Nanopartícula de ouro modificado microeletrodos de fibra de carbono para detecção neuroquímica reforçada

Microeletrodos de fibra de carbono (CFMEs)¹ são melhor utilizados como biossensores para detectar a oxidação de vários neurotransmissores^{cruciais 2}, incluindo dopamina³, norepinefrina⁴, serotonina⁵, adenosina⁶, histamina⁷, e outros⁸. A biocompatibilidade e o tamanho das fibras de carbono os tornam ideais para a implantação, pois há dano tecidual atenuado comparado aos eletrodos padrão maiores. ⁹ cfmes são conhecidas por possuírem Propriedades eletroquímicas úteis e são capazes de fazer medições rápidas quando usadas com técnicas eletroquímicas rápidas, mais comumente a voltametria cíclica de rápida varredura (fscv)^10,11. O fscv é uma técnica que verifica o potencial aplicado rapidamente e fornece um voltammograma cíclico específico para os analitos específicos^12,13. A corrente de carregamento grande produzida pela exploração rápida é estável em fibras de carbono e pode ser fundo-subtraída para produzir voltammograms cíclicos específicos.

Devido à sua ótima eletroquímica e importância neurobiológica, a dopamina tem sido amplamente estudada. A dopamina da catecolamina é um mensageiro químico essencial que desempenha um papel crucial no controle do movimento, memória, cognição e emoção dentro do sistema nervoso. Um excedente ou deficiência de dopamina pode causar numerosas interferências neurológicas e psicológicas; entre estes são a doença de Parkinson, esquizofrenia, e comportamento viciante. Hoje, a doença de Parkinson continua a ser um distúrbio prevalente devido à degeneração dos neurônios do midbrain envolvidos na síntese de dopamina¹⁴. Os sintomas da doença de Parkinson incluem tremor, lentidão do movimento, rigidez e problemas na manutenção do equilíbrio. Por outro lado, estimulantes como a cocaína¹⁵ e a anfetamina^16,17 promovem o excesso de dopamina. O abuso de drogas eventualmente substitui o fluxo regular de dopamina e condiciona o cérebro a exigir um excedente de dopamina, o que eventualmente leva a comportamentos viciantes.

Nos últimos anos, tem havido uma ênfase na melhoria da funcionalidade do eletrodo na detecção de neurotransmissores¹⁸. O método o mais generalizado de realçar a sensibilidade do elétrodo é revestindo a superfície da fibra. Surpreendentemente, tem havido uma pesquisa limitada feita sobre a eletrodeposição de nanopartículas metálicas sobre fibras de carbono¹⁹. O metal nobre-nanopartículas tais como o ouro, pode ser electrodepositado na superfície da fibra com outros materiais funcionais²⁰. Por exemplo, aumentar a área de superfície eletroativa para a adsorção do neurotransmissor ocorra. As nanopartículas de metal electrodepositadas formam rapidamente, podem ser purificadas e aderir à fibra de carbono. A eletroquímica continua a ser significativa tanto para a deposição de nanopartículas de metais nobres quanto para o aprimoramento superficial das fibras de carbono, pois permite o controle da nucleação e do crescimento dessas nanopartículas. Finalmente, as características catalíticas e condutoras aumentadas, e o transporte de massa melhorado estão entre outras vantagens de utilizar nanopartículas do metal para a electroanálise.

