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Artigo de método

Tratamento de radiação de culturas organotypic de glândulas salivares submandibulares e parótidas modelos chave in vivo características

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DOI:

10.3791/59484

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17 de maio de 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Nutritional Sciences, University of Arizona, 2Cancer Biology Graduate Interdisciplinary Program, University of Arizona, 3Department of Chemical Engineering, University of Arizona

Neste artigo

Resumo

Usar culturas queratinócitos tridimensionais para visualizar a morfologia e os marcadores funcionais de glândulas salivares pode fornecer introspecções novas nos mecanismos de dano de tecido depois da radiação. Descrito aqui é um protocolo para secção, cultura, irradiar, mancha, e imagem 50 – 90 μm de espessura secções salivares antes e após a exposição à radiação ionizante.

Resumo

A hiposalivação e xerostomia criam complicações orais crônicas que diminuem a qualidade de vida em pacientes com câncer de cabeça e pescoço que são tratados com radioterapia. Abordagens experimentais para a compreensão de mecanismos de disfunção da glândula salivar e restauração têm focado em modelos in vivo, que são deficientes por uma incapacidade de sistematicamente tela candidatos terapêuticos e eficiências na transfecção capacidade de manipular genes específicos. A finalidade deste protocolo da cultura queratinócitos da glândula salivar é avaliar o tempo máximo da viabilidade da cultura e caracterizar mudanças celulares depois do tratamento de radiação ex vivo. Nós utilizamos a mancha imunofluorescente e a microscopia confocal para determinar quando as populações e os marcadores específicos da pilha estão atuais durante um período da cultura de 30 dias. Além disso, marcadores celulares previamente relatados em modelos de radiação in vivo são avaliados em culturas que são irradiadas ex vivo. Avançando, este método é uma plataforma atrativa para a avaliação ex vivo rápida de respostas murino e humanas do tecido da glândula salivar aos agentes terapêuticos que melhoram a função salivar.

Introdução

A função apropriada da glândula salivar é essencial à saúde oral e é alterada depois do tratamento do cancro da cabeça e da garganta com radioterapia1. Em 2017, quase 50.000 casos novos do cancro da cabeça e da garganta foram relatados nos Estados Unidos2. Devido aos efeitos tecido-prejudiciais e freqüentemente irreversíveis da terapia de radiação em tecidos normais circunvizinhos tais como as glândulas salivares, os pacientes são deixados frequentemente com efeitos secundários severos e a qualidade de vida diminuída2,3, a 4. Complicações comuns causadas por danos causados por radiação manifestam-se em sintomas como xerostomia (sensação subjetiva de boca seca), cárie dentária, capacidade prejudicada de mastigar e engolir, comprometimentos de fala e Ademir orais comprometidos2, 3. º , 4. estes sintomas coletivamente podem levar à desnutrição e à sobrevida prejudicada em indivíduos afetados5. Enquanto a disfunção da glândula salivar nesta população tem sido bem documentada, os mecanismos subjacentes de danos às células acinares têm sido disputados, e há pouca integração entre diferentes modelos animais6,7.

Os métodos atuais de estudar a função da glândula salivar e os danos radiação-induzidos incluem o uso de in vivo modela, linhas de pilha imortalized, culturas de pilha preliminares bidimensionais (2-D), e culturas tridimensionais (3-D) do salisphere8, 9,10,11,12. Tradicionalmente, os modelos de cultura celular de linhas celulares imortalizadas e culturas 2-D envolvem células únicas em camadas cultivadas em superfícies planas e são valiosas para uma experimentação rápida, fácil e econômica. No entanto, as condições de cultura de células artificiais podem alterar o status de diferenciação e as respostas fisiológicas das células expostas a várias condições, e os resultados muitas vezes não conseguem traduzir para modelos de organismos inteiros14,15. Além, as culturas de pilha imortalizado exigem a modulação da atividade p53, que é crítica para a resposta da glândula salivar aos danos do ADN16,17.

