Summary
Ce travail décrit la synthèse et la caractérisation d'un homo-PROTAC bifonctionnel à base de pomalidomide comme une nouvelle approche pour induire l'ubiquitination et la dégradation du cereblon de ligase d'ubiquitine E3 (CRBN), la cible des analogues de la thalidomide.
Abstract
Les médicaments immunomodulatoires (IMiDs) thalidomide et ses analogues, lénalidomide et pomalidomide, tous les médicaments approuvés par la FDA pour le traitement du myélome multiple, induire l'ubiquitination et la dégradation des facteurs de transcription lymphoïde Ikaros (IKZF1) et Aiolos (IKZF3) via le cereblon (CRBN) E3 ubiquitin ligase pour la dégradation protéasomal. IMiDs ont récemment été utilisés pour la génération de chiolyse bifonctionnelle ciblant les chimères (PROTACs) pour cibler d'autres protéines pour l'ubiquitination et la dégradation protéasomal par la ligase CRBN E3. Nous avons conçu et synthétisé des PROTAC homobifonctionnels à base de pomalidomide et analysé leur capacité à induire l'ubiquitination autodirigée et la dégradation de CRBN. Ici, CRBN sert à la fois, la ligase d'ubiquitine E3 et la cible en même temps. Le composé homo-PROTAC 8 dégrade CRBN avec une puissance élevée avec seulement des effets restants minimes sur IKZF1 et IKZF3. L'inactivation de CRBN par le composé 8 n'a eu aucun effet sur la viabilité et la prolifération de cellules multiples différentes. Cet homo-PROTAC abroge les effets des IMiD dans plusieurs cellules de myélome. Par conséquent, nos composés homodimériuns à base de pomalidomide peuvent aider à identifier les substrats endogènes et les fonctions physiologiques de CRBN et à étudier le mécanisme moléculaire des MiD.
Introduction
Les médicaments immunomodulateurs (IMiDs) thalidomide et ses analogues, lénalidomide et pomalidomide, tous approuvés pour le traitement du myélome multiple, se lient à l'E3 ubiquitin ligase cereblon (CRBN), un adaptateur de substrat pour cullin4A-RING E3 ubiquitin ligase (CRL4CRBN)1,2,3. La liaison des IMiD améliore l'affinité du CRL4CRBN aux facteurs de transcription lymphoïde Ikaros (IKZF1) et Aiolos (IKZF3), conduisant à leur ubiquitination et dégradation (Figure 1)4,5, 6 Annonces , 7 Annonces , 8. Puisque IKZF1 et IKZF3 sont essentiels pour les cellules de myélome multiples, leur inactivation a comme conséquence l'inhibition de croissance. SALL4 a été récemment trouvé comme un néo-substrat iMiD-induit supplémentaire de CRBN qui est probablement responsable de la tératogénicité et la catastrophe dite Contergan dans les années 1950 causée par la thalidomide9,10. En revanche, la caséine 1 (CK1) est un substrat spécifique au lénalidomide de CRBN qui est impliqué dans l'effet thérapeutique dans le syndrome myélodydyplasique avec des suppressions de chromosome 5q11.
La capacité des petites molécules à cibler une protéine spécifique pour la dégradation est une implication passionnante pour le développement de médicaments modernes. Alors que le mécanisme de la thalidomide et de ses analogues a été découvert après leur première utilisation chez l'homme, ce qu'on appelle Proteolyse Targeting Chimeras (PROTACs) ont été conçus pour cibler spécifiquement une protéine d'intérêt (POI) (Figure 2)12,13,14,15,16,17,18. Les PROTAC sont des molécules hétérophobes qui se composent d'un ligand spécifique pour le POI connecté via un linker à un ligand d'une ligase d'ubiquitine E3 comme CRBN ou von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20, 21,22. Les PROTAC induisent la formation d'un complexe ternaire transitoire, dirigeant le POI à la ligase d'ubiquitine d'E3, ayant pour résultat son ubiquitination et la dégradation protéasomal. Les principaux avantages des PROTAC par rapport aux inhibiteurs conventionnels sont que la liaison à un POI est suffisante plutôt que son inhibition et, par conséquent, les PROTAC peuvent potentiellement cibler un spectre beaucoup plus large de protéines, y compris celles qui ont été considérées comme non médicamentables comme facteurs de transcription15. En outre, les molécules chimériques agissent catalytiquement et ont donc une puissance élevée. Après le transfert d'ubiquitine au POI, le complexe ternaire se dissocie et est disponible pour la formation de nouveaux complexes. Ainsi, de très faibles concentrations PROTAC sont suffisantes pour la dégradation de la protéine cible23.
