Artigo de método

Análise de combinatória miRNA tratamentos para regular o ciclo de celular e a angiogênese

DOI:

10.3791/59460

⸱

30 de março de 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 3Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center

Neste artigo

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Resumo

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miRNA terapêutica tem potencial significativo na regulamentação da progressão do câncer. Demonstrado aqui abordagens analíticas são usadas para a identificação da atividade de um tratamento de combinatória miRNA em travar o ciclo celular e a angiogênese.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Câncer de pulmão (LC) é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. Semelhante a outras células de câncer, uma característica fundamental das células LC é a proliferação desregulada e divisão celular. Inibição da proliferação de travar a progressão do ciclo celular tem demonstrada ser uma abordagem promissora para o tratamento de câncer, incluindo o LC.

miRNA terapêutica têm emergido como reguladores do importante gene pós-transcricional e cada vez mais estão sendo estudadas para uso no tratamento do câncer. Em recente trabalho, utilizamos dois miRNAs, miR-143 e miR-506, para regular a progressão do ciclo celular. Células de câncer (NSCLC) de pulmão não-pequenas células A549 foram transfectadas, analisaram-se alterações de expressão de gene e atividade apoptotic devido ao tratamento foi finalmente analisada. Downregulation de quinases cyclin-dependente (CDKs) foram detectados (i.e., CDK1, CDK4 e CDK6), e o ciclo celular parou nas transições de fase G1/S e G2/M. Análise do caminho indicado potencial atividade antiangiogênica do tratamento, que dota a abordagem com atividade multifacetada. Aqui descritos são as metodologias utilizadas para identificar a atividade de miRNA relativas à inibição do ciclo celular, indução da apoptose e efeitos do tratamento em células endoteliais através da inibição da angiogênese. Espera-se que os métodos apresentados aqui vão apoiar pesquisas futuras na terapêutica de miRNA e atividade correspondente e que os dados representativos guiará outros pesquisadores durante as análises experimentais.

Introdução

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O ciclo celular é uma combinação de vários eventos regulatórios que permitem a duplicação de DNA e a célula proliferação através do processo mitótico1. Quinases cyclin-dependente (CDKs) regulam e promovem o ciclo celular2. Entre eles, o CDK mitótica (CDK1) e CDKs interfase (CDK2, CDK4 e CDK6) têm um papel essencial no ciclo celular progressão3. Proteína do retinoblastoma (Rb) é fosforilada pelo CDK4/CDK6 complexo para permitir de progressão do ciclo celular4, e ativação de CDK1 é essencial para o sucesso de divisão celular5. Inibidores CDK numerosas foram desenvolvidos e avaliados em ensaios clínicos ao longo das últimas décadas, indicando o potencial de segmentação CDKs no tratamento do câncer. Na verdade, três inibidores CDK foram aprovados para o tratamento do câncer de mama recentemente6,7,8,9,10. Assim, CDKs, e em particular, a CDK1 e CDK4/6, são de grande interesse na regulamentação da progressão de células de câncer.

os miRNAs (miRs) são RNAs pequenos, não-codificantes e reguladores pós-transcricional da expressão gênica, regulação de aproximadamente 30% de todos os genes humanos11. Sua atividade baseia-se na repressão translacional ou degradação de RNA mensageiro (mRNAs)12. Ilustrativos do seu significado biológico, mais de 5.000 miRNAs foram identificados e uma molécula de miRNA único pode regular vários genes11,13. Mais importante, miRNA expressão tem sido associado com doenças diferentes e status de doenças, incluindo câncer13. Na verdade, os miRNAs foram caracterizados como oncogênicos ou supressores de tumor, sendo capaz de promover ou suprimir tumor desenvolvimento e progressão de14,15. A expressão relativa de miRNAs em tecidos doentes pode regular a progressão da doença; assim, entrega exógena de miRNAs tem potencial terapêutico.