as culturas 3-D do salisphere são enriquecidas para pilhas da haste e do progenitor em pontos do tempo adiantado na cultura e têm sido úteis para compreender a radiosensibilidade deste subconjunto de pilhas da glândula salivar9,18. Uma limitação crítica de todos estes modelos da cultura é que são ineficazes em Visualizar a estrutura 3-D da glândula salivar, incluindo a matriz extracelular (ECM) e as interações da pilha-pilha sobre várias camadas, que são cruciais em modulando salivar secreção de15. A necessidade de um método que engloba o comportamento do tecido como um todo, mas também pode ser manipulado em condições laboratoriais para estudar os efeitos do tratamento é necessário para descobrir ainda mais os mecanismos subjacentes da glândula salivar induzida por radiação Disfunção.

O seccionamento e a cultura vivos do tecido foram documentados previamente19,20 e são usados frequentemente para estudar interações do cérebro-tecido21. Em estudos prévios, o tecido da glândula salivar do parotid (PAR) dos ratos foi seccionado em aproximadamente 50 μm e cultivado para até 48 h, e a análise da viabilidade, da morte de pilha, e da função foi executada Depois disso19. Su et al. (2016) expandiu-se sobre esta metodologia, cultivando glândulas submandibulares humanas (SMGs) seccionadas a 35 μm ou 50 μm por 14 dias20. O método proposto é um avanço em que inclui ambas as glândulas salivares parótidas e submandibulares seccionadas em 50 μm e 90 μm e avaliação das culturas por 30 dias. A habilidade de cortar uma escala da espessura do tecido é importante em avaliar as interações da pilha-pilha e do Cell-ECM que são relevantes para os processos celulares que incluem a polaridade apical-basolateral e a inervação para a secreção. Além disso, as fatias da glândula salivar foram irradiadas quando na cultura para determinar a viabilidade deste modelo da cultura para estudar dano radiação-induzido da glândula salivar.

A finalidade deste protocolo da cultura queratinócitos da glândula salivar é avaliar o tempo máximo da viabilidade da cultura e caracterizar mudanças celulares depois do tratamento de radiação ex vivo. Para determinar as seções do tempo máximo que são borne-dissecção viável, a mancha azul do Tripan, a mancha viva da pilha, e a mancha immunohistochemical para a morte da pilha foram executadas. Microscopia confocal e coloração imunofluorescente foram utilizadas para avaliar populações específicas de células, estruturas morfológicas e níveis de proliferação. As culturas da seção do tecido foram expostas igualmente à radiação ionizante para determinar os efeitos da radiação em vários marcadores neste modelo 3-D. A indução de morte celular, ruptura do citoesqueleto, perda de marcadores de diferenciação e proliferação compensatória em culturas ex vivo irradiadas foram comparadas com estudos prévios de modelos in vivo. Esta metodologia fornece um meio para investigar o papel das interações célula-célula após dano de radiação e fornece um modelo experimental para avaliar eficientemente a eficácia de intervenções terapêuticas (manipulações genéticas ou agentes farmacológicos ) que podem ser menos adequados para modelos in vivo.

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Protocolo

1. preparação do do

  1. Pulverize componentes destacáveis do do que inclui a bandeja do amortecedor, o acessório da lâmina, o molde do bloco do agarose, e a película do laboratório com etanol 70%, a seguir UV-sterilize por pelo menos 30 minutos.
  2. Coloc e prenda uma folha adicional de película do laboratório sobre a bandeja do amortecedor para impedir que o gelo caia dentro.
  3. Encha a câmara de gelo com gelo esmagado, retire a película do laboratório da bandeja do amortecedor, e encha a bandeja do amortecedor com 100 mL da solução salina tampão do fosfato do gelo-frio 1x (PBS) suplementada com a penicilina-estreptomicina-ampicilina de 1% (PSA).
  4. Coloque uma lâmina de barbear em aço inoxidável no suporte da lâmina. Use a chave de fenda para apertar/afrouxar e mudar o ângulo da lâmina.