Ici nous décrivons la synthèse d'un homo-PROTAC conjugué pomalidomide-pomalidomide (composé 8) qui recrute CRBN pour la dégradation de lui-même24. L'E3 ubiquitine ligase CRBN sert à la fois de recruteur et de cible en même temps (figure 3). Pour valider nos données, nous avons également synthétisé un contrôle de liaison négatif (composé 9). Nos données confirment que l'homo-PROTAC nouvellement synthétisé est spécifique à la dégradation du CRBN et n'a que des effets minimes sur d'autres protéines.
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Protocol
1. Préparation des molécules PROTAC
CAUTION : Veuillez consulter toutes les fiches de données pertinentes sur la sécurité des matériaux (MSDS) avant d'être utilisées. Plusieurs des produits chimiques utilisés dans ces synthèses sont toxiques et cancérigènes. Veuillez utiliser toutes les pratiques de sécurité appropriées et l'équipement de protection individuelle.
- Préparation de tert-butyl N-(2,6-dioxo-3-piperidyl)carbamate (composé 1)
- Ajouter 1,1'-carbonyldiimidazole (1.95 g, 12 mmol) et une quantité catalytique de 4-(dimethylamino)pyridine (5 mg) à un mélange de Boc-Gln-OH (2.46 g, 10 mmol) en THF (50 ml) en 100 ml de flacon rond de fond avec une barre d'agitation et équipé d'un reflux condenser. Chauffer au reflux pendant 10 h en remuant jusqu'à ce qu'une solution claire soit formée.
- Retirer le solvant sous pression réduite à l'frémisseur rotatif, ajouter EtOAc (200 ml) et le transférer dans un entonnoir séparatif. Laver la couche organique avec H2O (50 ml) et la saumure (50 ml) et la sécher sur Na2SO4.
- Filtrer la solution à l'intérieur d'un court bloc de gel de silice (5 cm de diamètre et 5 cm de hauteur) et échapper à un autre volume (200 ml) d'EtOAc.
- Évaporer le solvant et sécher le solide incolore obtenu dans le vacuo.
- Préparation de tert-butyl N-(1-méthyl-2,6-dioxo-3-piperidyl)carbamate (composé 2)
- Mélanger le composé 1 (2,28 g, 10 mmol) avec le carbonate de potassium moulu (2,76 g, 20 mmol) et le DMF (25 ml) dans un flacon rond de 100 ml. Ajouter de l'iodométhane (1,42 g, 0,62 ml, 10 mmol) à l'aide d'une seringue et équiper le flacon d'un septum en caoutchouc perforé. Placer le vaisseau de réaction dans un bain à ultrasonation pendant 2 h.
- Diluer le mélange de réaction avec EtOAc (100 ml) et le transférer dans un entonnoir séparatiste. Laver la couche organique avec 1 N NaOH (2x 25 ml), H2O (25 ml), et la saumure (25 ml), et la sécher sur Na2SO4.
- Filtrer et évaporer le solvant. Purififier le produit par chromatographie de colonne au-dessus du gel de silice (6 cm de diamètre de colonne et 20 cm de hauteur) en utilisant l'éther/EtOAc de pétrole (2:1).
- Préparation de 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-fluoroisoindoline-1,3-dione (composé 3)
- Mélanger l'anhydride 3-fluorophthalique (1,25 g, 7,5 mmol), le glutarimide 1 (1,14 g, 5 mmol) et une solution d'acétate de sodium (0,50 g, 6,0 mmol) en acide acétique glaciaire (20 ml) dans un flacon de fond rond de 50 ml avec une barre d'agitation et équipé d'un condenseur de reflux. Chauffer le mélange à 120 oC pendant 6 h.
- Après refroidissement, verser le mélange violet sur H2O (100 ml) et remuer pendant 10 min. Recueillir le solide formé par filtration, laver avec H2O (3 x 5 ml) et l'éther de pétrole (3 x 5 ml) et sécher dans le vacuo.
