fra annerledes avdelinger av en infisert oppspore hjerne avsløre en varierende graden av RABV infeksjon (skikkelsen 5en-D).
Ettersom hjernen består av mange forskjellige cellulære subpopulasjoner, er differensiering mellom disse befolkningsgruppene avgjørende. Ved hjelp av antistoffer rettet mot celle markører, er det mulig å vurdere den cellulære identiteten til infiserte og nærliggende celler. For eksempel kan astrocytter skilles via uttrykk for gliacellene fibrillary surt protein (GFAP) (figur 6A, C; Animert figur 3), mens neurites kan være spesielt farget for mikrotubulinettverket-assosiert protein 2 (MAP2) (figur 6B, D; Animert figur 4). Samtidig kan virale proteiner, i dette tilfellet, RABV nucleoprotein (N), bli costained til å vurdere forholdet mellom infiserte celler og den uthevede cellulære pasientpopulasjonen.
Figur 1 : Grunnleggende prinsipp og arbeidsflyt av protokollen. (A) grafisk fremstilling av arbeidsflyten basert på protokollene fra Renier et al.14 og Pan et al.13. (B) to eksemplarisk oppspore hjerne skiver, en før (venstre panel) og en etter behandling med organiske løsemidler (høyre panel). Clearing snur vevet optisk transparent som Observer av den da lesbare teksten. Det ryddet hjerne stykket er innebygd i et 3D-trykt bilde kammer (høyre panel). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Teknisk illustrasjon av 3D-trykt bilde kammer. (A) eksplodert visning tegning av bilde kammeret. De dot-stiplede linjene fremhever komponenter som må monteres på hverandre ved hjelp av RTV-1 silikon gummi. De stiplede linjene representerer instruksjoner for den påfølgende monteringen av kammeret. (B) CAD (dataassistert konstruksjon) fil av bilde kammeret. Tilsvarende. STL-filen for å skrive ut bilde kammeret finnes i tilleggsmaterialene. (C) ferdig montert bilde kammer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Deep-vev Imaging av RABV-infiserte mus hjernevev. (A og B) mus ble smittet med en rekombinant vulpine gate virus. RABV P farging (grønn) avslører infiserte neuronal lag med store, viklet neurite anslag inne i ryddet hjernevevet. Kjerner ble counterstained med til-PRO-3 (blå). (B) bruk av fluoroforen-merket anti-mus IgG sekundære antistoffer (rød) på musen vev resulterer i en distinkt merking av det vaskulære systemet. Den 3D rekonstruksjon av ervervet bildet stabler muliggjør observasjon fra ulike visningsvinkler (A og B, høyre panel). Skala bars = 60 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Bildeinnhenting med høy oppløsning gjør det mulig med kompliserte vurderinger opp til et enkelt cellenivå. Hjernen ble dissekert fra en SAD L16-infisert mus. (A) RABV P farging (grønn) fremhever en individuelt infisert Nevron. (B og C) detalj bilder og anslag viser at grundige analyser av antigen overflod, distribusjon og lokalisering kan utføres. Kjerner ble counterstained med til-PRO-3 (blå). Vektstenger = 20 μm (A), 5 μm (C). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Dyp-tissue tenkelig av RABV-infisert oppspore hjerne tissue. Oppspore var infisert medHjørnetann gate RABV. (A-D) Skiver fra spesifiserte områder av hjernen ble tatt, immunostained for RABV P (grønn), og optisk ryddet. Anslag viser at de infiserte cellene i ulike deler av hjernen varierer i mengde og morfologi. Videre fremhever de anvendelsen av protokollen til vev annet enn mus-avledet. Kjerner ble counterstained med til-PRO-3 (blå). Skala bars = 60 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Flerfarget immunofluorescence tillater costaining av cellulære markører. Hjerne tissue skive fra oppspore infisert medHjørnetann gate RABV var anvendt og coimmunostained for RABV N (rød) og entenden ene eller den andre (A og C) GFAP (grønn) eller (B og D) MAP2 (grønn). Mens GFAP er en astrocytt markør, MAP2 spesielt høydepunkter neurites. Kjerner ble counterstained med til-PRO-3 (blå). (C og D) nederst, er enkelt stykke utdrag av de opplistede detalj visningene fra de flettede anslagene avbildet. Skala stolper = 15 μm (A og B) 10 μm (C og D). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Animert figur 1:3D-rekonstruksjoner og detalj anslag for bilde stabler fra RABV-infiserte mus hjerner. Anslagene ble generert fra bildet stabler beskrevet i Figur 3. (A og C) av alle respektive z-stabler. (B) en detaljert projeksjon av en 3D-rekonstruksjon av en del av z-stakken til områdene som er uthevet i begynnelsen av videoen. (D) en detaljert projeksjon av en tomogram av en del av z-stakken til områdene som er uthevet i begynnelsen av videoen. Grønn = RABV P; rød = mus IgG; blå = kjerner. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Animert figur 2:3D rekonstruksjoner av bildet stabler ervervet fra en RABV-infiserte ilder hjernen. Anslagene ble generert fra bildet stabler beskrevet i figur 5. (A-D) Merknadene refererer til samme figur og beskriver de respektive områdene av hjernen skivene ble tatt fra. Grønn = RABV P; blå = kjerner. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Animert figur 3: gradvis projeksjon av de ulike kanalene i en 3D-rekonstruksjon av en RABV-infiserte oppspore hjernen costained med astrocytt markør GFAP. Anslag ble generert fra bildet stabelen beskrevet i figur 6A. Den gradvise tillegg av kanaler starter med RABV N (rød), etter som følger cellekjerner (blå) og, endelig, GFAP (grønn), mens subtraksjon først fjerner RABV N, deretter cellekjerner, og til slutt GFAP. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Animert figur 4: gradvis projeksjon av de ulike kanalene i en 3D-rekonstruksjon av en RABV-infisert oppspore hjernen costained med neuronal markør MAP2. Anslag ble generert fra bildet stabelen beskrevet i figur 6B. Den gradvise tillegg av kanaler starter med RABV N (rød), etter som følger cellekjerner (blå) og, endelig, MAP2 (grønn), mens subtraksjon først fjerner RABV N, deretter cellekjerner, og til slutt MAP2. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den gjenopplivet og videre utvikling av vev clearing teknikker i de siste årene2,3,4,5,6,7,8, 9 andre priser , 10 andre , 11 flere , 12 flere , 13 på alle , 14 har åpnet opp mange nye muligheter til å oppnå høyt volum bilde stabler av orgel vev. Dette ga en enestående og kraftig verktøy for å studere, blant mange andre emner, virus infeksjon. Den påfølgende 3D rekonstruksjon av disse bilde stabler muliggjør sofistikerte påstander på, for eksempel, virus tropism, overflod, og tiden løpet av infeksjonen. Denne protokollen beskriver immunolabeling-assistert visualisering av RABV infeksjon i løsemiddel-ryddet hjernevev.
Det er flere kritiske trinn i utarbeidelse og oppkjøp av bildet stabler av immunolabeled, løsemiddel-ryddet vev. Langvarig eksponering for PFA kan maskere epitopes, og dermed resultere i redusert antigenisiteten20,21,22. Det er derfor viktig å begrense fikserings tiden til nødvendig minimum og overføre prøvene til en hensiktsmessig løsning (for eksempel PBS supplert med 0,02% NaN3 for langtidslagring). Men alle representative bilder og anslag gitt her har blitt kjøpt fra arkiverte hjernen prøver, hvorav noen hadde vært lagret i PFA i ukevis, fremhever anvendelsen av teknikken til orgel materiale som har vært utsatt for PFA for lengre tidsperioder. Lignende resultater har blitt vist for menneskelige hjerne prøver13. En annen, om ikke det mest, er kritisk trinn antistoff inkubasjons. Konsentrasjoner av antistoff må velges med forsiktighet. I de fleste tilfeller er standard IHC-konsentrasjoner et godt utgangspunkt for merking av dyp vevs antistoffer, noe antigener kan kreve ytterligere optimering av antistoff konsentrasjonen. Denne protokollen viser at både RABV N og P lett kan oppdages av de brukte antistoffene. Mens MeOH forbehandling vanligvis forbedrer immunolabeling, er noen antigener inkompatible med denne behandlingen. For dem, Renier og kollegaer14 forsynt en alternativ MeOH-ledig eksemplar forbehandling. Analyse av ervervet bilde stabler krever tilstrekkelig beregningskraft. På grunn av de store filstørrelsene på opptil flere gigabyte per stakk er det nødvendig med kraftige datamaskiner for å behandle bildene. Post prosessering inkluderer ofte subtraksjon av bakgrunnsstøy og en blekemiddel korreksjon for å kompensere for oppkjøp-assosiert bleking effekter. Ved måling av avstander, må det holdes i bakhodet at, som en bivirkning, er vevet krymper under clearing prosessen.
I forhold til andre mikroskopi plattformer, som lys ark fluorescens mikroskopi (LSFM) eller to-Foton laserskanning mikroskopi (2PLSM), har CLSM den mest begrensede arbeidsavstand. Derfor er det nødvendig å preslice organer til 1 mm i tykkelse for Imaging. I tillegg har CLSM den tregeste anskaffelses hastigheten på grunn av den høye bildeoppløsningen. Bruken av et lett ark mikroskop ville tillate raskere avbildning av større volumer opp til hele hjernen Imaging, samtidig som ofrer bildeoppløsning. En annen begrensning er den iboende økningen av vev autofluorescence med synkende bølgelengde. Dette gjør bruk av fluorophores og fargestoffer opphisset av laserlinjen ved 405 NM, inkludert Hoechst fargestoffer, upraktisk til umulig.