2. preparação da amostra de tecido em bloco de agarose e seccionamento usando o do

  1. Autoclave todas as ferramentas de dissecção e corte necessárias, incluindo fórceps, tesouras e pincéis.
  2. Prepare 3% de baixo agarose ponto de fusão em estéril 1X PBS e microondas até que o agarose se dissolve em solução. Assegure-se de que a solução não ferva e gire a garrafa periodicamente para misturar.
    Nota: impeça o agarose da baixo-derretimento de solidificar mantendo o em um banho de água morno. O agarose do baixo-derretimento é fluido em 37 ° c e ajusta-se em 25 ° c. Entretanto, o banho de água deve estar abaixo de 40 ° c a fim derramar o agarose em torno do tecido na temperatura fisiológica.
  3. Isole as glândulas salivares e coloc o tecido dissecado em 2 mL gelo-frio 1X PBS suplementado com o PSA de 1% em um prato estéril, da cultura de 30 milímetros.
  4. Usando fórceps autoclavado, remova as glândulas salivares de 1X PBS + 1% PSA solução e posição na parte inferior de um molde de incorporação. Encha o molde com o agarose baixo do ponto de derretimento do líquido 3% para cobrir o tecido.
  5. Usando o fórceps, ajuste o tecido ao meio do bloco e posicione a glândula salivar no plano apropriado. As melhores secções transversais para as glândulas submandibulares e parótidas estão no plano vertical.
  6. Coloc o bloco do agarose no gelo por 10 minutos para endurecer.
  7. Execute com cuidado uma lâmina de barbear em torno da borda exterior do agarose para afrouxar e deixe o bloco deslizar para fora na película UV-sterilized do laboratório da etapa 1,1.
  8. Use uma lâmina de barbear para cortar uma caixa de agarose contendo a glândula salivar. Assegure-se de que o plano da seção é reto e paralelo ao lado oposto do bloco (a superfície que será colada para baixo). Desde que o agarose não se infiltra o tecido, não apare fora demasiado agarose em torno do tecido assim que o tecido será apoiado bem.
  9. Use a supercola para fixar o bloco na superfície de corte.
  10. Seção em 50 μm ou 90 μm de espessura por do a uma velocidade de 0, 75 mm/s e freqüência de 100 Hz.
    Nota: a definição do do na frequência mais alta e a velocidade mais baixa da lâmina proporcionam as fatias mais ideais.
  11. Colete seções em um 24-bem tecido cultura prato contendo ~ 1 mL gelo-frio PBS por bem usando um autoclavado, pincel de cabelo natural, colocando a escova em 70% etanol entre coleções fatia para manter a esterilidade.

3. seções de cultivo

  1. Autoclave uma microespátula e fórceps.
  2. Fazer estoque meios de cultura vibratoma com ou sem soro bovino fetal (FBS): DMEM/F12 mídia suplementada com 1% PSA,5 μg/mL transferrina, 1,1 μM de hidrocortisona, 0,1 μM de ácido retinóico, 5 μg/mL de insulina, 80 ng/mL fator de crescimento epidérmico, 5 mM L-glutamina, 50 μg sulfato de gentamicina e 10 μL/mL de mistura de oligoelementos. Adicione uma quantidade apropriada de FBS para fazer soluções de 0%, 2,5%, 5,0% ou 10%.
  3. Antes de seccionamento, adicione 300 μL de meios pré-aquecidos e coloque um diâmetro de 12 mm, uma pastilha de membrana de tamanho de poros de 0,4 μm em cada poço de uma placa de cultura de tecido de 24 poços. A mídia deve chegar à parte inferior da membrana para criar uma interface de ar líquido para a cultura.
  4. Coloque delicadamente as seções salivares sobre a inserção da membrana usando o micro espátula e a cultura em 37 ° c na incubadora humidificada da atmosfera de 5% co2 e 95% Air.
    1. Adicione aproximadamente 300 μL de meios de cultura primários no poço e algumas gotas nas pastilhas de membrana (aproximadamente 40 μL) a cada outro dia ou conforme necessário. A cultura adequada mostrou que as células são capazes de sobreviver e ser mantido por até 30 dias ex vivo.