O curso avançado da seqüência do laboratório da Universidade Americana (Chemistry biológico experimental I e II CHEM 471/671-472/672) é uma combinação de laboratórios analíticos, físicos, e da bioquímica. O primeiro semestre é uma visão geral das técnicas laboratoriais. O segundo semestre é um projeto de pesquisa conduzido pelo aluno e conduzido²¹. Para estes projetos, os estudantes examinaram previamente o mecanismo da biomolécula, da proteína, do peptide, e do amino-ácido-síntese facilitada de nanopartículas do ouro^22,23. Trabalho mais recente tem focado na formação de nanopartículas de ouro (AuNP) produção em superfícies de eletrodos e a avaliação de efeitos AuNPs sobre a capacidade de CFMEs para detectar neurotransmissores. No presente trabalho, o laboratório aplicou esta técnica para demonstrar que a sensibilidade dos CFMEs na detecção da dopamina-oxidação é reforçada através da eletrodeposição de AuNP na superfície da fibra. Cada Bare-CFME é caracterizada pela variação da taxa de varredura, estabilidade e concentração de dopamina ao detectar correntes dopamina-oxidativas para medir a oxidação da dopamina na superfície do CFME. Au^{3 +} foi então electroreduced para au⁰ e simultaneamente electrodepositado sobre a superfície da fibra como nanopartículas, seguido por uma série de experimentos de caracterização. Após uma comparação direta, os AuNP-CFMEs foram encontrados para possuir uma sensibilidade mais elevada da deteção do dopamine. O revestimento uniforme de aunp na superfície da fibra através do electrodeposição rende uma área de superfície eletroativa mais elevada; assim, aumentando a adsorção de dopamina na superfície modificada do eletrodo. Isso levou a maior dopamina correntes oxidativas. A separação potencial dos picos de oxidação e redução da dopamina (∆ E_p) de aunp-cfmes também foi menor, sugerindo uma cinética mais rápida de transferência de elétrons. Trabalhos futuros deste estudo incluem o teste in vivo de ambos os Bare-e AuNP-CFMEs para a detecção de dopamina.

1. construção de microeletrodos de fibra de carbono

1. Preparação de fibras de carbono
   1. Para criar microeletrodos de fibra de carbono, primeiro separe as fibras de carbono (fibra de carbono, 7 mm de diâmetro) uma a uma usando as mãos, luvas e espátula.
   2. Puxar ou arrancar uma fibra do fio trançado.
   3. Aspirar uma fibra de carbono isolada em um capilar de vidro (vidro capilar de borosilicato de barril único sem Microfilamento, 1,2 mm de diâmetro externo, 0,68 mm de diâmetro interno).
   4. Criar um suporte de eletrodo para os eletrodos cortando um pedaço de papelão que tem aproximadamente 10 cm de comprimento por 25 cm de largura.
2. Puxe os eletrodos usando um puxador capilar vertical.
3. Abra a porta deslizante do puxador capilar vertical.
4. Afrouxe e retire a haste metálica do suporte, girando a broca-Mandril no sentido anti-horário com bastante espaço para introduzir o capilar de vidro.
5. Insira o capilar de vidro no suporte do eletrodo. Levante o capilar de vidro à parte superior do capilar vertical manualmente à mão.
6. Aperte o capilar de vidro com a broca-mandris no sentido horário sem quebrar ou quebrar os capilares de vidro.
7. Ajuste os ajustes do calefator 1, do calefator 2, e do ímã ao fabricante sugeriram níveis para puxar capilares de vidro a um atarraxamento fino para materiais do elétrodo.
8. Pressione a tecla vermelha do começo para aquecer a bobina bobinada para puxar os elétrodos através da pressão, da gravidade, e do aquecimento.
9. Deixe a bobina enrolada esfriar de seu estado vermelho quente. Corte a fibra de carbono com tesouras que conectam os dois eletrodos puxados de cima para baixo. Use o método da broca-Mandril para remover o capilar de vidro do extrator capilar vertical girando no sentido anti-horário.

2. preparação do Microelétrodo da carbono-fibra

1. um estereoscópio ou microscópio, corte a fibra de carbono salientes a partir da superfície do capilar de vidro com tesouras cirúrgicas ou uma lâmina de barbear afiada para aproximadamente 100 – 150 μm de comprimento.
2. Prepare uma solução de epóxi misturando 10 g de epóxi com 0,2 mL de endurecedor em um frasco de 25 mL usando um cotonete.
3. Mergulhe apenas a ponta de cada eletrodo na solução de epóxi e endurecedor por aproximadamente 15 s.
4. Mergulhe o topo acima mencionado do microeletrodo de fibra de carbono em acetona por aproximadamente 3 s para lavar qualquer excesso de epóxi do barril do microeletrodo de fibra de carbono.

3. electrodeposição

1. Coloque o eletrodo de trabalho (microeletrodo de fibra de carbono) na solução de 0,5 mM HAuCl₄ além do eletrodo de referência, cloreto de prata-prata (Ag/AgCl) usando o micromanipulador.
2. Conecte o eletrodo de trabalho e o eletrodo de referência ao potenciostat e ao headstage.
3. Abra o software UNC HDCV. Altere as configurações do software para aplicar a forma de onda. Digite a seguinte forma de onda nas configurações do computador: digitalizar de 0,2 V para − 1,0 V em 0,1 M solução KCl contendo 0,5 mM HAuCl₄ a uma taxa de digitalização de 50 MV/s para 10 ciclos. Pressione a seta verde para aplicar a forma de onda. Em seguida, pressione o botão Iniciar para iniciar a gravação das medições.