Câncer de pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer e maior do que 60% de todas as neoplasias malignas de pulmão não-pequenas células de pulmão câncer16,17com uma taxa de sobrevida de 5 anos de menos de 20%18. O uso de miR-143-3 p e p miR-506-3 foi avaliado recentemente para o direcionamento os ciclos de celular de células de câncer de pulmão11. miR-143 e miR-506 têm sequências que são complementaridade a CDK1 e CDK4/CDK6, e foram analisados os efeitos destes dois miRs sobre A549 células. Os detalhes experimentais são apresentados e discutidos neste artigo. Expressão gênica, progressão do ciclo celular e apoptose foram avaliados usando diferentes desenhos experimentais e momentos seguindo do transfection. Usamos métodos quantitativos em tempo real do PCR (RT-qPCR) juntamente com a análise de microarray para medir a expressão de genes específicos, e a sequenciação do ARN de próxima geração foi usada para determinar o gene global desregulagem11. O último método identifica a abundância relativa de transcrição do gene cada com alta sensibilidade e reprodutibilidade, enquanto milhares de genes podem ser analisados a partir de uma única análise experimental. Além disso, análise de apoptose devido ao tratamento de miRNA foi realizada e está descrito aqui. Bioinformática completada a análise de percurso. Aqui apresentados são protocolos usados para análise da terapêutica potencial de miR-143 a combinatória e miR-506.

O principal objectivo do presente protocolo é identificar os efeitos de miRNAs nas células, com um foco sobre o ciclo celular. A variedade das técnicas aqui apresentadas extensão de análise de expressão do gene tradução prévia (usando qPCR) para elaborar e novela técnicas para análise do gene no nível da proteína, tais como análise de microarray. Espera-se que este relatório é útil para pesquisadores interessados em trabalhar com os miRNAs. Além disso, é apresentada a metodologia para análise de fluxo cytometric do ciclo celular e apoptose de células.

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Protocolo

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1. miR-143 e miR-506 transfecção

Atenção: Utilize luvas de látex, óculos de protecção e um casaco de laboratório durante a realização dos experimentos descritos. Quando necessário, use o gabinete de segurança biológica com o ventilador do gabinete, sem bloqueio das vias aéreas ou perturbando o fluxo de ar laminar. Sempre como a janela de vidro protegendo a altura apropriada, conforme descrito pelo fabricante.

  1. Células de NSCLC A549 semente em uma T25 cm2 balão/6/96 bem placa em DMEM/F12K mídia suplementado com 10% FBS e 1% penicilina-estreptomicina (meios de cultura) em uma capa de cultura de tecidos e incubam durante uma noite a 37 ° C com 5% CO2 em uma incubadora de cultura de tecidos.
  2. Suspender a miR-143 e/ou miR-506 imita ou embaralhar siRNA com agente transfecting (2,4 µ g do miR foram misturadas com 14 µ l de agente transfecting; ver Tabela de materiais) em 500 µ l de transfeccao mídia e 1,5 mL de soro e sem antibióticos DMEM/F12K mídia em um concentração de miRNA final de 100 nM. quantidade de miRNA pode exigir otimização em diferentes células e concentrações. Abordagens adequadas incluem a transfecção de células com o aumento da concentração de miRNA (ou seja, 50-200 nM) e avaliação de expressão downregulation de genes de interesse.
  3. Remover de meios de cultura de balão/placa e lave uma vez com PBS 1x.
  4. Adicionar miRNA/scramble-transfecting complexos de agente e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 para 6 h (tamanho da cubeta define o volume adicionado de incubação).
  5. Substituir a mídia com 4 mL de meio de cultura e incubar as células para 24h ou 48h.
  6. Colher células transfectadas por tripsinização, adicionando 1 mL de EDTA-tripsina em cada balão de2 cm T25, incubar durante 5-10 min a 37 ° C e adicionar 3 mL de meio de cultura para colher as células. Coloca o conteúdo de cada frasco em um tubo de 15ml separado, marcado. Trabalho em uma capa de cultura de tecidos.
  7. Centrifugar a 751 x g por 5 min e retirar o sobrenadante.
    Nota: Precaução é necessária durante a remoção do sobrenadante, como a agitação do tubo pode causar a perda de células.
  8. Adicionar 2 mL de 1X PBS e centrifugar por 5 min em 751 x g.
  9. Repita as etapas 7 e 8 de uma vez para remover quaisquer vestígios de mídia e o sobrenadante.
    Nota: Nesta fase, os tubos de amostra podem ser armazenados a-80 ° C ou podem ser usados imediatamente.