4. irradiação das secções da glândula salivar

  1. Trate seções com uma única dose de radiação (5 GY) usando cobalto-60 (ou equivalente) irradiador.
    1. Seções do transporte à facilidade do irradiador usando um recipiente coberto do isopor para evitar flutuações na temperatura. Além, o cuidado precisa de ser tomado durante o transporte de volta à incubadora do laboratório para assegurar-se de que os meios não espirrem na tampa da cultura e induzem a contaminação.
    2. Coloque a placa de 24 poços contendo seções da glândula salivar 80 cm da fonte de radiação, no centro de um campo de radiação 32 "x 32". Os cálculos da dose de radiação e o tempo correspondente no irradiador variarão pelo instrumento e pela deterioração de Cobalt-60.
  2. Continue monitorando e cultivando essas seções conforme descrito na seção 3.

5. coloração da viabilidade

  1. Aspirar meios velhos e lavar fatias duas vezes com estéril, pre-aquecido 1X PBS.
  2. Seções da mancha com tintura azul do Tripan.
    1. Use uma microespátula para mover a fatia da cultura para um slide de vidro.
    2. Adicione 0,4% de solução azul de Tripan à fatia de vibratoma com volume suficiente para cobrir o tecido (10 – 20 μL).
    3. Incubar fatias em temperatura ambiente (RT) no azul de Tripan por 1 – 2 min para que o corante penetre no tecido. Células não viáveis serão manchadas de azul, e células viáveis serão desmanchadas.
  3. Seções da mancha com calcein, tintura da vivo-pilha do AM.
    1. Adicione volume suficiente de mancha para cobrir a seção em um poço de uma placa de 24 poços (200 – 300 μL).
    2. Incubar fatias em RT por 15 min para permitir a penetração da tintura.
    3. Retire cuidadosamente a secção do poço e coloque-a numa lâmina de vidro. Montar fatias com 1 gota de suportes de montagem.
    4. Seções da imagem em um microscópio fluorescente em comprimentos de onda da excitação/emissão de 488 nanômetro e de 515 nanômetro.

6. anticorpo que mancha seções do do

Nota: o seguinte fornece um anticorpo geral que mancha o protocolo específico para Ki-67; no entanto, este protocolo pode ser usado com qualquer anticorpo. Todas as lavas são conduzidas na RT, salvo indicação em contrário.