Med hensyn til andre vev clearing teknikker, hybrid av iDISCO14 og uDISCO13 kombinerer de mest positive attributtene: det er svært kompatibel med immunostaining, svært allsidig, relativt rask og billig, har det utmerket clearing evner, og det er mulig med en standard konfokalmikroskopi mikroskop. Videre er denne protokollen ikke begrenset til immunostaining og clearing av hjernevev, men kan også brukes til en rekke andre myke vev og patogener, både neuroinvasive og ikke-neuroinvasive. Som konklusjon, protokollen beskrevet her representerer en rørledning for høyoppløselig 3D-avbildning av RABV-infiserte hjernevevet. 3D-rekonstruksjoner av infisert hjernevev kan brukes til å besvare en rekke spørsmål om RABV sykdomsprogresjon, patogenesen og neuroinvasion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Thomas C. Mettenleiter og Verena te kamp for kritisk lesing manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av Federal Excellence Initiative av Mecklenburg Vest-Pommern og European Social Fund (ESF) Grant KoInfekt (ESF/14-BM-A55-0002/16) og en intramural Collaborative forskning stipend på Lyssaviruses på Friedrich-Loeffler-Institutt (ri-0372).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Benzyl alcohol | Alfa Aesar | 41218 | Clearing reagent |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | BB6630-500ML | Clearing reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | 4720.2 | Various buffers |
| Diphenyl ether | Sigma-Aldrich | 240834-100G | Clearing reagent |
| DL-α-Tocopherol | Alfa Aesar | A17039 | Antioxidant |
| Donkey serum | Bio-Rad | C06SBZ | Blocking reagent |
| Glycine | Carl Roth | 3908.2 | Background reduction |
| Goat serum | Merck | S26-100ML | Blocking reagent |
| Heparin sodium salt | Carl Roth | 7692.1 | Background reduction |
| Hydrogen peroxide solution (30 %) | Carl Roth | 8070.2 | Sample bleaching |
| Methanol | Carl Roth | 4627.4 | Sample pretreatment |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | Crystalline powder to make fixative solution |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | Prevention of microbial growth in stock solutions |
| tert-Butanol | Alfa Aesar | 33278 | Sample dehydration for tissue clearing |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | Nucleic acid stain |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | Detergent |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Detergent |
| Miscellaneous | |||
| 5 mL reaction tubes | Eppendorf | 0030119401 | Sample tubes |
| Coverslip, circular (diameter: 22 mm) | Marienfeld | 0111620 | Part of imaging chamber |
| Coverslip, circular (diameter: 30 mm) | Marienfeld | 0111700 | Part of imaging chamber |
| Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm]) | B. Braun | 4657705 | Filling of the imaging chamber with clearing solution |
| RTV-1 silicone rubber | Wacker | Elastosil E43 | Adhesive for the assembly of the imaging chamber |
| Ultimaker CPE 2.85 mm transparent | Ultimaker | 8718836374869 | Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber |
| Technical equipment and software | |||
| 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 2+ | Printing of imaging chamber |
| Automated water immersion system | Leica | 15640019 | Software-controlled water pump |
| Benchtop orbital shaker | Elmi | DOS-20M | Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm) |
| Benchtop orbital shaker, heated | New Brunswick Scientific | G24 Environmental Shaker | Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | Inverted confocal microscope for sample imaging |
| Fiji | NIH (ImageJ) | open source software (v1.52h) | Image processing package based on ImageJ |
| Long working distance water immersion objective | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2 |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Sample slicing |
| Workstation | Dell | Precision 7920 | CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB |
| Primary antibodies | |||
| Goat anti-RABV N | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400 |
|
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100 |
| Rabbit anti-MAP2 | Abcam | ab32454 | Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250 |
| Rabbit anti-RABV P 160-5 | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000 |
|
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
References
- Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction. Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-171 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Masland, R. H.
- von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
- Fooks, A. R., et al.
- WHO. WHO Expert Consultation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. , No. 1012 (2018).
- CDC. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. US Department of Health and Human Services. , (2009).
- Arnold, M. M., et al. Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens. Biotechnic & Histochemistry. 71 (5), 224-230 (1996).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. The American Journal of Surgical Pathology. 24 (7), 1016-1019 (2000).
- Orbanz, J., Finke, S. Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters. Archives of Virology. 155 (10), 1631-1641 (2010).
