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Nanopartícula de ouro modificado microeletrodos de fibra de carbono para detecção neuroquímica reforçada

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DOI:

10.3791/59552

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13 de maio de 2019

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1Department of Chemistry, American University, 2Center for Behavioral Neuroscience, American University

Neste artigo

Resumo

Neste estudo, nós modificamos microeletrodos de fibra de carbono com nanopartículas de ouro para aumentar a sensibilidade da detecção de neurotransmissores.

Resumo

Por mais de 30 anos, microeletrodos de fibra de carbono (CFMEs) têm sido o padrão para a detecção de neurotransmissores. Geralmente, as fibras de carbono são aspiradas em capilares de vidro, puxado para um cone fino e, em seguida, selado usando um epóxi para criar materiais de eletrodo que são usados para o teste de voltametria cíclico de varredura rápida. O uso de CFMEs nua tem várias limitações, no entanto. Em primeiro lugar, a fibra de carbono contém principalmente o carbono plano basal, que tem uma área superficial relativamente baixa e produz sensibilidades inferiores aos outros nanomateriais. Além disso, o carbono grafítico é limitado por sua definição temporal, e por sua condutividade relativamente baixa. Por último, neuroquímicos e macromoléculas têm sido conhecidas por falta na superfície de eletrodos de carbono, onde formam polímeros não condutores que bloqueiam a adsorção do neurotransmissor. Para este estudo, modificamos CFMEs com nanopartículas de ouro para aprimorar o teste neuroquímico com voltametria cíclica de varredura rápida. Au3 + foi electrodepositado ou dipcoated de uma solução coloidal na superfície de cfmes. Desde que o ouro é um metal estável e relativamente inerte, é um material ideal do elétrodo para medidas analíticas dos neurochemicals. A nanopartícula do ouro modificada (AuNP-CFMEs) teve uma estabilidade à resposta do dopamine por mais de 4 h. Além disso, as AuNP-CFMEs exibem uma sensibilidade aumentada (maior pico de corrente oxidativa dos voltammogramas cíclicos) e uma cinética mais rápida de transferência de elétrons (menor ΔEP ou de pico de separação) do que os cfmes não modificados. O desenvolvimento de AuNP-CFMEs fornece a criação de novos sensores eletroquímicos para detectar mudanças rápidas na concentração de dopamina e outros neuroquímicos em limites inferiores de detecção. Este trabalho tem vastas aplicações para o aprimoramento de medições neuroquímicas. A geração de CFMEs modificados de nanopartículas de ouro será de vital importância para o desenvolvimento de novos sensores de eletrodos para detectar neurotransmissores in vivo em roedores e outros modelos para estudar os efeitos neuroquímicos do abuso de drogas, depressão, acidente vascular cerebral, isquemia, e outros Estados comportamentais e de doenças.

Introdução

Microeletrodos de fibra de carbono (CFMEs)1 são melhor utilizados como biossensores para detectar a oxidação de vários neurotransmissorescruciais 2, incluindo dopamina3, norepinefrina4, serotonina5, adenosina6, histamina7, e outros8. A biocompatibilidade e o tamanho das fibras de carbono os tornam ideais para a implantação, pois há dano tecidual atenuado comparado aos eletrodos padrão maiores. 9 cfmes são conhecidas por possuírem Propriedades eletroquímicas úteis e são capazes de fazer medições rápidas quando usadas com técnicas eletroquímicas rápidas, mais comumente a voltametria cíclica de rápida varredura (fscv)10,11. O fscv é uma técnica que verifica o potencial aplicado rapidamente e fornece um voltammograma cíclico específico para os analitos específicos12,13. A corrente de carregamento grande produzida pela exploração rápida é estável em fibras de carbono e pode ser fundo-subtraída para produzir voltammograms cíclicos específicos.