  1. No prato da cultura do tecido do multi-poço, aspirar fora dos meios e lavar pelo menos 2x com o PBS 1x estéril.
  2. Fixar secções com 4% de paraformaldeído (PFA) durante a noite a 4 ° c.
  3. Aspirar fora de 4% PFA e lavar 3x com PBT [1X PBS, 1% albumina sérica bovina (BSA), 0,1% Triton X-100].
    Nota: as secções podem ser armazenadas em 1X PBS a 4 ° c e manchadas num momento posterior. O tempo máximo de armazenamento testado neste manuscrito foi de 3 semanas. O tempo de armazenamento mais longo precisará ser otimizado pelo usuário individual, se isso for desejado.
  4. Seções de permeabilização usando 0,3% Triton X-100 em 1X PBS por 30 min.
    Nota: esta etapa pode ser modificada e otimizada para coloração e permeabilização de anticorpos específicos.
  5. Pipet fora da solução da permeabilização.
  6. Lave as fatias 3x por 5 min com 1X PBS, 1% BSA e 0,1% Triton X-100 (PBT).
  7. Bloqueie as fatias com o agente de bloqueio com 1% de soro de cabra normal por 1 h.
  8. Lave as fatias 3x por 5 min com PBT.
  9. Incubar as fatias durante a noite a 4 ° c com 500 μL de anticorpo monoclonal de coelho anti-67 diluído em 1% de BSA em 1X PBS.
    Nota: para a coloração de faloidina, pule a etapa 6,9 e prossiga usando o protocolo para o faloidina específico usado. Para a contratura do ADN, avance para o passo 6,15.
  10. Aspirar anti-67 anticorpo monoclonal de coelho.
  11. Lave as fatias de 6x por 5 min em 1X PBS.
  12. Incubar as fatias em 500 μL de anticorpo secundário conjugado fluorescentamente compatível com o anticorpo anti-67 diluído em 1% BSA em 1X PBS em RT por 1,5 h coberto de luz.
    Nota: com base no anticorpo secundário utilizado, o tempo de incubação com o anticorpo secundário pode ser optimizado pelo utilizador individual. Além disso, o anticorpo secundário é sensível à luz. Todas as lavas subsequentes devem ser executadas no escuro.
  13. Aspirar anticorpo secundário.
  14. Lave as fatias por 3x por 5 min com 1X PBS.
  15. Lave as fatias por 5 min em água desionizada.
  16. Fatias de contracoloração com DAPI (1μg/mL) por 20 min em RT.
  17. Lave as fatias (uma vez) durante 5 min em água desionizada.
  18. Montar fatias com uma gota (~ 40 μL) de suportes de montagem. Para evitar bolhas em excesso, coloque lentamente a lamínula na mídia de montagem no slide, começando com um ângulo de 45 °.
    1. Para evitar esmagar as secções grossas com a lamínula, monte cada fatia com um espaçador. Um espaçador pode ser criado coloc uma borda da graxa do vácuo em um quadrado em torno da seção do tecido.
    2. Ao colocar a lamínula, as bordas da lamínula podem ser seladas com graxa a vácuo. Pressione para baixo nas bordas da lamínula com o polegar para aderir firmemente a ele no slide. Alternativamente, sele a lamínula na corrediça do microscópio usando o lustrador de prego desobstruído.

7. seções do do da imagem latente

  1. Imagem as lâminas manchadas dentro de 5 dias de coloração.
  2. Obtenha seções ópticas das fatias do manchadas usando um microscópio confocal. Com um microscópio confocal, obtenha uma pilha z em um tamanho de etapa definido ou faça exame de imagens individuais dependendo do projeto experimental do usuário. As imagens podem ser examinadas em qualquer tela do computador após a coleta confocal.
    Nota: devido à espessura das fatias do do, recomenda-se que um microscópio confocal ou um espaço com capacidade da z-pilha esteja usado para visualizar detalhes dentro das amostras. Para as imagens utilizadas neste manuscrito, utilizou-se um objetivo de óleo de 63x; no entanto, isso pode ser adaptado e modificado pelo usuário individual e pelo escopo específico usado. A resolução de pixel recomendada para cada objetivo e fator de zoom com a amostragem de Nyquist presumido de 2,5 pixels em X e Y para a menor estrutura opticamente resolvível foi usada. No entanto, alguns comentaristas sugerem 2,3 pixels, enquanto outros sugerem 2,8 pixels. Refira por favor o manual da microscopia confocal biológica22 para mais detalhes em como fazer estes cálculos.

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Resultados

As culturas 2-D preliminares são crescidas em meios suplementados do soro bovino fetal (FBS) quando a cultura 3-D preliminar de salisphere for cultivada tipicamente em condições soro-livres10,11. Além disso, os dois estudos prévios utilizando culturas do de glândulas salivares cultivou suas seções em 0% ou 10% FBS suplementados Media19,20. As fatias submandibulares do camu...