2. extração do RNA

  1. Limpe a área de trabalho por pulverização com álcool isopropílico a 70% e solução de descontaminação de RNAse.
  2. Extração do RNA deve ser realizada usando um RNA apropriado kit (veja a Tabela de materiais).
  3. Retirar os tubos de-80 ° C e permitir-lhes descongelar. Adicione 300 µ l de tampão de Lise e pipeta de cima e para baixo para quebrar a membrana celular.
  4. Adicione um volume igual de etanol ultra puro de 100%.
  5. Misturar bem e colocar na coluna de separação.
  6. Entre 11 e 16 x g durante 30 s e remover o fluxo através de centrifugação.
  7. Adicione 400 µ l de tampão e centrífuga para remover o tampão de lavagem.
  8. Adicione 5 µ l de DNAse eu com 75 µ l da digestão do DNA de buffer em cada amostra e incube por 15 min.
  9. Lave a amostra com 400 µ l de tampão prep de RNA.
  10. Lave 2 x com tampão de lavagem do RNA.
  11. Adicione água nuclease-livre para a coluna, centrífuga, então recolher o RNA.
  12. Medir a concentração de RNA total com um espectrofotômetro UV.

3. RT-qPCR

  1. Antes da RT-qPCR, sintetiza o cDNA. Na sequência de quantificação da concentração de RNA, coloque 1 µ g de RNA em um volume de final 20 µ l de reação para preparar o cDNA em um tubo PCR. Sempre trabalha sobre uma bancada limpa.
  2. Todos os outros ingredientes necessários estão incluídos na tabela 1.
IngredientesQuantidade (µ l) / (20 µ l) de amostra
5 X cDNA mestre misturar4
dNTPs2
Hexâmeros aleatórios1
Potenciador de RT1
Mistura de enzima verso1
Água livre de DNase e RNaseQtde necessária após a adição de RNA para fazer 20 µ l

Tabela 1: Materiais para a síntese do cDNA de amostras do RNA. Necessárias quantidades dos respectivos ingredientes para preparar uma mistura de mestre para uma amostra para a síntese do cDNA.

  1. Incubar em um termociclador com as seguintes condições de temperatura: 42 ° C por 30 min; 95 ° C por 2 min; 4 ° C até a coleta de amostras.
  2. Usar imediatamente em regular PCR ou qPCR, ou armazenar o cDNA a-20 ° C.
  3. Prepare soluções de cartilha frente e verso com DNase/RNase-livre de água em uma concentração de 10 µM de solução estoque da primeira demão.
  4. Prepare a mistura de mestre separada para cada gene a ser detectadas, de acordo com o número de amostras. Para cada amostra de cDNA (qPCR bem), a quantidade de reação é preparada de acordo com a tabela 2.
IngredientesQuantidade (µ l) / (20 µ l) de amostra
Mistura de mestre SYBR10
Encaminhar Primer - 10 μM2
Primer reverso - 10 μM2
Água livre de DNase e RNase3
amostra de cDNA3

Tabela 2: materiais para PCR quantitativo em tempo real, de amostras de cDNA. Necessária a quantidade de ingredientes para preparar uma mistura de mestre para uma amostra para qPCR.

  1. Coloca cada amostra dos respectivos poços.
  2. Criar o layout de amostra para a placa de 96 qPCR bem. Para cada amostra e gene analisado, realizar a reação triplica, ou pelo menos em duplicatas.
  3. A placa bem 96 com uma capa de opticamente adesiva do selo.
  4. Rápido-girar a placa para permitir a mistura de reação para atingir o fundo de cada poço.
  5. Execute o RT-qPCR de acordo com o seguinte gradiente térmico:
    1) 50 ° C por 2 min
    2) 95 ° C por 2 min
    3) 95 ° C por 15 s
    4) tomar a leitura
    5) 60 ° C por 1,5 min
    6) Repita a etapa 3 para 39 vezes
  6. Execute o seguinte gradiente térmico na continuação de acima para determinar a curva de fusão que indica a amplificação de único produto.
    7) 65 ° C por min 0,31
    0,5 ° C/ciclo
    9) leitura de placa
    10) Repita o passo 8 para 60 vezes até atingir 95 ° C
    11) 72 ° C por 2 min

