Isolamento, cultura, caracterização e diferenciação de células progenitoras do músculo humano do procedimento de biópsia do músculo esquelético

Resumo

Nós apresentamos técnicas para isolar-se, cultivando, caracterizando, e diferenciando pilhas preliminares humanas do progenitor do músculo (hMPCs) obtidas do tecido esqueletal da biópsia do músculo. os hmpcs obtidos e caracterizados através destes métodos podem ser usados para abordar subseqüentemente as perguntas da pesquisa relativas à miogenesis humana e à regeneração do músculo esqueletal.

Resumo

O uso do tecido humano primário e das células é ideal para a investigação de processos biológicos e fisiológicos, como o processo regenerativo do músculo esquelético. Há desafios reconhecidos para trabalhar com células-tronco adultas primárias humanas, particularmente células progenitoras musculares humanas (hMPCs) derivadas de biópsias de músculo esquelético, incluindo a baixa produção de células de tecido coletado e um grande grau de heterogeneidade de doadores de parâmetros de crescimento e morte entre culturas. Ao incorporar a heterogeneidade no projeto experimental exige um tamanho de amostra maior para detectar efeitos significativos, igualmente permite que nós identifiquem os mecanismos que fundamentam a variabilidade na capacidade da expansão de hmpc, e permitem assim que nós compreendam melhor heterogeneidade na regeneração muscular esquelética. Novos mecanismos que distinguem a capacidade de expansão das culturas têm o potencial de levar ao desenvolvimento de terapias para melhorar a regeneração muscular esquelética.

Introdução

O músculo esquelético é o maior sistema de órgãos do corpo humano, representando 30 − 40% da massa corporal inteira¹. Além do que seu papel bem reconhecido na locomoção, o músculo esqueletal mantem a temperatura e a postura de corpo, e joga um papel central na homeostase nutriente do corpo inteiro. Pesquisas envolvendo participantes humanos, animais e modelos de cultura celular são valiosas para abordar questões relacionadas à biologia e regeneração do músculo esquelético. A isolação e a cultura de pilhas preliminares humanas do progenitor do músculo (hMPCs) fornecem um modelo robusto que permita que as técnicas e as manipulações da cultura de pilha sejam aplicadas às amostras humanas. Uma vantagem de usar hmpcs é que eles mantêm o fenótipo genético e metabólico de cada doador^2,3. A manutenção do phenotype do doador permite que os investigadores examinem a variação inter-individual no processo myogenic. Por exemplo, empregamos nosso método de caracterização do hMPC para identificar diferenças relacionadas à idade e ao sexo na capacidade de expansão da população de hMPC⁴.

A finalidade deste protocolo é detalhar técnicas para isolar, cultura, caracterizar, e diferenciar hMPCs do tecido da biópsia do músculo esqueletal. Com base no trabalho anterior que descreveu hmpcs e identificou potenciais fabricantes de superfície celular para o isolamento de hmpc^5,6, este protocolo preenche uma lacuna crítica no^{conhecimento, ligando}o isolamento à caracterização de hmpcs. Além disso, as instruções detalhadas passo a passo incluídas neste protocolo tornam o isolamento e a caracterização do hMPC acessíveis a um amplo público científico, incluindo aqueles com experiência prévia limitada com hMPCs. Nosso protocolo está entre os primeiros a descrever o uso de um citômetro da imagem latente para seguir populações da pilha. Os citômetros recentemente projetados da imagem latente são State-of-the-art, elevado-throughput, e microplate-baseado, permitindo a imagem latente viva da pilha, a contagem da pilha, e a análise multicanais da fluorescência de todas as pilhas em cada poço de uma embarcação da cultura dentro dos minutos. Este sistema permite a quantificação rápida de mudanças dinâmicas na proliferação e na viabilidade de uma população inteira da pilha com somente o rompimento mínimo à cultura. Por exemplo, somos capazes de realizar medidas objetivas de confluência em dias sucessivos in vitro para determinar a cinética de crescimento de cada cultura derivada de diferentes doadores. Muitos protocolos na literatura, particularmente aqueles que envolvem a diferenciação de MPCs, necessitam de células para atingir um nível definido de confluência antes de iniciar a diferenciação ou tratamento⁷. Nosso método permite a determinação objetiva da confluência de cada poço em um vaso de cultura, permitindo que os pesquisadores iniciem o tratamento de forma imparcial e não-subjetiva.