- Préparation de 4-fluoro-2-(1-methyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)isoindoline-1,3-dione (composé 4)
- Mélanger l'anhydride 3-fluorophthalique (1,25 g, 7,5 mmol), le glutarimide 2 (1,21 g, 5 mmol) et une solution d'acétate de sodium (0,50 g, 6,0 mmol) en acide acétique glaciaire (20 ml) dans un flacon de fond rond de 100 ml avec une barre d'agitation et équipé d'un condenseur de reflux. Chauffer le mélange à 120 oC pendant 6 h.
- Après refroidissement, verser le mélange violet sur H2O (100 ml) et remuer pendant 10 min. Recueillir le solide formé par filtration, laver avec H2O (3 x 5 ml) et l'éther de pétrole (3 x 5 ml) et sécher dans le vacuo.
- Préparation de tert-butyl N-[2-[2-[2-[2-[2,6-dioxo-3-piperidyl)-1,3-dioxo-isoindolin-4-yl]amino]ethoxy]ethoxy]ethyl]carbamate (composé 7)
- Chargez un flacon de fond rond de 50 ml avec tert-butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate (5, 0,41 g, 1,65 mmol), composé 3 (0,41 g, 1,50 mmol), DMF sec (10 ml) et DIPEA (0,39 g, 0,51 ml, 3,0 mmol). Équiper d'une barre d'agitation et d'un condensateur de reflux. Chauffer sous l'atmosphère d'argon à 90 oC pendant 10 h.
- Après refroidissement à température ambiante, verser le mélange vert foncé sur H2O (100 ml) et extraire avec EtOAc (3x 50 ml) dans un entonnoir séparatif. Laver les couches organiques combinées avec H2O (50 ml) et saumure (50 ml), sécher sur Na2SO4, filtrer, et se concentrer dans le vacuo.
- Purifiez le produit brut par chromatographie de colonne au-dessus du gel de silice (3 cm de diamètre de colonne et 60 cm de hauteur) en utilisant un gradient d'éther/EtOAc de pétrole (1:1 à 1:2).
- Préparation de l'homodimère (composé 8)
- Combinez le lien 6 (0,22 g, 0,22 ml, 1,50 mmol), le DIPEA (1,05 ml, 6,00 mmol) et une solution de 3 (0,83 g, 3,00 mmol) dans un DMSO sec (20 ml) dans un flacon rond de 50 ml avec une barre d'agitation et équipé d'un condensateur de reflux. Chauffer sous l'atmosphère d'argon à 90 oC pendant 18 h.
- Après refroidissement à température ambiante, verser le mélange vert foncé sur H2O (100 ml) et extraire avec EtOAc (3x 50 ml) dans un entonnoir séparatif. Laver les couches organiques combinées avec H2O (50 ml) et saumure (50 ml), sécher sur Na2SO4, filtrer et se concentrer dans le vacuo.
- Purifiez le produit brut par chromatographie de colonne au-dessus du gel de silice (3 cm de diamètre de colonne et 50 cm de hauteur) en utilisant un gradient d'éther/EtOAc de pétrole (1:2) à EtOAc.
- Préparation de l'hétérodime (composé 9)
- Dissoudre le composé 7 (0,83 g, 1,65 mmol) dans le CHsec 2Cl2 (10 ml). Ajouter l'acide trifluratacétique (10 ml) et remuer le mélange jaune à 40 oC pendant 2 h dans un flacon rond fermé de 50 ml.
- Retirer les volatiles et coévaporer avec CH2Cl2 (4x 5 ml). Sécher les résidus dans le vacuo pendant 10 h.
- Redissoudre le matériau dans le DMF sec (20 ml). Ajouter le composé 4 (0,44 g, 1,50 mmol) et le DIPEA (0,78 g, 1,05 ml, 6,00 mmol) et équiper le flacon de reflux. Chauffer sous l'atmosphère d'argon à 90 oC pendant 10 h.
- Après refroidissement à température ambiante, verser le mélange vert foncé sur H2O (100 ml) et extraire avec EtOAc (3x 50 ml) dans un entonnoir séparatif. Laver les couches organiques combinées avec naHCOsaturé 3 (50 ml), H2O (50 ml), 10 % KHSO4 (50 mL), H2O (50 ml), et saumure (50 ml), sécher sur Na2SO4, filtrer et se concentrer en vacuo.