4. eletroforese em gel de Agarose para confirmar a amplificação de gene única

  1. Prepare o gel de agarose 1% em 1 x TBE de buffer.
  2. Adicionar o brometo de etídio (EtBr) em gel quente (~ 50 ° C) até atingir uma concentração final de aproximadamente 0,2-0,5 µ g/mL. EtBR vincula com DNA e lhe permite ser visualizado sob luz em um gerador de imagens de gel UV.
  3. Despeje o gel quente em uma bandeja de gel fornecida com uma caixa de gel de eletroforese. Anexe o pente fornecido firmemente para poços de uniformes.
  4. Permitir que o gel para descanso e arrefecer à temperatura ambiente (RT) para ~ 30 min.
  5. Quando o gel é solidificado, coloque o gel e bandeja na caixa de gel.
  6. Encha a caixa de gel com 1 x TBE buffer até que o gel está completamente coberto.
  7. Medir a concentração do DNA do processo de amplificação do PCR usando um espectrômetro UV.
  8. Pegue ~ 15 ng de DNA em um pequeno tubo PCR, adicione 5 µ l de tintura e adicione a quantidade necessária de água livre de nuclease para alcançar um volume total de 15 µ l.
  9. Carrega a escada de DNA e amostras nos poços.
  10. Funcione o gel a 100 V, até a linha de tintura é aproximadamente 75% - 80% abaixo do gel.
    Nota: Certifique-se que o gel é executado a partir de um negativo de carga positiva.
  11. Remover o gel e coloque-o no tonalizador de gel para visualizar o DNA.

5. análise de ciclo de celular

  1. Células de5 sementes 5 x 10 para cada amostra em um balão de2 cm T25 e executam uma transfecção de acordo com o protocolo descrito no ponto 1, as etapas 1 a 5.
  2. Após 24 h e 48 h, em seguida recolher as células por tripsinização.
  3. As suspensões celulares de transferência para tubos de 15 mL estéreis e rotulá-los corretamente.
  4. Centrifugar as amostras a 751 x g por 5 min e descartar o sobrenadante.
  5. Adicionar 2 mL de PBS 1x gelada, vortex e centrifugar 751 x g por 5 min. descartar o sobrenadante.
  6. Repita a etapa de lavagem com 1X PBS para remover mídia residual.
  7. Resuspenda e quebrar a pelota adicionando-se 200 µ l de PBS 1x gelada por pipetagem.
  8. Corrigi as células adicionando 2 mL de etanol a 70% gelado gota a gota ao tubo enquanto num Vortex suavemente.
  9. Incubar os tubos por 30 min em RT e coloque os tubos a 4 ° C, durante 1 h.
  10. Remova os tubos de 4 ° C e centrifugar 751 x g por 5 min.
  11. Adicionar 2 mL de PBS 1x gelada, vortex e centrifugar 751 x g por 5 min. descartar o sobrenadante.
  12. Adicionar 500 µ l de 1X PBS com iodeto de propidium (50 µ g/mL) e ribonuclease um (200 µ g/mL)
  13. Incube durante 30 min à RT ao proteger as amostras de luz.
  14. Aquisição de dados em citômetro de fluxo. Usar-se para a frente vs dispersão lateral (FSC vs CCD) para selecionar a principal população de células, excluindo os restos no canto esquerdo inferior da FSC vs CCD densidade enredo e célula clusters no topo a topo-lado direito do enredo de densidade do FSC vs CCD.
  15. Analise os dados para identificação de populações de células por fase do ciclo celular com software apropriado.

