Tratamento de radiação de culturas organotypic de glândulas salivares submandibulares e parótidas modelos chave in vivo características

Resumo

Usar culturas queratinócitos tridimensionais para visualizar a morfologia e os marcadores funcionais de glândulas salivares pode fornecer introspecções novas nos mecanismos de dano de tecido depois da radiação. Descrito aqui é um protocolo para secção, cultura, irradiar, mancha, e imagem 50 – 90 μm de espessura secções salivares antes e após a exposição à radiação ionizante.

Resumo

A hiposalivação e xerostomia criam complicações orais crônicas que diminuem a qualidade de vida em pacientes com câncer de cabeça e pescoço que são tratados com radioterapia. Abordagens experimentais para a compreensão de mecanismos de disfunção da glândula salivar e restauração têm focado em modelos in vivo, que são deficientes por uma incapacidade de sistematicamente tela candidatos terapêuticos e eficiências na transfecção capacidade de manipular genes específicos. A finalidade deste protocolo da cultura queratinócitos da glândula salivar é avaliar o tempo máximo da viabilidade da cultura e caracterizar mudanças celulares depois do tratamento de radiação ex vivo. Nós utilizamos a mancha imunofluorescente e a microscopia confocal para determinar quando as populações e os marcadores específicos da pilha estão atuais durante um período da cultura de 30 dias. Além disso, marcadores celulares previamente relatados em modelos de radiação in vivo são avaliados em culturas que são irradiadas ex vivo. Avançando, este método é uma plataforma atrativa para a avaliação ex vivo rápida de respostas murino e humanas do tecido da glândula salivar aos agentes terapêuticos que melhoram a função salivar.

Introdução

A função apropriada da glândula salivar é essencial à saúde oral e é alterada depois do tratamento do cancro da cabeça e da garganta com radioterapia¹. Em 2017, quase 50.000 casos novos do cancro da cabeça e da garganta foram relatados nos Estados Unidos². Devido aos efeitos tecido-prejudiciais e freqüentemente irreversíveis da terapia de radiação em tecidos normais circunvizinhos tais como as glândulas salivares, os pacientes são deixados frequentemente com efeitos secundários severos e a qualidade de vida diminuída^2,3, a ⁴. Co....

Protocolo

1. preparação do do

1. Pulverize componentes destacáveis do do que inclui a bandeja do amortecedor, o acessório da lâmina, o molde do bloco do agarose, e a película do laboratório com etanol 70%, a seguir UV-sterilize por pelo menos 30 minutos.
2. Coloc e prenda uma folha adicional de película do laboratório sobre a bandeja do amortecedor para impedir que o gelo caia dentro.
3. Encha a câmara de gelo com gelo esmagado, retire a película do laboratório da bandeja do amortecedor, e encha a bandeja do amortecedor com 100 mL da solução salina tampão do fosfato do gelo-frio 1x (PBS) suplementada com a penicilina-estreptomicina-ampicilina de 1% (PSA).

Resultados

As culturas 2-D preliminares são crescidas em meios suplementados do soro bovino fetal (FBS) quando a cultura 3-D preliminar de salisphere for cultivada tipicamente em condições soro-livres^10,11. Além disso, os dois estudos prévios utilizando culturas do de glândulas salivares cultivou suas seções em 0% ou 10% FBS suplementados Media^19,20. As fatias submandibulares do camu.......

Discussão

A pesquisa da glândula salivar utilizou uma série de modelos de cultura, incluindo culturas 2-D imortalizadas, culturas 2-D primárias, culturas de salisphere 3-D e culturas de órgãos 3-D de explantes embrionários para averiguar questões sobre Biologia e fisiologia subjacentes. Esses modelos de cultura produziram informações perspicazes em uma variedade diversificada de perguntas de pesquisa e continuarão a ser ferramentas importantes na pesquisa salivar. As limitações desses modelos de cultura incluem a modulação da ativ.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Vibratomo VT1000S	Leica Biosystems	N/A	Vibratomo para seccionamento
lâminas de barbear de aço inoxidável de dupla borda	Microscopia eletrônica Sciences	72000
Agarose	Fisher Scientific	BP165-25	Parafilme de baixo ponto de fusão
	Sigma-Aldrich	P6543
Penicilina-estreptomicina-anfotericina B	Lonza	Placa de	PSA
	CellTreat	229124
Dulbecco' s Fosfato tampolado com solução salina (DPBS)	Gibco	14190-144
Loctite UltraGel Control Superglue	Loctite	N / A	Comprado na loja de ferragens
Natural Red Sable Round Paintbrush	Princeton Art & Brush Co	7400R-2
Sulfato de Gentamicina	Fisher Scientific	ICN1676045
Transferrina	Sigma-Aldrich	T-8158-100mg
L-glutamina	Gibco	25030-081
	Oligoelementos MP Biomedicals	ICN1676549
Insulina	Fisher Scientific	12585014
Fator de crescimento epidérmico	Corning	354001
hidrocortisona	Sigma-Aldrich	H0888
Ácido retinóico	Fisher Scientific	R2625-50MG
Soro bovino fetal	Gibco	A3160602
DMEM / F12 Mídia	Corning	150-90-CV
Inserção de cultura de células Millicell	Millipore Sigma	PICM01250	12 mm, tamanho de poro de 0,4 um para placa de 24 poços
0,4% Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	Thermo-Fisher	R37601	Usado apenas componente de corante VIVO
Anti-Ki-67 Anti-Ki-67	Tecnologia de Sinalização de Célula	9129S
Anti-E-caderina	Tecnologia de Sinalização de Célula	3195S
Anticorpo anti-clivado Caspase-3	Tecnologia de sinalização celular	9661L
Anticorpo anti-SMA	Anticorpo Sigma-Aldrich	C6198
Anticorpo anti-amilase	Sigma-Aldrich	A8273
Anticorpo	Abcam	ab28364
Anticorpo anti-TUBB3	Tecnologia de sinalização celular	5568S
Alexa Fluor 594 Anticorpo Kit de Rotulagem	Thermo-Fisher	A20185
Alexa Fluor 594 Faloidina	Thermo-Fisher	A12381
Albumina de Soro Bovino	Fisher Scientific	BP1600
Triton X-100	Sigma-Aldrich	21568-2500
Paraformaldeído Prills	Fisher Scientific	5027632
New England Agente de Bloqueio Nuclear	Perkin Elmer	2346249	Não é mais vendido
DAPI	Cell Signaling Technology	4083S
Prolong Gold Antifade Mounting Media	Invitrogen	P36934
Leica SPSII Spectral Confocal	Leica Biosystems	N/A	Para imagens confocais
Leica DMIL Microscópio de Contraste de Fase Invertida	Leica Biosystems	N/A
instrumento da teleterapia Cobalt-60	de Canadá Ltd Theratron-80	N/A
Caixa de Amac, cancela	molde do bloco do agarose	da loja	60140

de 24 poços 17-745H de Anticorpo de Anticorpo Energia atômica do o do recipiente