Modelo de Xenoenxerto heterogêneo derivado do paciente do câncer pancreático usando larvas de zebrafish como hospedeiros para avaliação comparativa de fármacos

Resumo

Este protocolo descreve procedimentos da optimização em um modelo fluorescência-etiquetado duplo baseado em vírus do xenograft do tumor usando o zebrafish larval como anfitriões. Este modelo heterogêneo do xenograft imita a composição do tecido do microambiente pancreatic do cancro in vivo e sere como uma ferramenta mais precisa para avaliar respostas da droga em modelos personalizados de zPDX (xenograft paciente-derivado de zebrafish).

Resumo

O xenograft paciente-derivado do tumor (PDX) e o xenograft pilha-derivado do tumor (CDX) são técnicas importantes para a avaliação pré-clínica, a orientação da medicamentação e as pesquisas básicas do cancro. Gerações de modelos PDX em camundongos hospedeiros tradicionais são demoradas e só trabalham para uma pequena proporção de amostras. Recentemente, zebrafish PDX (zPDX) surgiu como um sistema de acolhimento único, com as características de pequena escala e de alta eficiência. Aqui, nós descrevemos uma metodologia aperfeiçoada para gerar um modelo fluorescência-etiquetado duplo do xenograft do tumor para a avaliação comparativa da quimioterapia em modelos de zPDX. As pilhas e os fibroblasto do tumor foram enriquecidos do tecido pancreatic recentemente-colhido ou congelado do cancro em condições diferentes da cultura. Ambos os grupos celulares foram rotulados por Lentivirus expressando proteínas fluorescentes verde ou vermelha, bem como um gene BCL2L1. As células transfectadas foram pré-misturadas e coinjetadas no zebrafish larval 2 DPF que foram então criados em meio E3 modificado a 32 ° c. Os modelos do xenograft foram tratados por drogas da quimioterapia e/ou pelo inibidor de BCL2L1, e as viabilidades de pilhas e de fibroblastos do tumor foram investigadas simultaneamente. Em resumo, este protocolo permite que os investigadores gerem rapidamente uma grande quantidade de modelos de zPDX com um microambiente heterogêneo do tumor e forneça uma janela mais longa da observação e uma quantitação mais precisa em avaliar a eficiência de candidatos da droga.

Introdução

A Oncologia de precisão tem como objetivo encontrar as estratégias terapêuticas mais benéficas para o paciente individual¹. Atualmente, inúmeros modelos pré-clínicos como a cultura primária in vitro, a cultura organoide in vitro²e os xenoenxertos derivados do paciente (PDX) em camundongos antes ou depois da cultura organoide são propostos para o diagnóstico e para a tela/avaliação do potencial escolhas terapêuticas³. O modelo PDX gerado pela injeção de células cancerosas primárias humanas em camundongos imunocomprometidos é uma das ferramentas mais promissoras para a triagem personalizada de fárma....

Protocolo

Todos os procedimentos animais foram aprovados e seguiram as diretrizes do Comitê de ética animal da Universidade de Fudan e todos os espécimes de câncer pancreático foram obtidos do centro de câncer de Xangai da Universidade de Fudan. A aprovação ética foi obtida do Comitê de ética da FUSCC, e o termo de consentimento livre e esclarecido foi obtido por cada paciente.

1. preparando o equipamento para a microinjeção

1. Preparando a placa de injeção.
   1. Prepare uma solução de 50 mL de agarose a 1% dissolvida na solução E3 (0,6 g/L de sal de aquário em água destilada dupla + 0, 1 mg/L de azul de metileno). Ferva....

Resultados

Um esboço esquematizado do procedimento é representado na Figura 1. No short, as pilhas preliminares do tecido do cancro foram semeadas no meio completo após a digestão com ou sem a adição de inibidores pancreatic do fibroblasto do cancro. As células cancerosas e os fibroblastos foram enriquecidos como duas populações distintas que os fibroblastos dominaram sem inibidores, e o crescimento das células cancerosas prevaleceu após a adição de inibidores (

Discussão

Ambos os modelos PDX e CDX são plataformas vitais no campo da biologia tumoral²², e o passo crítico de um transplante de sucesso entre espécies é melhorar a sobrevida do Xenoenxerto.  Recentemente, alguns estudos mostraram que a expressão transitória de BCL2L1 (BCL-XL) ou BCL2 pode melhorar significativamente a viabilidade de células-tronco embrionárias humanas em hospedeiros de camundongos sem afetar as identidades celulares e destinos^{23 ,}

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM	GIBCO	C11995500BT
FBS	Hyclone	sv30087.03
Y-27632	Cliniscience	Y0503	Inibidor de Rho quinase
Primocin	invivogen	ant-pm-1	um antibiótico para culturas de células primárias
Cloridrato de putrescina	Sigma	P5780
Nicotinamida	Sigma	N3376
Penicilina estreptomicina	GIBCO	15140122.00
Tampão fosfato (PBS)	GIBCO	C10010500CP
HBSS	GIBCO	14170112.00
Colagenase tipo IV	GIBCO	17104019.00
Hialuronidase	Sigma	H3884
Dnase I	Sigma	D5025
Insulina	Sigma	I9278
b-FGF	GIBCO	PHG0264
EGF	GIBCO	PHG0314
inibidor de fibroblastos de câncer de pâncreas	CHI Scientific	FibrOUT
0,45 μ m filtro estéril	Millipore	SLHV033RB
Coluna de concentração	Millipore	Millipore UFC910008	Concentre o vírus
Polybrene	Sigma	H9268
Ácido Hialurônico Sal de Sódio	Sigma	H7630
L-glutamina	GIBCO	21051024.00
Gemcitabina	Gemzan
Metilcelulose	Sigma	M0262
Navitoclax (ABT-263)	Selleck	S1001	Inibidor de Bcl-xL
Equipamento
Microinjetor	NARISHIGE
Estereomicroscópio	OLYMPUS	MVX10
Microscópio Confocal	LEICA	SP8	0,00