Devido à sua ótima eletroquímica e importância neurobiológica, a dopamina tem sido amplamente estudada. A dopamina da catecolamina é um mensageiro químico essencial que desempenha um papel crucial no controle do movimento, memória, cognição e emoção dentro do sistema nervoso. Um excedente ou deficiência de dopamina pode causar numerosas interferências neurológicas e psicológicas; entre estes são a doença de Parkinson, esquizofrenia, e comportamento viciante. Hoje, a doença de Parkinson continua a ser um distúrbio prevalente devido à degeneração dos neurônios do midbrain envolvidos na síntese de dopamina14. Os sintomas da doença de Parkinson incluem tremor, lentidão do movimento, rigidez e problemas na manutenção do equilíbrio. Por outro lado, estimulantes como a cocaína15 e a anfetamina16,17 promovem o excesso de dopamina. O abuso de drogas eventualmente substitui o fluxo regular de dopamina e condiciona o cérebro a exigir um excedente de dopamina, o que eventualmente leva a comportamentos viciantes.

Nos últimos anos, tem havido uma ênfase na melhoria da funcionalidade do eletrodo na detecção de neurotransmissores18. O método o mais generalizado de realçar a sensibilidade do elétrodo é revestindo a superfície da fibra. Surpreendentemente, tem havido uma pesquisa limitada feita sobre a eletrodeposição de nanopartículas metálicas sobre fibras de carbono19. O metal nobre-nanopartículas tais como o ouro, pode ser electrodepositado na superfície da fibra com outros materiais funcionais20. Por exemplo, aumentar a área de superfície eletroativa para a adsorção do neurotransmissor ocorra. As nanopartículas de metal electrodepositadas formam rapidamente, podem ser purificadas e aderir à fibra de carbono. A eletroquímica continua a ser significativa tanto para a deposição de nanopartículas de metais nobres quanto para o aprimoramento superficial das fibras de carbono, pois permite o controle da nucleação e do crescimento dessas nanopartículas. Finalmente, as características catalíticas e condutoras aumentadas, e o transporte de massa melhorado estão entre outras vantagens de utilizar nanopartículas do metal para a electroanálise.

O curso avançado da seqüência do laboratório da Universidade Americana (Chemistry biológico experimental I e II CHEM 471/671-472/672) é uma combinação de laboratórios analíticos, físicos, e da bioquímica. O primeiro semestre é uma visão geral das técnicas laboratoriais. O segundo semestre é um projeto de pesquisa conduzido pelo aluno e conduzido21. Para estes projetos, os estudantes examinaram previamente o mecanismo da biomolécula, da proteína, do peptide, e do amino-ácido-síntese facilitada de nanopartículas do ouro22,23. Trabalho mais recente tem focado na formação de nanopartículas de ouro (AuNP) produção em superfícies de eletrodos e a avaliação de efeitos AuNPs sobre a capacidade de CFMEs para detectar neurotransmissores. No presente trabalho, o laboratório aplicou esta técnica para demonstrar que a sensibilidade dos CFMEs na detecção da dopamina-oxidação é reforçada através da eletrodeposição de AuNP na superfície da fibra. Cada Bare-CFME é caracterizada pela variação da taxa de varredura, estabilidade e concentração de dopamina ao detectar correntes dopamina-oxidativas para medir a oxidação da dopamina na superfície do CFME. Au3 + foi então electroreduced para au0 e simultaneamente electrodepositado sobre a superfície da fibra como nanopartículas, seguido por uma série de experimentos de caracterização. Após uma comparação direta, os AuNP-CFMEs foram encontrados para possuir uma sensibilidade mais elevada da deteção do dopamine. O revestimento uniforme de aunp na superfície da fibra através do electrodeposição rende uma área de superfície eletroativa mais elevada; assim, aumentando a adsorção de dopamina na superfície modificada do eletrodo. Isso levou a maior dopamina correntes oxidativas. A separação potencial dos picos de oxidação e redução da dopamina (∆ Ep) de aunp-cfmes também foi menor, sugerindo uma cinética mais rápida de transferência de elétrons. Trabalhos futuros deste estudo incluem o teste in vivo de ambos os Bare-e AuNP-CFMEs para a detecção de dopamina.