6. apoptose ensaio

  1. Células de5 sementes 5 x 10 para cada amostra em um balão de2 cm T25 e executam uma transfecção de acordo com o protocolo descrito no ponto 1, as etapas 1 a 5.
  2. Após 24 h e 48 h, recolher as células por tripsinização.
  3. As suspensões celulares de transferência para tubos de 15 mL estéreis e rotulá-los corretamente.
  4. Centrifugar a 751 x g por 5 min e descartar o sobrenadante.
  5. Adicionar 2 mL de PBS 1x gelada, vortex e centrifugar 751 x g por 5 min. descartar o sobrenadante.
  6. Repita a etapa de lavagem com 1X PBS para remover mídia residual.
  7. Diluir 10 x buffer de vinculação anexina V para 1x com gelada dH2O.
  8. Adicionar 1 mL de tampão de ligação anexina V 1x a cada tubo de amostra e ressuspender delicadamente.
  9. Suspensão de células de lugar 96 µ l em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
  10. Adicione 1 µ l de conjugado anexina V-FITC e 12,5 µ l de iodeto de propidium (PI) para o tubo contendo a suspensão de eritrócitos.
  11. Incube a suspensão de eritrócitos durante 10 minutos no gelo no escuro.
  12. Adicione 250 µ l gelada 1 x buffer de vinculação anexina V para cada tubo de amostra para diluir.
  13. Analise amostras com citômetro de fluxo imediatamente.

7. expressão de proteína por microarray do ciclo celular anticorpo

  1. Células de5 sementes 5 x 10 para cada amostra em frascos de2 cm T25 e executam uma transfecção de acordo com o protocolo descrito no ponto 1, as etapas 1 a 5.
  2. Após 24 h e 48 h, colha células por tripsinização.
  3. Suspensões celulares de transferência para tubos de 15 mL e classificá-los em conformidade.
  4. Centrifugar a 751 x g por 5 min e descartar o sobrenadante.
  5. Adicionar 2 mL de PBS 1x gelada, vórtice e centrifugar 751 x g por 5 min. descartar o sobrenadante.
  6. Repita a etapa de lavagem com 1X PBS.
  7. Adicione 150 µ l de tampão de Lise suplementado com inibidores de protease. Pipeta acima e para baixo suavemente para romper as membranas celulares.
  8. Para evitar qualquer interferência de tampão de Lise, execute uma troca de reserva para substituir o tampão de Lise com buffer de rotulagem, usando colunas de troca solvente do fabricante.
  9. Quantificar a proteína total com um ensaio BCA.
  10. Pegue 70 µ g de amostra de proteína e adicionar buffer de rotulagem para alcançar um volume final de 75 µ l.
  11. Adicione 100 µ l de dimetilformamida (DMF) a 1 mg de reagente de biotina (biotina/DMF).
  12. Adicionar 3 µ l do biotina/DMF para cada amostra de proteína (biotinilado amostra de proteína) e incube por 2 h no RT
  13. Adicione 35 µ l de reagente de paragem e misture num Vortex.
  14. Incube as amostras na RT por 30 min.
  15. Retire as lâminas de microarray da geladeira para que eles o aquecimento para RT para 1 h antes do uso.
  16. Realizar bloqueio para inespecificas incubando-se as lâminas com solução de 3% de leite seco (no bloqueio reagente fornecida pelo fabricante) em uma placa de Petri com agitação contínua durante 45 min à RT
  17. Lave os slides com água de2O ddH (a menos que especificado de outra forma, lavagem ocorre com DDQ2O).
  18. Repita a etapa de lavagem ~ 10 x para remover completamente a solução bloqueio de superfícies o slide. Isto é importante para alcançar um fundo uniforme e baixo.
  19. Remover excesso de água das superfícies slide e prossiga para a etapa seguinte sem deixar os slides que seque.
  20. Prepare a solução de acoplamento dissolvendo leite seco 3% em um reagente de acoplamento.
  21. Adicione 6 mL da solução de acoplamento e à quantidade da amostra previamente preparada biotinilado proteína completa da etapa 7.12.
  22. Lugar um slide em um poço da câmara de acoplamento fornecido pelo fornecedor e adicionar ~ 6 mL de proteína acoplamento mistura a ele.
    Nota: Certifique-se que o slide é totalmente submersa na proteína mistura solução de acoplamento.
  23. Tampa da câmara de acoplamento e incubar durante 2 h a RT com agitação contínua em um agitador orbital.
  24. Transferir os slides para uma placa de Petri e adicionar 30 mL de 1x tampão de lavagem. Coloque o prato de Petri em agitador orbital, agitar durante 10 min e descartar a solução.
  25. Repita a etapa 7,24 2 x.
  26. Enxágue as lâminas com água de2O ddH extensivamente como descrito nos passos 7.17 e 7.18 e prossiga para a próxima etapa imediatamente para evitar a secagem.
  27. Adicione 30 µ l de Cy3-streptavidin (0,5 mg/mL) em 30 mL de tampão de deteção.
  28. Coloque o slide em uma placa de Petri e adicionar 30 mL de solução tampão de deteção com Cy3-estreptavidina.
  29. Incube em um agitador orbital por 20 min com agitação contínua protegida da luz.
    Nota: Cy-3 é um corante fluorescente. Cubra com papel alumínio ou operar em condições de escuras para manter a intensidade da fluorescência.
  30. Executar etapas 7.24-7.26 e permitir que o slide secar usando uma ligeira corrente de ar ou colocar o slide em um tubo cônico de 50 mL e centrifugar 1300 x g por 5-10 min.
  31. Coloque o slide na tampa com papel alumínio e slide.
  32. Digitalize o slide em um scanner de microarray com os apropriado da excitação e emissão de comprimentos de onda. No caso de Cy3, o pico de comprimento de onda de excitação é em ~ 550 nm e emissão de pico em ~ 570 nm.
  33. Analise os dados (ver Tabela de materiais) para software utilizado).