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Discussão

A pesquisa da glândula salivar utilizou uma série de modelos de cultura, incluindo culturas 2-D imortalizadas, culturas 2-D primárias, culturas de salisphere 3-D e culturas de órgãos 3-D de explantes embrionários para averiguar questões sobre Biologia e fisiologia subjacentes. Esses modelos de cultura produziram informações perspicazes em uma variedade diversificada de perguntas de pesquisa e continuarão a ser ferramentas importantes na pesquisa salivar. As limitações desses modelos de cultura incluem a modulação da ativ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado em parte por financiamento-piloto fornecido pela Universidade do Arizona escritório de pesquisa e descoberta e institutos nacionais de saúde (R01 DE023534) para Kirsten Limesand. O treinamento de biologia do câncer Grant, T32CA009213, forneceu suporte para Wen Yu Wong. Os autores gostariam de agradecer a M. Rice por sua valiosa contribuição técnica.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Vibratomo VT1000SLeica BiosystemsN/AVibratomo para seccionamento
lâminas de barbear de aço inoxidável de dupla bordaMicroscopia eletrônica Sciences72000
AgaroseFisher ScientificBP165-25Parafilme de baixo ponto de fusão
Sigma-AldrichP6543
Penicilina-estreptomicina-anfotericina BLonzaPlaca dePSA
CellTreat229124
Dulbecco' s Fosfato tampolado com solução salina (DPBS)Gibco14190-144
Loctite UltraGel Control SuperglueLoctiteN / AComprado na loja de ferragens
Natural Red Sable Round PaintbrushPrinceton Art & Brush Co7400R-2
Sulfato de GentamicinaFisher ScientificICN1676045
TransferrinaSigma-AldrichT-8158-100mg
L-glutaminaGibco25030-081
Oligoelementos MP BiomedicalsICN1676549
InsulinaFisher Scientific12585014
Fator de crescimento epidérmicoCorning354001
hidrocortisonaSigma-AldrichH0888
Ácido retinóicoFisher ScientificR2625-50MG
Soro bovino fetalGibcoA3160602
DMEM / F12 MídiaCorning150-90-CV
Inserção de cultura de células MillicellMillipore SigmaPICM0125012 mm, tamanho de poro de 0,4 um para placa de 24 poços
0,4% Trypan BlueSigma-AldrichT8154
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)Thermo-FisherR37601Usado apenas componente de corante VIVO
Anti-Ki-67 Anti-Ki-67Tecnologia de Sinalização de Célula9129S
Anti-E-caderinaTecnologia de Sinalização de Célula3195S
Anticorpo anti-clivado Caspase-3Tecnologia de sinalização celular9661L
Anticorpo anti-SMAAnticorpo Sigma-AldrichC6198
Anticorpo anti-amilaseSigma-AldrichA8273
AnticorpoAbcamab28364
Anticorpo anti-TUBB3Tecnologia de sinalização celular5568S
Alexa Fluor 594 Anticorpo Kit de RotulagemThermo-FisherA20185
Alexa Fluor 594 FaloidinaThermo-FisherA12381
Albumina de Soro BovinoFisher ScientificBP1600
Triton X-100Sigma-Aldrich21568-2500
Paraformaldeído PrillsFisher Scientific5027632
New England Agente de Bloqueio NuclearPerkin Elmer2346249Não é mais vendido
DAPICell Signaling Technology4083S
Prolong Gold Antifade Mounting MediaInvitrogenP36934
Leica SPSII Spectral ConfocalLeica BiosystemsN/APara imagens confocais
Leica DMIL Microscópio de Contraste de Fase InvertidaLeica BiosystemsN/A
instrumento da teleterapia Cobalt-60de Canadá Ltd Theratron-80N/A
Caixa de Amac, cancelamolde do bloco do agaroseda loja60140
de 24 poços 17-745H de Anticorpo de Anticorpo Energia atômica do o do recipiente

Referências

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