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Protocolo

1. construção de microeletrodos de fibra de carbono

  1. Preparação de fibras de carbono
    1. Para criar microeletrodos de fibra de carbono, primeiro separe as fibras de carbono (fibra de carbono, 7 mm de diâmetro) uma a uma usando as mãos, luvas e espátula.
    2. Puxar ou arrancar uma fibra do fio trançado.
    3. Aspirar uma fibra de carbono isolada em um capilar de vidro (vidro capilar de borosilicato de barril único sem Microfilamento, 1,2 mm de diâmetro externo, 0,68 mm de diâmetro interno).
    4. Criar um suporte de eletrodo para os eletrodos cortando um pedaço de papelão que tem aproximadamente 10 cm de comprimento por 25 cm de largura.
  2. Puxe os eletrodos usando um puxador capilar vertical.
  3. Abra a porta deslizante do puxador capilar vertical.
  4. Afrouxe e retire a haste metálica do suporte, girando a broca-Mandril no sentido anti-horário com bastante espaço para introduzir o capilar de vidro.
  5. Insira o capilar de vidro no suporte do eletrodo. Levante o capilar de vidro à parte superior do capilar vertical manualmente à mão.
  6. Aperte o capilar de vidro com a broca-mandris no sentido horário sem quebrar ou quebrar os capilares de vidro.
  7. Ajuste os ajustes do calefator 1, do calefator 2, e do ímã ao fabricante sugeriram níveis para puxar capilares de vidro a um atarraxamento fino para materiais do elétrodo.
  8. Pressione a tecla vermelha do começo para aquecer a bobina bobinada para puxar os elétrodos através da pressão, da gravidade, e do aquecimento.
  9. Deixe a bobina enrolada esfriar de seu estado vermelho quente. Corte a fibra de carbono com tesouras que conectam os dois eletrodos puxados de cima para baixo. Use o método da broca-Mandril para remover o capilar de vidro do extrator capilar vertical girando no sentido anti-horário.

2. preparação do Microelétrodo da carbono-fibra

  1. um estereoscópio ou microscópio, corte a fibra de carbono salientes a partir da superfície do capilar de vidro com tesouras cirúrgicas ou uma lâmina de barbear afiada para aproximadamente 100 – 150 μm de comprimento.
  2. Prepare uma solução de epóxi misturando 10 g de epóxi com 0,2 mL de endurecedor em um frasco de 25 mL usando um cotonete.
  3. Mergulhe apenas a ponta de cada eletrodo na solução de epóxi e endurecedor por aproximadamente 15 s.
  4. Mergulhe o topo acima mencionado do microeletrodo de fibra de carbono em acetona por aproximadamente 3 s para lavar qualquer excesso de epóxi do barril do microeletrodo de fibra de carbono.

3. electrodeposição

  1. Coloque o eletrodo de trabalho (microeletrodo de fibra de carbono) na solução de 0,5 mM HAuCl4 além do eletrodo de referência, cloreto de prata-prata (Ag/AgCl) usando o micromanipulador.
  2. Conecte o eletrodo de trabalho e o eletrodo de referência ao potenciostat e ao headstage.
  3. Abra o software UNC HDCV. Altere as configurações do software para aplicar a forma de onda. Digite a seguinte forma de onda nas configurações do computador: digitalizar de 0,2 V para − 1,0 V em 0,1 M solução KCl contendo 0,5 mM HAuCl4 a uma taxa de digitalização de 50 MV/s para 10 ciclos. Pressione a seta verde para aplicar a forma de onda. Em seguida, pressione o botão Iniciar para iniciar a gravação das medições.