8. a sequenciação do ARN

  1. Células de5 sementes 5 x 10 para cada amostra em frascos de2 cm T25 e executam uma transfecção de acordo com o protocolo descrito no ponto 1, as etapas 1 a 5.
  2. Após 24 h e 48 h, recolher as células por tripsinização.
  3. As suspensões celulares de transferência para tubos de 15 mL e classificá-los em conformidade.
  4. Extraia o RNA de acordo com a seção 2, as etapas 1 a 6.
  5. Verificar a qualidade do RNA, bem como a concentração com um bioanalyzer. Uma integridade de RNA Pontuação (RIN) acima de oito anos e adequado histogramas são necessárias para confirmar a qualidade do RNA.
  6. Partir do RNA total, use ~ 2 µ g da amostra de RNA (RNA mensageiro de RNA total) de sequenciamento
  7. Sequência usando um sequenciador de última geração11.
  8. Executar a filtragem de qualidade e um mapa com um genoma de referência de FASTQ arquivos gerados a partir do RNA sequenciamento máquina11.
  9. Upload de arquivos FASTQ e cru leitura os dados de contagem para o banco de germoplasma, seguindo as instruções do < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/> site.
    Nota: Ver número de adesão SRP133420 para resultados anteriores.

9. ensaio de formação de tubo

  1. Avalie o potencial angiogênico da veia umbilical humana miRNA-transfectadas do pós-transfection 36h de células endoteliais (HX), conforme descrito na seção 1, as etapas 1-5, usando HUVEC células em vez de células A549.
  2. Fome HX com mídia de fome M199 por 4 h a 37 ° C com 5% de CO2.
  3. Remova a matriz de membrana basal reduzida de fator de crescimento de-80 ° C e loja a 4 ° C durante a noite, permitindo o descongelamento gradual evitar a polimerização e formação de bolhas.
  4. Lentamente e com cuidado casaco poços de uma placa bem 96 com 0,04 mL de matriz de membrana basal de fator de crescimento reduzido, evitando a formação de bolhas. Execute todo o processo sob uma capa de fluxo laminar.
  5. Preencha cavidades adjacentes da placa bem 96 com 0,1 mL de PBS para manter a umidade e mantém a temperatura.
  6. Incube a placa bem 96 a 37 ° C durante pelo menos 20 minutos para que a polimerização do extrato de membrana basal é alcançada. Não incube durante mais de 1 h.
  7. Trypsinize transfectadas HX de cada grupo e Resuspenda em meio M199 com uma concentração de 1 x 105 células/mL.
  8. Adicione 0,1 mL de cada suspensão de células nos poços contendo matriz polimerizada membrana basal em placa de 96 bem.
  9. Incube a placa bem 96 a 37 ° C com 5% CO2 enquanto preparação dos fatores de crescimento ocorre. Preparação de fatores de crescimento também ocorre sob o capô de fluxo laminar.
  10. Reconstituir os fatores de crescimento (VEGF) em 2x a concentração final desejada (4 concentração de ng/mL para concentração final de 2 ng/mL) e adicionar 0,1 mL de fator de crescimento, contendo meio de fome M199 em cima a 0,1 mL do meio de fome M199 com as células. Para poços de VEGF não-tratados, adicione 0,1 mL de meio de fome M199 em cima a 0,1 mL do meio de fome M199 com as células.
  11. Incube a placa bem 96 para 6 h a 37 ° C com 5% de CO2.
  12. No final do período de incubação, obter imagens de cada poço com ampliação de 4x, usando um microscópio de brightfield conectado com uma câmera digital.
  13. Processar imagens com software equipado com um plug-in "angiogênese analisador"19. Use três parâmetros, o número de nós, o número de cruzamentos e comprimento total de broto, para comparar os efeitos do tratamento de miRNA na angiogênese.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Análise da expressão de gene usando a electroforese do gel e RT-qPCR

Análise da expressão de genes diferencial usando RT-qPCR demonstrou significativa downregulation de genes alvo CDK1, CDK4 e CDK6. CDK1 e CDK4/6 foram mostrados para ser instrumental para o G2/M e transições de G1/S, respectivamente. A análise realizada permitiu a comparação directa entre miRs individuais e atividade combinatória miR. O uso de s...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

os miRNAs pode operar como terapias alvo para tratamento de câncer, reconhecendo a desregulação dos níveis de expressão em doentes vs tecidos normais. Este estudo teve como objetivo determinar os miRNAs que potencialmente interromper a progressão do ciclo celular durante vários estágios. Identificou-se que miR-143 e miR-506 interromper o ciclo celular de células cancerosas e os protocolos apresentados objetivou compreender a atividade deste tratamento miRNA combinatória.

