miRNA terapêutica tem potencial significativo na regulamentação da progressão do câncer. Demonstrado aqui abordagens analíticas são usadas para a identificação da atividade de um tratamento de combinatória miRNA em travar o ciclo celular e a angiogênese.
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Artigo de método
Análise de combinatória miRNA tratamentos para regular o ciclo de celular e a angiogênese
Neste artigo
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Resumo
Resumo
Câncer de pulmão (LC) é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. Semelhante a outras células de câncer, uma característica fundamental das células LC é a proliferação desregulada e divisão celular. Inibição da proliferação de travar a progressão do ciclo celular tem demonstrada ser uma abordagem promissora para o tratamento de câncer, incluindo o LC.
miRNA terapêutica têm emergido como reguladores do importante gene pós-transcricional e cada vez mais estão sendo estudadas para uso no tratamento do câncer. Em recente trabalho, utilizamos dois miRNAs, miR-143 e miR-506, para regular a progressão do ciclo celular. Células de câncer (NSCLC) de pulmão não-pequenas células A549 foram transfectadas, analisaram-se alterações de expressão de gene e atividade apoptotic devido ao tratamento foi finalmente analisada. Downregulation de quinases cyclin-dependente (CDKs) foram detectados (i.e., CDK1, CDK4 e CDK6), e o ciclo celular parou nas transições de fase G1/S e G2/M. Análise do caminho indicado potencial atividade antiangiogênica do tratamento, que dota a abordagem com atividade multifacetada. Aqui descritos são as metodologias utilizadas para identificar a atividade de miRNA relativas à inibição do ciclo celular, indução da apoptose e efeitos do tratamento em células endoteliais através da inibição da angiogênese. Espera-se que os métodos apresentados aqui vão apoiar pesquisas futuras na terapêutica de miRNA e atividade correspondente e que os dados representativos guiará outros pesquisadores durante as análises experimentais.
Introdução
O ciclo celular é uma combinação de vários eventos regulatórios que permitem a duplicação de DNA e a célula proliferação através do processo mitótico1. Quinases cyclin-dependente (CDKs) regulam e promovem o ciclo celular2. Entre eles, o CDK mitótica (CDK1) e CDKs interfase (CDK2, CDK4 e CDK6) têm um papel essencial no ciclo celular progressão3. Proteína do retinoblastoma (Rb) é fosforilada pelo CDK4/CDK6 complexo para permitir de progressão do ciclo celular4, e ativação de CDK1 é essencial para o sucesso de divisão celular5. Inibidores CDK numerosas ....
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Protocolo
1. miR-143 e miR-506 transfecção
Atenção: Utilize luvas de látex, óculos de protecção e um casaco de laboratório durante a realização dos experimentos descritos. Quando necessário, use o gabinete de segurança biológica com o ventilador do gabinete, sem bloqueio das vias aéreas ou perturbando o fluxo de ar laminar. Sempre como a janela de vidro protegendo a altura apropriada, conforme descrito pelo fabricante.
- Células de NSCLC A549 semente em uma T25 cm2 balão/6/96 bem placa em DMEM/F12K mídia suplementado com 10% FBS e 1% penicilina-estreptomicina (meios de cultura) em uma capa de cultura de tecidos e incubam durante um....
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Resultados
Análise da expressão de gene usando a electroforese do gel e RT-qPCR
Análise da expressão de genes diferencial usando RT-qPCR demonstrou significativa downregulation de genes alvo CDK1, CDK4 e CDK6. CDK1 e CDK4/6 foram mostrados para ser instrumental para o G2/M e transições de G1/S, respectivamente. A análise realizada permitiu a comparação directa entre miRs individuais e atividade combinatória miR. O uso de s.......
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Discussão
os miRNAs pode operar como terapias alvo para tratamento de câncer, reconhecendo a desregulação dos níveis de expressão em doentes vs tecidos normais. Este estudo teve como objetivo determinar os miRNAs que potencialmente interromper a progressão do ciclo celular durante vários estágios. Identificou-se que miR-143 e miR-506 interromper o ciclo celular de células cancerosas e os protocolos apresentados objetivou compreender a atividade deste tratamento miRNA combinatória.
As metodologias descri.......
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Divulgações
Os autores gostaria de reconhecer John Caskey na Louisiana State University por sua assistência na análise de dados de sequenciamento do RNA e o Universidade do Texas Southwestern Medical Center, McDermott próxima geração sequenciamento núcleo central para o caminho realizando a análise de dados e sequenciamento de RNA. Esta pesquisa foi apoiada pela faculdade de farmácia, Universidade de Louisiana, Monroe financiamento de start-up e os institutos nacionais de saúde (NIH) por meio do Instituto Nacional de geral médica ciência subsídios 5 P20 GM103424-15, 3 P20 GM103424-15S1.