- Purifiez le produit brut par chromatographie de colonne au-dessus du gel de silice (3 cm de diamètre de colonne et 50 cm de hauteur) en utilisant un gradient d'éther/EtOAc de pétrole (1:2) à EtOAc.
- Élucider et vérifier la structure des molécules (figure 5A composé 8, 5B composé 9) par 1H NMR et 13Spectres RmN C dans DMSO-d6 sur une résonance magnétique nucléaire (RMN) Spectromètre. Vérifiez que la pureté des deux composés est supérieure à 97 % au moyen de la spectrométrie de masse de chromatographie liquide (LC-MS), appliquant une détection de tableau de diode (DAD) à 220 à 500 nm.
2. Validation fonctionnelle des molécules PROTAC
- Analyse de la tache occidentale de la dégradation du CRBN par les PROTAC
REMARQUE: Les effets du composé8 Annonceset composé9 (en)sur le niveau de protéine de CRBN ont été examinés par l'analyse occidentale de tache. En outre, l'impact sur les niveaux IKZF1 et IKZF3 pourrait également être confirmé (Figure 6).-
Préparation de l'échantillon
- Dissoudre les composés 8 et 9, le lénalidomide (Len), le pomalidomide (Pom), le MG132 et le MLN-4924 en DMSO à une concentration de 10 mM, aliquot et stocker à -80 oC jusqu'à une utilisation ultérieure.
- Seed 1 x 106 MM1S cellules dans une plaque de 6 puits avec 2,5 ml de médias et traiter les cellules avec 100 nM ou 1 composé M 8 ou 9 pour 24 h.
- Récolter les cellules après le traitement et la centrifugeuse à 700 x g, 5 min, 4 oC. Laver les granulés de cellules à l'œil de 1x PBS froid pour enlever le support restant, la centrifugeuse à 700 x g, 5 min, 4 oC, et jeter le supernatant. Répétez cette étape une fois.
- Cellules lyse dans le tampon de lyse (25 mM Tris HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 5% glycérol, 1x Protease et Phosphatase Inhibitor Cocktail) pendant 10 min sur glace, centrifugeuse à 320 x g pour 10 min, 4 oC. Récolte supernatant et déterminer la concentration de protéines par un test de protéines d'acide bicinchoninique (bcA test) selon le protocole du fabricant.
- Dénaturer les protéines (15 à 30 g/échantillon) avec 1 x tampon de chargement LDS (5 % de 2-mercaptoethanol) et faire bouillir 10 min, 75 oC.
-
SDS-PAGE (en)
- Fixer le sandwich au gel avec un gel de séparation de 10 % [4 mL 3x gel tampon (3 M Tris/HCl, 0,3 % (w/v) sulfate de dodecyl de sodium (SDS), pH 8,45), 4 mL d'acrylamide 30 %, 2,52 mL de glycérol 50 %, 1 395 mL H2O, 75 O L 11 % de persulfate d'ammonium (APS) et 9,75 [1,992 mL 3x gel tampon, 0,792 mL 30% acrylamide, 3,168 mL H2O, 36 'L 11% APS, et 6 'L TEMED] dans une unité d'assemblage d'électrodes. Enlever les peignes, rincer les puits avec un tampon cathodique (100 mM Tris/HCl, 100 mM tricine, 0,1 % (w/v) SDS) et charger des échantillons.
- Remplir le tampon d'anode (100 mM Tris/HCl, pH 8,9) dans le réservoir. Chargez l'échantillon de protéines de l'étape 2.1.1.4 et exécutez SDS-PAGE à 70 V, 20 min, suivi de 115 V, 150 min à tension constante.
-
Immunoblotting et détection de CRBN, IKZF1 et IKZF3
- Activer la membrane PVDF (0,45 m) dans 100 % de méthanol pendant 1 min. Membrane equilibrate et gel de séparation dans un tampon de transfert 1x [192 mM de glycine, 25 mM Tris-base/HCl, 900 mL H2O), 20 % méthanol, 0,1 % SDS, pH 8,3].
- Assembler la cassette de ballonnement selon le protocole du fabricant. Transférer le gel à 180 mA pendant 90 min.