4. microscopia eletrônica de varredura

Nota: microeletrodos de fibra de carbono modificados com nanopartículas de imagem e ouro, utilizando instrumento de microscopia eletrônica de varredura (SEM). Coloque a amostra na fita condutora preta e seguindo as instruções descritas pelo fabricante.

  1. Ligar o aparelho
    1. Gire a chave para iniciar e solte.
    2. Abra o software InTouchScope clicando duas vezes nele.
    3. Solte a chave. Ele deve pousar no símbolo I por conta própria.
    4. Aguarde até que o botão EVAC pare de piscar.
    5. Uma vez que o botão EVAC pare de piscar, pressione o botão VENT.
    6. Aguarde até que o botão VENT pare de piscar.
    7. Assegure-se de que a distância de trabalho (WD) esteja em 20 milímetros-30 milímetros.
    8. Enquanto aguarda, prepare a (s) amostra (ões).
  2. Digitalização
    1. Uma vez que o botão VENT pare de piscar, carregue a amostra (s) no instrumento.
    2. Assegure-se de que a parte curvada do suporte da amostra esteja apontada para o instrumento ao carregar a amostra (s).
    3. Pressione o botão EVAC uma vez que a amostra (s) é carregada.
    4. Ajustar a distância de trabalho para 10 mm.
    5. Quando o botão EVAC parar de piscar, ligue o computador.
    6. Clique no software in Touch Scope, localizado na área de trabalho. Existem dois in Touch Scope software, clique em um sem o círculo verde e amarelo.
    7. Uma vez que o software se abre, clique em observar (canto superior direito da tela), para ligar a viga. Certifique-se de que o botão EVAC parou de piscar antes de clicar em observar.
    8. Comece a analisar a (s) amostra (ões).
    9. Assegure-se de que a tensão, a distância de trabalho (WD) e as configurações atuais da sonda (PC) sejam aceitáveis.
    10. Diminua o zoom (~ 50X) para uma configuração mais alta e aumente o zoom para uma configuração mais baixa.
    11. Ajuste a distância de trabalho em 10 milímetros.
    12. Antes de tirar uma foto da amostra (s), certifique-se de que a imagem será salva na pasta de destino desejada.
    13. Para escolher a pasta desejada, clique nas configurações (canto superior esquerdo da tela).
    14. Exporte as imagens do computador através de uma pen drive.
  3. Desligar
    1. Clique em observar para desligar a viga.
    2. Pressione o botão VENT e aguarde que ele pare de piscar.
    3. Enquanto aguarda o botão VENT parar de piscar, ajuste a distância de trabalho de volta para 20 mm – 30 mm.
    4. Uma vez que o botão VENT pare de piscar, descarregue a amostra (s) do instrumento.
    5. Pressione o botão EVAC e aguarde que ele pare de piscar.
    6. Uma vez que o botão EVAC pare de piscar, saia do software e desligue o computador.
    7. Gire a chave para o símbolo o para desligar completamente o instrumento.