As metodologias descri...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostaria de reconhecer John Caskey na Louisiana State University por sua assistência na análise de dados de sequenciamento do RNA e o Universidade do Texas Southwestern Medical Center, McDermott próxima geração sequenciamento núcleo central para o caminho realizando a análise de dados e sequenciamento de RNA. Esta pesquisa foi apoiada pela faculdade de farmácia, Universidade de Louisiana, Monroe financiamento de start-up e os institutos nacionais de saúde (NIH) por meio do Instituto Nacional de geral médica ciência subsídios 5 P20 GM103424-15, 3 P20 GM103424-15S1.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Não há conflitos de interesse são declarados.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
-80 ° C FreezerVWRVWR40086A
placa de 96 poçosCELLTREAT Scientific 50-607-511
Placas de Micropoços de 96 poços   Thermo Scientific12-556-008
A549 Células de Câncer de Pulmão de Células Não PequenasATCCATCC  CCL-185
AgaroseVWR0710-25G
Agilent 2100 BioanalisadorSilenciador Ambion Agilent TechnologiesG2938c
Negativo No. 1 siRNAAmbionAM4611
Solução Antibiótica-Antimicótica (100x)Gibco15240-062   
Kit de Ensaio de Anticorpos, 2 ReaçõesLua Cheia BioKAS02
Microscópio de campo brilhante   Microscóptica IV-900
Microscópio de campo brilhante   Novo Star Environment LLC
Cell Cycle Antibody Array, 2 SlidesFull Moon BioACC058
Cell Logic+ Biosafety CabinateLabconco342391100
Cellquest ProBD bioscience Passos5.14; 6.13: Usado para calcular a distribuição da população de acordo com a fase do ciclo celular e para calcular a distribuição da população para a análise de apoptose 
Sistema de Tempo Real CFX96MóduloÓptica BioRad CFX96
Sistema de Imagem de Toque ChemidocSistemaToque
Incubadora de CO2Thermo ScientificHERAcell 150i
Matriz de Membrana de Pouso com Fator de Crescimento Reduzido Cultrex CâmeraTrevigen3433-010-01
AmScope FMA050
DMEM 4,5 g/L de glicose, sem piruvato de sódio, com L-glutaminaVWRVWRL0100-0500
DNAse ISuplemento de
Crescimento de Células Endoteliais (ECGS)BD Biosciences356006
Conjuntos Eppendorf Pipeta Pick-A-Pack Eppendrof05-403-152
Etanol, Absoluto (200 Provas), Molecular Grau de Biologia, Fisher BioReagentsBP2818500
Brometo de EtídioAlfa acarL07462
F-12K Mistura de Nutrientes (Mod de Kaighn) com L-glutamina, Corning Corning45000-354
FACS Citômetro de Fluxo Calibur SoroBovino Becton Dickinson
- PremiumAntlanta BiologicalsS11150
Fetal Soro Bovino (FBS)Fisher Scientific10438026
Fisherbrand Basix Tubos de Microcentrífuga com Tampas de Pressão PadrãoFisherbrand Basix02-682-002
Incubadora de CO2 de Jaqueta de Água Forma Série IIThermo Scientific
(5000 U/mL)HospiraNDC#63739-920-11