- Laver la membrane 3x en 1x TBS-T (25 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6, 0,1 % Tween 20) pendant 5 à 10 min chacun à température ambiante. Bloquer la membrane dans 5 % de lait non séché aux graisses (NFDM), TBS-T pendant 1 h à température ambiante. Laver la membrane 3x en 1X TBS-T pendant 5 à 10 min chacune à température ambiante.
- Incuber la membrane avec l'anticorps primaire pour CRBN (1:500 dans 5% BSA, TBS-T) avec des secousses douces à 4 oC, pendant la nuit.
- Laver la membrane 3x en 1X TBS-T pendant 5 à 10 min chacune à température ambiante. Incubate membrane avec anti-souris (1:10.000 dans 5% NFDM, TBS-T) ou anti-lapin (1:5.000 dans 5% NFDM, TBS-T) anticorps secondaires couplés au raifort peroxidase HRP (1 h à température ambiante.)
- Laver la membrane 2x en 1X TBS-T pendant 5 à 10 min chacune à température ambiante. Répétez cette étape deux fois avec 1x TBS.
- Incuber la membrane pendant 2 min avec la solution de substrat HRP selon les protocoles du fabricant et détecter la chemiluminescence dans un dispositif de détection de chemiluminescence.
- Laver la membrane 1x en 1X TBS pendant 5 à 10 min chacune à température ambiante. Pour la libération d'anticorps, la membrane de bande dans le tampon de décapage disponible dans le commerce pendant 15 min. Laver la membrane 3x dans 1X TBS pendant 5-10 min chacun à la température ambiante.
- Reblasser la membrane dans 5 % de lait non séché aux graisses, TBS-T pendant 1 h à température ambiante. Laver la membrane 3x en 1x TBS-T pendant 5 à 10 min chacun e à température ambiante et reprobe avec IKZF1, IKZF3 ou tubulin selon l'étape 2.1.3.4.
-
Préparation de l'échantillon
- Expériences de compétition avec MG132, MLN4942 ou pomalidomide
REMARQUE : Pour confirmer si le CRBN est dégradé par la voie ubiquitine-protéasome, nous avons effectué des expériences de compétition avec l'inhibiteur de protéasome MG132 et un inhibiteur d'enzyme activant de neddylation (NAE) MLN4942 (figure 7).- Seed 1 x 106 MM1S cellules par puits dans une plaque de 6 puits. Cellules de pretreat avec 10 mg MG132, 10 MLN4942, ou lénalidomide (100x), et incuber 1 h à 37 oC, 5 % CO2.
- Ajouter 100 nM composé 8 pour 3 h à 37 oC, 5% CO2.
- Cellules de récolte pour la tache occidentale selon l'étape 2.1.1.
- Tests de viabilité cellulaire dans plusieurs lignées cellulaires de myélome
REMARQUE : Cet essai est utilisé pour tester l'impact sur la viabilité des cellules et, en outre, contrarier l'effet des MiDI sur plusieurs cellules de myélome par prétraitement des cellules avec le composé 8 (Figure 8, Figure 9A, B).- Seed 5 x 104 MM1S cells per well in a 96-well plate in biological triplicates for viability assay. Pour l'analyse de tache occidentale, graine 1 x 106 cellules MM1S par puits dans une plaque de 6 puits dans les triplicats biologiques.
- Traiter les cellules avec DMSO ou 100 nM, 1 M, ou 10 M composé 8, composé 9 ou pomalidomide et incuber pendant 24 h, 48 h, ou 96 h à 37 oC, 5 % CO2. Pour les expériences de sauvetage, traiter les cellules avec 100 nM composé 8 pour 3 h, avant ou après l'ajout de 1 pomalidomide M et couver pendant 96 h.
- Mesurer la luminescence de la plaque de 96 puits avec un analyse de viabilité de cellules luminescentes, selon le protocole du fabricant sur un lecteur de plaque ou des cellules de récolte de la plaque de 6 puits pour l'analyse occidentale de tache.
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Representative Results
Ici nous avons décrit la conception, la synthèse et l'évaluation biologique d'un PROTAC à base de pomalidomide homodimérique pour la dégradation de CRBN. Notre PROTAC interagit simultanément avec deux molécules CRBN et forme des complexes ternaires qui induit l'auto-ubiquitination et la dégradation protéasomal de CRBN avec seulement des effets restants minimes sur les néo-substrats induits par le pomalidomide IKZF1 ou IKZF3.