4. microscopia eletrônica de varredura

Nota: microeletrodos de fibra de carbono modificados com nanopartículas de imagem e ouro, utilizando instrumento de microscopia eletrônica de varredura (SEM). Coloque a amostra na fita condutora preta e seguindo as instruções descritas pelo fabricante.

1. Ligar o aparelho
   1. Gire a chave para iniciar e solte.
   2. Abra o software InTouchScope clicando duas vezes nele.
   3. Solte a chave. Ele deve pousar no símbolo I por conta própria.
   4. Aguarde até que o botão EVAC pare de piscar.
   5. Uma vez que o botão EVAC pare de piscar, pressione o botão VENT.
   6. Aguarde até que o botão VENT pare de piscar.
   7. Assegure-se de que a distância de trabalho (WD) esteja em 20 milímetros-30 milímetros.
   8. Enquanto aguarda, prepare a (s) amostra (ões).
2. Digitalização
   1. Uma vez que o botão VENT pare de piscar, carregue a amostra (s) no instrumento.
   2. Assegure-se de que a parte curvada do suporte da amostra esteja apontada para o instrumento ao carregar a amostra (s).
   3. Pressione o botão EVAC uma vez que a amostra (s) é carregada.
   4. Ajustar a distância de trabalho para 10 mm.
   5. Quando o botão EVAC parar de piscar, ligue o computador.
   6. Clique no software in Touch Scope, localizado na área de trabalho. Existem dois in Touch Scope software, clique em um sem o círculo verde e amarelo.
   7. Uma vez que o software se abre, clique em observar (canto superior direito da tela), para ligar a viga. Certifique-se de que o botão EVAC parou de piscar antes de clicar em observar.
   8. Comece a analisar a (s) amostra (ões).
   9. Assegure-se de que a tensão, a distância de trabalho (WD) e as configurações atuais da sonda (PC) sejam aceitáveis.
   10. Diminua o zoom (~ 50X) para uma configuração mais alta e aumente o zoom para uma configuração mais baixa.
   11. Ajuste a distância de trabalho em 10 milímetros.
   12. Antes de tirar uma foto da amostra (s), certifique-se de que a imagem será salva na pasta de destino desejada.
   13. Para escolher a pasta desejada, clique nas configurações (canto superior esquerdo da tela).
   14. Exporte as imagens do computador através de uma pen drive.
3. Desligar
   1. Clique em observar para desligar a viga.
   2. Pressione o botão VENT e aguarde que ele pare de piscar.
   3. Enquanto aguarda o botão VENT parar de piscar, ajuste a distância de trabalho de volta para 20 mm – 30 mm.
   4. Uma vez que o botão VENT pare de piscar, descarregue a amostra (s) do instrumento.
   5. Pressione o botão EVAC e aguarde que ele pare de piscar.
   6. Uma vez que o botão EVAC pare de piscar, saia do software e desligue o computador.
   7. Gire a chave para o símbolo o para desligar completamente o instrumento.