Sistema de eletroforese HorixontalBancada sistema de laboratórioBT102
tem-miR-143-3p miRNA MimicABMMCH01315
has-miR-506-3p miRNA MimicABMMCH02824
Fator de Crescimento Endotelial Vascular Recombinante Humano (VEGF)Thermo ScientificPHC9394   
Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC)Doadores individuaisIRB# A15-3891
HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS)Fisher ScientificSH30256FS
Ingenuity Pathway AnalysisQiagenResultados: Usado para análise
Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterInvitrogen10-977-015
Lipofectamina 2000 Invitrogen11-668-027
Carregando corante 10Xward's science+470024-814
Médio M199 (com Earle′ sais, L-glutamina e bicarbonato de sódio)Sigma AldrichM4530
Microscópio Câmera DigitalAmScope MU130
Modfit LTVerity SoftwareEtapa 5.15: Software alternativo para análise de distribuições
Nanodrop Thermo ScientificNanoDrop one C
Opti-MEMGibco by life technologies31985-070
Penicilina-estreptomicina 10/10Antlanta BiologicalsB21210
Power UP sybr green master mixApplied BiosystemsA25780
Propidium IodideMP Biochemicals LLCIC19545825
Proscanarray HT Microarray scannerPerkin elmerASCNPHRG. Usamos o comprimento de onda do laser de excitação em 543 nm.
q Capa adesiva óptica PCRApplied Biosystems4360954
Quick-RNA KitsZymo ResearchR1055
Ribonuclease A do pâncreas bovinoSigmaR6513-50MG
ScanArray ExpressPerkinElmerEtapa 7.33: Software
ShakerThermo Scientific2314
Termociclador SimpliAmpApplied Biosystems
Tubos de Centrífuga SpectraTube 15mlVWR470224-998
Tubos de Centrífuga SpectraTube 50mlVWR470225-004
TBS Tampão, 20x líquidoVWR10791-796
Temperatura controlada  centrífuga matchineThermo ScientificST16R
Micro centrífuga com temperatura controladaEppendrof5415R
Thermo Scientific BioLite Frascos tratadoscom cultura de células Thermo Scientific12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA Protein AssayThermo ScientificPI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer ThermoScientificPI89900
Placas de Saia Completa Thermo-Fast Thermo-Fast 96-WellThermo ScientificAB0800WL
Thermo Scientific Verso Kit de Síntese de cDNA (100 execuções)Thermo ScientificAB1453B
Ultra Low Range DNA LadderInvitrogen10597012
VWR refrigerador de laboratório de porta sólida padrãoVWR VWR
Controle de de Imagem de BioRad Digital Fetal Solução de Heparina de vias de bioinformáticapopulacionais do ciclo celularde análise de microarray

Referências

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Errata

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 4/26/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis.  An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

George Matthaiolampakis

to:

George Mattheolabakis

Etiquetas

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