Sur une série de molécules PROTAC à base de pomalidomide publiées précédemment24, le composé 8 a été particulièrement efficace dans la dégradation induite par les produits chimiques de CRBN. Sa synthèse peut se faire comme suit (Figure 4). Une condensation de l-glutamine protégée par Boc de 1,1'-carbonyldiimidazole conduit à l'imide cyclisé 1. L'analogique N-méthylé 2 est accessible par alkylation avec de l'iodure de méthyle. Les deux blocs de construction (1 et 2) sont transformés, après N-déprotection dans des conditions acides, en dérivés phthalimides (3 et 4) au cours d'une réaction d'ouverture/recyclisation de l'anneau à l'aide de 3- anhydride fluorophthalique. Les analogues de la thalidomide, en général, sont sensibles à la décomposition hydrolytique et ne devraient être utilisés qu'à l'étape suivante après un séchage suffisant. Le composé 3 est sensible à une substitution nucléophile aromatique avec des amines aliphatiques primaires25; cette conversion n'a été constatée efficacement que lorsque des solvants secs sont utilisés. La conception d'un véritable produit homodimérique implique la connexion de deux sous-structures fonctionnelles identiques et l'application de liaisonsymétrique. Le maillon qui fait partie de PROTAC 8 représente une chaîne linéaire à base de N-à-N, à base de polyéthylène. Le correspondant , la diamine 6 conduit au composé final souhaité 8 lorsqu'il est réagi avec le bloc de construction 3 dans la ration molaire de 1:2 dans DMSO à 90 oC. Parmi les autres données analytiques24, la structure de 8 a été vérifiée par les spectres RMN (figure 5A). Composé 9, conçu comme un contrôle négatif approprié, a seulement minime, mais critiques déviations structurelles, par rapport à l'homo-PROTAC actif 8. Il est connu que N-méthylation dans la partie glutarimide abolit CRBN liaison26,27. Une partie de pomalidomide du composé de contrôle négatif 9 porte un résidu deN-méthylle. Il peut être préparé par une première substitution nucléophile de 3 avec le n -monoprotected linker building block 5, suivi d'un clivage du groupe de protection Boc et d'un accouplement ultérieur à l'intermédiaire 4. En raison de sa structure asymétrique, certains des carbones correspondants présentaient des signaux de RMN distincts de 13C (figure 5B).
L'homo-PROTAC 8 a été observé pour être fortement puissant, menant à une dégradation protéasomal presque complète de CRBN. L'interprétation des niveaux de protéines CRBN, IKZF1 et IKZF3 dans plusieurs cellules de myélome a été confirmée par l'analyse de la tache occidentale (Figure 6, Figure 7, Figure 9B), une méthode standard semi-quantitative, où le changement de protéine l'expression peut être détectée facilement. Les anticorps utilisés dans ce document sont de bonne qualité et la méthode est une procédure standard optimisée dans notre laboratoire.
De plus, la dégradation du RRC par le composé 8 n'a pas affecté la viabilité des cellules et a conféré une résistance aux MID (Figure 8, Figure 9A), qui est conforme à l'élimination par LE CRE/Cas9 par sgRNAs24. Le signal de luminescence dans l'analyse de viabilité de cellules était basé sur la libération d'ATP, qui peut être interprétée comme compte mort de cellules. Cette méthode peut être facilement réalisée en peu de temps avec un grand nombre d'échantillons. Une méthode alternative pour la mesure des cellules viables/mortes est une coloration d'annexin eclaïin v/7-AAD par cytométrie de flux.