Agradecimentos
Não há conflitos de interesse são declarados.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| -80 ° C Freezer | VWR | VWR40086A | |
| placa de 96 poços | CELLTREAT Scientific | 50-607-511 | |
| Placas de Micropoços de 96 poços | Thermo Scientific | 12-556-008 | |
| A549 Células de Câncer de Pulmão de Células Não Pequenas | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Agarose | VWR | 0710-25G | |
| Agilent 2100 Bioanalisador | Silenciador Ambion Agilent Technologies | G2938c | |
| Negativo No. 1 siRNA | Ambion | AM4611 | |
| Solução Antibiótica-Antimicótica (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Kit de Ensaio de Anticorpos, 2 Reações | Lua Cheia Bio | KAS02 | |
| Microscópio de campo brilhante | Microscóptica | IV-900 | |
| Microscópio de campo brilhante | Novo Star Environment LLC | ||
| Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides | Full Moon Bio | ACC058 | |
| Cell Logic+ Biosafety Cabinate | Labconco | 342391100 | |
| Cellquest Pro | BD bioscience Passos | 5.14; 6.13: Usado para calcular a distribuição da população de acordo com a fase do ciclo celular e para calcular a distribuição da população para a análise de apoptose | |
| Sistema de Tempo Real CFX96 | Módulo | Óptica BioRad CFX96 | |
| Sistema de Imagem de Toque Chemidoc | Sistema | Toque | |
| Incubadora de CO2 | Thermo Scientific | HERAcell 150i | |
| Matriz de Membrana de Pouso com Fator de Crescimento Reduzido Cultrex Câmera | Trevigen | 3433-010-01 | |
| AmScope | FMA050 | ||
| DMEM 4,5 g/L de glicose, sem piruvato de sódio, com L-glutamina | VWR | VWRL0100-0500 | |
| DNAse I | Suplemento de | ||
| Crescimento de Células Endoteliais (ECGS) | BD Biosciences | 356006 | |
| Conjuntos Eppendorf Pipeta Pick-A-Pack Eppendrof | 05-403-152 | ||
| Etanol, Absoluto (200 Provas), Molecular Grau de Biologia, | Fisher BioReagents | BP2818500 | |
| Brometo de Etídio | Alfa acar | L07462 | |
| F-12K Mistura de Nutrientes (Mod de Kaighn) com L-glutamina, Corning Corning | 45000-354 | ||
| FACS Citômetro de Fluxo Calibur Soro | Bovino Becton Dickinson | ||
| - Premium | Antlanta Biologicals | S11150 | |
| Fetal Soro Bovino (FBS) | Fisher Scientific | 10438026 | |
| Fisherbrand Basix Tubos de Microcentrífuga com Tampas de Pressão Padrão | Fisherbrand Basix | 02-682-002 | |
| Incubadora de CO2 de Jaqueta de Água Forma Série II | Thermo Scientific | ||
| (5000 U/mL) | Hospira | NDC#63739-920-11 | |
| Sistema de eletroforese Horixontal | Bancada sistema de laboratório | BT102 | |
| tem-miR-143-3p miRNA Mimic | ABM | MCH01315 | |
| has-miR-506-3p miRNA Mimic | ABM | MCH02824 | |
| Fator de Crescimento Endotelial Vascular Recombinante Humano (VEGF) | Thermo Scientific | PHC9394 | |
| Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) | Doadores individuais | IRB# A15-3891 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | SH30256FS | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | Resultados: Usado para análise | |
| Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10-977-015 | |
| Lipofectamina 2000 | Invitrogen | 11-668-027 | |
| Carregando corante 10X | ward's science+ | 470024-814 | |
| Médio M199 (com Earle′ sais, L-glutamina e bicarbonato de sódio) | Sigma Aldrich | M4530 | |
| Microscópio Câmera Digital | AmScope | MU130 | |
| Modfit LT | Verity Software | Etapa 5.15: Software alternativo para análise de distribuições | |
| Nanodrop Thermo Scientific | NanoDrop one C | ||
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 31985-070 | |
| Penicilina-estreptomicina 10/10 | Antlanta Biologicals | B21210 | |
| Power UP sybr green master mix | Applied Biosystems | A25780 | |
| Propidium Iodide | MP Biochemicals LLC | IC19545825 | |
| Proscanarray HT Microarray scanner | Perkin elmer | ASCNPHRG. Usamos o comprimento de onda do laser de excitação em 543 nm. | |
| q Capa adesiva óptica PCR | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Quick-RNA Kits | Zymo Research | R1055 | |
| Ribonuclease A do pâncreas bovino | Sigma | R6513-50MG | |
| ScanArray Express | PerkinElmer | Etapa 7.33: Software | |
| Shaker | Thermo Scientific | 2314 | |
| Termociclador SimpliAmp | Applied Biosystems | ||
| Tubos de Centrífuga SpectraTube 15ml | VWR | 470224-998 | |
| Tubos de Centrífuga SpectraTube 50ml | VWR | 470225-004 | |
| TBS Tampão, 20x líquido | VWR | 10791-796 | |
| Temperatura controlada centrífuga matchine | Thermo Scientific | ST16R | |
| Micro centrífuga com temperatura controlada | Eppendrof | 5415R | |
| Thermo Scientific BioLite Frascos tratados | com cultura de células Thermo Scientific | 12-556-009 | |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Thermo Scientific | PI23225 | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer Thermo | Scientific | PI89900 | |
| Placas de Saia Completa Thermo-Fast Thermo-Fast 96-Well | Thermo Scientific | AB0800WL | |
| Thermo Scientific Verso Kit de Síntese de cDNA (100 execuções) | Thermo Scientific | AB1453B | |
| Ultra Low Range DNA Ladder | Invitrogen | 10597012 | |
| VWR refrigerador de laboratório de porta sólida padrão | VWR VWR |
Referências
- Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
- Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
- Malumbres, M., Barbacid, M.
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 4/26/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis. An author name was updated.
One of the authors' names was corrected from:
George Matthaiolampakis
to:
George Mattheolabakis