5. teste rápido da voltametria cíclica da varredura

1. Conecte o microeletrodo de fibra de carbono ao potenciostat e headstage junto com o eletrodo de referência Ag/AgCl.
2. Usando o micromanipulador, abaixe o microelétrodo da fibra do carbono na pilha de fluxo bem ajustando manualmente os botões da medida de X, de Y, e de Z.
3. Prepare solução tampão em água DI (131,5 mM NaCl, 3,25 mM KCl, 1,2 mM CaCl₂, 1,25 mm NaH₂po₄, 1,2 mM MgCl₂e 2,0 mm na₂so₄ com o pH ajustado para 7,4).
4. Encha a célula de fluxo com tampão salina tamponado com fosfato (PBS) (pH = 7,4).
5. Usando uma seringa de tampão de 60 mL preenchida, injete o tampão PBS na célula de fluxo em aproximadamente 1 mL/min.
6. Coloque o eletrodo na célula de fluxo e aplique a forma de onda pressionando o botão verde. Observe o osciloscópio e corte o eletrodo ou ajuste o ganho para evitar o sobrecarregamento. Permita aproximadamente 10 minutos de equilíbrio entre cada funcionamento do elétrodo.
7. Defina a forma de onda padrão para a forma de onda de dopamina. Digitalizar de – 0,4 V a 1,3 V a 10 Hz e 400 V/s.
8. Prepare a solução de estoque de 10 mM de dopamina, serotonina, norepinefrina, e outros em ácido perclórico. Diluir os neuroquímicos para a concentração final de 1 μM em tampão, pipetando 1 μM da solução de dopamina em 10 mL de tampão PBS utilizando uma pipeta.
9. Para iniciar as medições, pressione o botão de gravação. Após 10 s, injete 0,2 mL de 1 μM de dopamina na célula de fluxo ou qualquer outra concentração de neurotransmissor. Ajuste a concentração, taxa de digitalização, forma de onda (potencial de retenção ou potencial de comutação) em conformidade. Defina o tempo total de execução para 30 s.
10. Analise a execução usando o software de análise HDCV. Altere os parâmetros conforme necessário.
11. Depois que o experimento estiver completo, limpe a célula de fluxo injetando 3 mL de água e, em seguida, o ar no buffer e as portas de injeção da célula de fluxo três vezes cada.
12. Desligue a forma de onda e o instrumento.

Para a Figura 1, mostramos um esquema onde o teste de FSCV é utilizado para medir a concentração de neurotransmissores in vitro. A Figura 1 exibe a forma de onda de dopamina aplicada. A forma de onda do triângulo faz a varredura de-0,4 V a 1,3 V em 400 V/s. Na segunda parte da figura à esquerda, ele exibe a oxidação da dopamina para dopamina-orto-quinona (DOQ), um processo de transferência de dois elétrons ocorre a partir da superfície do analito para a superfície do eletrodo. Por fim, uma trama atual versus tempo é sobreposta com um gráfico de cores. A trama atual vs. tempo é uma representação da oxidação da dopamina. É plana quando não há oxidação de dopamina, e sobe verticalmente quando a dopamina é oxidada à dopamina-ortoquinona e reduzida de volta para a dopamina como o analito adsorvem, e subsequentemente, desorbs da superfície do eletrodo. O gráfico de cores é um gráfico de 3 dimensões da corrente. A corrente amarela é a corrente de fundo (perto de zero), enquanto a trama verde é a corrente de oxidação positiva (oxidação de dopamina para dopamina orthoquinone), e o enredo azul é a corrente de redução negativa (dopamina orthoquinone redução de dopamina).

O SEM foi utilizado para características de superfície da imagem dos elétrodos desencapados e modificados do carbono. Na Figura 2, vemos diferença única em características de superfície entre três tipos diferentes de materiais de eletrodo. Na Figura 2a, um microeletrodo de fibra de carbono nua é mostrado. A fibra é de aproximadamente 7 μm de diâmetro com cumes cilíndricos ao longo do exterior. A Figura 2b mostra nanopartículas de ouro eletrodepositadas na superfície da fibra de carbono por aproximadamente 20 min com grande cume afiado de ouro salientes da superfície da fibra de carbono. A presença de ouro foi verificada com medidas de EDS/EDX. Em seguida, reduzimos o tempo de eletrodeposição para 5 min, onde observamos um fino revestimento de ouro uniforme, como mostrado na Figura 2C.

Comparação de sensibilidade e transferência de elétrons

A Figura 3a mostra uma comparação entre a sensibilidade e a transferência eletrônica. Como mostrado com os voltammograms cíclicos de sobreposição, os microeletrodos ouro-modificados da fibra do carbono têm correntes oxidativas máximas significativamente mais elevadas (Figura 3B) e uma cinética mais rápida da transferência de elétron (ΔEP). A significância foi mensurada com teste t não pareado (P = .004 e. 0,016, respectivamente). As barras de erro são erro padrão da média.