Figure 1 : Le CRBN de ligase d'ubiquitine E3 est la cible principale des IMiD. Les médicaments immunomodulatoires se lient au CRBN et recrutent plusieurs néo-substrats pour la dégradation protéasomal. La dégradation induite par l'IMiD des facteurs de transcription lymphoïde IKZF1 et IKZF3 est responsable des effets sur les cellules de myélome multiples et certaines des propriétés immunomodulatrices. La caséine kinase 1 est sélectivement dégradée par le lénalidomide mais pas les autres MiD iMiDs et contribue à l'activité du lénalidomide dans le syndrome myélodysplasique avec perte du chromosome 5q. SALL4 a été récemment découvert comme une cible commune de tous les IMiDquielle qui est probablement liée à la tératogénicité induite par la thalidomide et ses analogues. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Les PROTAC dégradent la protéine d'intérêt (POI). Les PROTAC sont des molécules hétérophobes, où un linker relie un ligand de ligase d'ubiquitine à un ligand de POI. Par la formation de complexes ternaires, une ligase d'ubiquitine, telle que CRBN, puis ubiquitinates le POI, ayant pour résultat sa dégradation protéasomal. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Homo-PROTAC bifonctionnel pour la dégradation de l'E3 ubiquitin ligase CRBN. Dans un homo-PROTAC à base de pomalidomide, deux liants de ligase d'ubiquitine sont reliés pour induire l'ubiquitination croisée de CRBN ayant pour résultat un renversement chimiquement induit de CRBN. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Synthèse de l'homodimère 8 et de l'hétérodime 9. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : 1H NMR (en haut) et 13spectres NMR C (en bas). Des spectres du composé 8 (A) et du composé 9 (B) ont été enregistrés dans DMSO-d6 sur un spectromètre de RMN. Les changements chimiques sont donnés en parties par million (ppm). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Effets des composés 8 et 9 sur CRBN, IKZF1 et IKZF3. Le composé homo-PROTAC 8 basé sur le pomalidomide induit la dégradation de CRBN avec de faibles effets restants de pomalidomide sur IKZF1 et IKZF3. En revanche, le composé 9 qui contient un groupe de méthyle sur l'un des résidus de pomalidomide n'a aucun effet sur les concentrations indiquées (M). Les cellules de MM1S ont été traitées pour le traitement de 24 h. Les effets sur CRBN, IKZF1, IKZF3 et tubulin (contrôle de chargement) ont été analysés par tache occidentale. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7 : La dégradation du RBN peut être bloquée par l'inhibiteur du protéasome MG132 ou par MLN4942 qui bloque indirectement les ligases d'ubiquitine par l'inhibition de la neddylation. La lignée cellulaire de myélome multiple MM1a a été prétraitée avec 10 M MG132, 10 MLN4924 pour 1 h avant l'ajout du composé homo-PROTAC 8 à 100 nM pour 3 h de traitement combiné. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 8 : Test de viabilité cellulaire dans les cellules de myélome multiple de MM1S. Effets du composé 8 et du composé négatif de contrôle de liaison 9 sur la viabilité cellulaire dans la ligne sensible de myélome de pomalidomide MM1S après 24 h, 48 h et 96 h traitement. La viabilité cellulaire a été mesurée après 4 jours dans les triplicates. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 9 : Le composé 8 contrarie l'effet du pomalidomide dans les lignées cellulaires de myélome multiples. Les cellules ont été prétraitées avec un composé de 100 nM 8 pour 3 h. Par la suite, 1 pomalidomide de M a été ajouté. La viabilité cellulaire a été mesurée après 4 jours dans les triplicates. p lt;0,001 selon le t-test de l'étudiant (A). Analyse de tache occidentale pour CRBN, IKZF1, IKZF3 et tubulin (contrôle de chargement) après prétraitement des cellules MM1S avec 100 nM composé 8 pour 3 h, avant l'ajout de 1 pomalidomide de M (B). Réimprimé (adapté) avec la permission de Steinebach, C. et al. 201824. Copyright 2019 American Chemical Society. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La conception de ces homo-PROTAC tel que décrit ici pour CRBN repose sur l'affinité spécifique de la pomalidomide à CRBN, qui a été utilisée avec succès dans de nombreux PROTAC hétérofunctional et a abouti au développement de PROTAC 8 comme un très crBN sélectif de grader. La spécificité de notre molécule a déjà été confirmée par des analyses protéomiques24. Pour les KO génétiquement médiatisés, l'exclusion et la validation des effets secondaires est difficile et prend beaucoup de temps. En outre, un renversement induit chimiquement est réversible, rapide et directement applicable à un large éventail de cellules et de types de tissus28.