5. teste rápido da voltametria cíclica da varredura

  1. Conecte o microeletrodo de fibra de carbono ao potenciostat e headstage junto com o eletrodo de referência Ag/AgCl.
  2. Usando o micromanipulador, abaixe o microelétrodo da fibra do carbono na pilha de fluxo bem ajustando manualmente os botões da medida de X, de Y, e de Z.
  3. Prepare solução tampão em água DI (131,5 mM NaCl, 3,25 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 1,25 mm NaH2po4, 1,2 mM MgCl2e 2,0 mm na2so4 com o pH ajustado para 7,4).
  4. Encha a célula de fluxo com tampão salina tamponado com fosfato (PBS) (pH = 7,4).
  5. Usando uma seringa de tampão de 60 mL preenchida, injete o tampão PBS na célula de fluxo em aproximadamente 1 mL/min.
  6. Coloque o eletrodo na célula de fluxo e aplique a forma de onda pressionando o botão verde. Observe o osciloscópio e corte o eletrodo ou ajuste o ganho para evitar o sobrecarregamento. Permita aproximadamente 10 minutos de equilíbrio entre cada funcionamento do elétrodo.
  7. Defina a forma de onda padrão para a forma de onda de dopamina. Digitalizar de – 0,4 V a 1,3 V a 10 Hz e 400 V/s.
  8. Prepare a solução de estoque de 10 mM de dopamina, serotonina, norepinefrina, e outros em ácido perclórico. Diluir os neuroquímicos para a concentração final de 1 μM em tampão, pipetando 1 μM da solução de dopamina em 10 mL de tampão PBS utilizando uma pipeta.
  9. Para iniciar as medições, pressione o botão de gravação. Após 10 s, injete 0,2 mL de 1 μM de dopamina na célula de fluxo ou qualquer outra concentração de neurotransmissor. Ajuste a concentração, taxa de digitalização, forma de onda (potencial de retenção ou potencial de comutação) em conformidade. Defina o tempo total de execução para 30 s.
  10. Analise a execução usando o software de análise HDCV. Altere os parâmetros conforme necessário.
  11. Depois que o experimento estiver completo, limpe a célula de fluxo injetando 3 mL de água e, em seguida, o ar no buffer e as portas de injeção da célula de fluxo três vezes cada.
  12. Desligue a forma de onda e o instrumento.

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Resultados

Para a Figura 1, mostramos um esquema onde o teste de FSCV é utilizado para medir a concentração de neurotransmissores in vitro. A Figura 1 exibe a forma de onda de dopamina aplicada. A forma de onda do triângulo faz a varredura de-0,4 V a 1,3 V em 400 V/s. Na segunda parte da figura à esquerda, ele exibe a oxidação da dopamina para dopamina-orto-quinona (DOQ), um processo de transferência de dois elétrons ocorre a partir da supe...

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Discussão

Neste estudo, demonstramos um novo método para a construção de microeletrodos de fibra de carbono modificados com nanopartículas de ouro para a detecção de neurotransmissores como a dopamina usando voltametria cíclica de varredura rápida. O método é uma abordagem eficiente, verde e relativamente barata para melhorar a sensibilidade da detecção de biomoléculas. A espessura do ouro depositada na superfície da fibra de carbono pode ser controlada pelo tempo de eletrodeposição e a concentração de ouro presente na solução de ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer à universidade americana, à bolsa de apoio à pesquisa do corpo docente, à NASA DC Space Grant e à NSF-MRI # 1625977.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cloridrato de dopaminaSigma AldrichH8502-5G
Tamponado com fosfato SalinoSigma AldrichP5493-1L
Pine WaveNeuro PotenciostatoPine InstrumentsNEC-WN-BASICEste pedido vem em massa com todos os outros acessórios, como headstages, adaptadores, cabos e outros eletrônicos
Célula de Fluxo de Pinho e MicromanipuladorInstrumentos de PinhoNEC-FLOW-1Este também é outro pedido em massa, incluindo o micromanipulador, célula de fluxo, botões, tubos, conectores, etc.
Sistemas de Fibra de Carbono Glass-CapillaryA-M Systems602500
T-650GoodfellowC 005711
Epon 828 EpoxyMiller-StephensonEPON 828 TDS
DiethelynetriamineSigmaAldrich D93856-5ML
Cloreto de ouro (III)Sigma Aldrich254169Vem como medidor de pH HAuCl4 ou AuCl3
FisherS90528
Farraday CageAMETEK TMC81-334-03
Bomba de SeringaNEW ERA PUMPNE-1000
Eppendorf Pipetas e PonteirasEppendorf2231000222Este também é um pedido em massa contendo várias pipetas e ponteiras
Copos de 10 -1.000 mLVWR10536-390
Fibra de carbonoGoodfellowC 005711
SEMJEOLJSM-IT100

Referências

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