Estabilidade

Os cfmes desnudos (figura 4a) e nanopartícula de ouro modificados (Figura 4B) foram colocados na célula de fluxo por 4 h. medidas foram tomadas para a detecção de 1 μm de dopamina a cada hora mais de 4 h. Ambos os eletrodos tiveram uma resposta estável em relação à dopamina. Uma resposta estável à dopamina (sem oxidação da água) é extremamente importante para a realização de medições em tecido biológico. As barras de erro são erro padrão da média.

Taxa de digitalização

A taxa de varredura foi variada de 100 V/s para 1.000 V/s. Os eletrodos modificados Bare (Figura 5a) e nanopartícula de ouro (Figura 5b) mostraram uma resposta linear em relação à detecção de dopamina, portanto, indicando controle de adsorção à superfície da nanopartícula nua e dourada modificada microelétrodo. As barras de erro são erro padrão da média.

Concentração

A concentração variou de 100 nM a 100 μM de dopamina para microeletrodos de fibra de carbono (figura6a) e nanopartículas de ouro modificados (Figura 6B). A faixa linear foi de 100 nM a 10 μM. Após 10 μM, observamos uma curva assíptica indicando que a dopamina é supersaturada na superfície do microeletrodo de fibra de carbono. A resposta linear para a corrente de pico de oxidação de dopamina em relação à concentração de dopamina denota controle de adsorção para a superfície do eletrodo. As concentrações fisiologicamente relevantes de dopamina no cérebro estão dentro desta faixa e variam entre as regiões cerebrais.

Figura 1. Um esquema de oxidação da dopamina. Sobreposição de microeletrodo de fibra de carbono oxidante dopamina. Transferência de carga é mostrada a partir da superfície como a dopamina é oxidada à dopamina-ortoquinona e de volta à dopamina como a forma de onda do triângulo dopamina é aplicada (-0,4 V a 1,3 V em 400 V/s). O atual vs. tempo e gráficos de cores são mostrados dentando a oxidação de dopamina (verde) e redução de dopamina (azul). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Imagens SEM de (a) microeletrodo de fibra de carbono nua, (b) microeletrodos de fibra de carbono modificados com nanopartículas de ouro com tempo de deposição de eletrodo de 20 min e (c) microeletrodos modificados com nanopartículas de ouro com tempo de deposição de eletrodo de 5 min. Isto fornece a prova de resultados do princípio que o tamanho e a espessura de revestimentos do nanopartícula do ouro podem ser controlados pelo tempo do electrodeposição. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Comparação da sensibilidade dos elétrodos modificados desencapados e ouro-Nanoparticle. (A) sobreposição de voltammogramas cíclicos de microeletrodos modificados de nanopartículas nuas e de ouro. (B). gráfico de barras indicando diferenças na corrente oxidativa de pico de microeletrodos modificados de nanopartículas de ouro e Bare. (C). gráfico de barras que mostra a diferença no ΔEP entre microeletrodos modificados de nanopartículas de ouro e Bare. As barras de erro são erro padrão da média. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Experimento de estabilidade. (A) Bare e (B) os microeletrodos modificados com nanopartículas de ouro foram colocados em uma célula de fluxo para um total de pelo menos 4 h. Sua sensibilidade para 1 μM de dopamina foi medida ao longo de 4 h. Ambos tiveram uma resposta uniforme à dopamina sobre 4 h. barras de erro são erro padrão da média. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Experimento de taxa de digitalização. (A) Bare e (B) os microeletrodos modificados com nanopartículas de ouro foram colocados em uma célula de fluxo, e a taxa de varredura foi variada de 100 v/s para 1.000 v/s. Os microeletrodos modificados de nanopartículas nuas e de ouro tiveram uma resposta linear em relação à taxa de varredura, denitando assim o controle de adsorção de dopamina na superfície do microeletrodo de fibra de carbono modificado e nanopartícula de ouro. As barras de erro são erro padrão da média. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. Experimento de concentração. (A) Bare e (B) os microeletrodos modificados com nanopartículas de ouro foram expostos a várias concentrações de dopamina 100 nm – 100 μm. Ambos os microeletrodos modificados de nanopartículas de ouro e Bare tiveram uma resposta linear em relação à dopamina até 10 μM, denitando assim o controle de adsorção à superfície do eletrodo. Em concentrações superiores a 10 μM, observamos uma curva assíptica, que é indicativa de saturação de dopamina na superfície do eletrodo, ocupando todos os sítios de adsorção e resultando em maior controle de difusão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a revelar.