Les IMiD thalidomide, lénalidomide, et pomalidomide sont devenus un pilier dans le traitement du myélome multiple, des lymphomes de B-cellule et du syndrome myélodysplasique. IMiDs médiateur de leur activité en modulant la spécificité de la ligase CRBN-CRL4 E3 pour dégrader les néo-substrats IKZF1, IKZF3, ou CK16 ,11,29. En outre, IMiDs ont été montrés pour abroger la fonction de chaperon de CRBN sur deux autres protéines, MCT-1 et BSG, qui sont également importants pour la croissance multiple de myélome30. La dégradation de CRBN par le PROTAC homo-bifonctionnel a été bien tolérée par la plupart des lignées cellulaires de myélome multiples examinées, ce qui implique que l'inactivation de CRBN seule n'est pas suffisante pour causer l'abattage des cellules multiples de myélome. En revanche, le prétraitement avec le composé 8 a abrogé les effets des MiD sur la dégradation ikZF1/3 et a sauvé les cellules multiples de myélome du lénalidomide et du pomalidomide. Ceci est en ligne avec l'inactivation génétique de CRBN et des mutations délétères de CRBN trouvées dans les patients multiples résistants au myélome lenalidomide et accentue le rôle essentiel de CRBN dans le mécanisme des IMiDs31,32 . L'homo-PROTAC 8 peut donc être un outil utile pour imiter un état de résistance IMiD. D'autres effets des IMiD qui ne sont pas entièrement compris encore comme l'inhibition de l'angiogénicité ou la libération de TNF mdat peuvent dériver d'une inhibition de la fonction de CRBN et notre homo-PROTAC sont des outils appropriés pour étudier l'inactivation de CRBN plus loin. En outre, le renversement chimiquement induit de CRBN par composé 8 peut aider à identifier de nouveaux substrats endogènes de CRBN et à élucider les fonctions physiologiques de CRBN. Étant donné que notre composé 8 n'a eu aucun effet sur la prolifération de ligne de cellules cancéreuses, l'inhibition de CRBN seule n'a aucune activité antitumorale. Cependant, les dégradants de CRBN peuvent être médicalement applicables dans les maladies autres que le cancer. À cet égard, l'inactivation de CRBN a été récemment montrée pour conférer la résistance au sepsis et pour empêcher l'obésité à haute teneur en graisse-graisse-induite chez les souris 33,34,35.
En conclusion, nous avons généré et validé le premier inhibiteur chimique de CRBN qui peut servir d'outil utile pour de futures investigations biomédicales sur la signalisation rOR et le mécanisme moléculaire de la thalidomide et de ses analogues.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent pas de conflit d'intérêts financier potentiel.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether Program Kr-3886/2-1 et SFB-1074 à J.K.; FOR2372 à M.G.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,1'-Carbonyldiimidazole | TCI chemicals | C0119 | |
| 2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | 385506 | Compound 6 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3-Fluorophthalic anhydride, 98 % | Alfa Aesar | A12275 | |
| 4-Dimethylaminopyridine, 99 % | Acros | 148270250 | Toxic |
| Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%) | Carl Roth | 3029.1 | |
| Aiolos (D1C1E) mAB | Cell signaling | 15103S | |
| Anti-CRBN antibody produced in rabbit | Sigma | HPA045910 | |
| Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody | Sigma | 7074S | |
| Ammonium Persulfate | Roth | 9592.2 | |
| Boc-Gln-OH | TCI chemicals | B1649 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| DMF, anhydrous, 99.8 % | Acros | 348435000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| DMSO, anhydrous, 99.7 % | Acros | 348445000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Goat anti-mouse (HRP conjugated) | Santa Cruz biotechnology | sc-2005 | |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861280 | |
| Ikaros (D6N9Y) Mab | Cell signaling | 14859S | |
| ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm) | Merck | IPVH000010 | |
| Iodomethane, 99 % | Sigma-Aldrich | I8507 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213-2.5L | |
| Mg132 | Selleckchem | S2619 | |
| Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| MLN4942 | biomol (cayman) | Cay15217-1 | |
| Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512) | Sigma | T5168 | |
| N-Ethyldiisopropylamine, 99 % | Alfa Aesar | A11801 | |
| Nonfat dried milk powder | PanReac AppliChem | A0830,0500 | |
| Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate | Thermo Scientific | 136101 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pomalidomide | Selleckchem | S1567 | |
| RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46430 | |
| sodium dodecyl sulfate | Carl Roth | 183.1 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | A9539-500g | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate | Sigma-Aldrich | 89761 | Compound 5 |
| Tricin | Carl Roth | 6977.4 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| WesternBright ECL spray | Advansta | K-12049-D50 |
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