No passado, uma limitação principal de usar hMPCs preliminares era baixos rendimentos que limitam o número de pilhas disponíveis para experiências. Nós e outros mostraram que o rendimento de MPCs do tecido de biópsia do músculo esquelético é de 1 − 15 MPCs por miligrama de tecido (Figura 1)⁸. Como nosso protocolo permite quatro passagens das células antes da purificação com a triagem de células ativadas por fluorescência (FACS), nossos rendimentos criopreservados de hMPC, derivados de pequenas quantidades de tecido de biópsia (50 − 100 mg), são suficientes para abordar os objetivos de pesquisa onde são necessários vários experimentos. Nosso protocolo FACS produz um ~ 80% puro (Pax7 positivo) MPC população, assim, nosso protocolo é otimizado tanto para o rendimento e pureza.

Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional da Universidade de Cornell. Todos os participantes foram rastreados por condições de saúde subjacentes e deram consentimento informado.

1. obtendo o tecido muscular humano através da biópsia do músculo esquelético

1. Identifique o músculo vasto vasto lateral via palpação, marcos anatômicos e contração ativa do músculo.
2. Palpar o vasto vasto lateral por ter o participante apertar o músculo quadríceps e encontrar a barriga do músculo, cerca de 1/3 do caminho da patela para o quadril, e apenas ventrolateral para o fêmur.
3. Use uma fita de medição do papel para marcar uma área com um marcador cirúrgico aproximadamente 4 − 6 polegadas da parte superior da patela que representa a barriga do músculo.
4. Raspar qualquer cabelo perto da área marcada e, em seguida, limpar com um anti-séptico de grau cirúrgico que é usado antes dos procedimentos médicos (por exemplo: gluconato de clorexidina a 2% (CHG)/70% álcool isopropílico (IPA)).
5. Anestesie o local da biópsia com lidocaína a 1%.
   Nota: Evite injetar a lidocaína no músculo esquelético.
6. Faça uma via de incisão de 4 − 5 mm no local marcado.
7. Depois que a área é anestesiada, empurre uma agulha de Bergstrom com trocar através da fáscia na barriga do músculo (aproximadamente 2 − 3 cm).
8. Desenhe o tecido muscular na agulha de Bergstrom retirando o trocarte de corte 2 − 3 cm enquanto um assistente aplica sucção retirando um êmbolo de seringa 60 mL anexado.
9. Feche a câmara de corte.
10. Gire a base da agulha de biópsia um quarto de volta e repita a sequência de abertura da agulha, aplicando sucção, e fechando a agulha.
    Nota: Cada vez que a agulha é fechada, um corte de tecido muscular deve ser obtido dentro da agulha de Bergstrom. Durante a coleta da amostra, a agulha permanecerá na coxa na mesma posição vertical enquanto é girada longitudinalmente através de 360 ° para obter cada amostra. Esta seqüência pode ser repetida 3 − 4 vezes.
11. Expelir o tecido coletado da biópsia da agulha em uma almofada de limpeza nonaderaderente estéril.
12. Examine o tecido e remova quaisquer tecidos adiposos visíveis e fibróticos usando lâminas ou pinças de bisturi estéreis.
13. Coloque uma porção (50 − 100 mg) de tecido em um tubo estéril contendo um meio nutriente independente de CO₂(por exemplo, Hibernate a).
    Nota: O peso do tecido é determinado como se segue. Primeiro coloque o tubo tampado contendo o meio nutriente em uma escala e Tara. Em seguida coloque o tecido no tubo, Recapitule o tubo e, em seguida, pesar o tubo que contém o tecido no meio nutriente.
14. Conservar o tubo que contém o tecido e o meio nutriente a 4 ° c até ao processamento.
    Nota: O tecido da biópsia deve ser processado dentro de 48 h da coleção.

2. isolando células progenitoras do músculo humano do tecido da biópsia

1. Tecido de biópsia de mince.
   1. Transfira o tecido muscular do meio nutriente para um prato de Petri estéril em um armário de segurança biológico ou local de trabalho estéril similar.
   2. Use lâminas de bisturi estéreis para triturar o tecido em ~ 1 mm³ peças.
2. Lave o tecido da biópsia picada para remover detritos residuais.
   1. Transfira o tecido muscular para um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e permita que o tecido se estabeleça através da gravidade.
   2. Aspirar o sobrenadante ter cuidado para não perturbar o tecido muscular.
   3. Adicionar 10 ml de PBS para o tecido lavado e permitir que o tecido muscular para reassentar através da gravidade.
   4. Aspirar o sobrenadante ter cuidado para não perturbar o tecido muscular.
   5. Adicionar 10 ml de baixa glicose Dulbecco ' s modificado Eagle médio (DMEM) e permitir que o tecido para reassentar via gravidade.
   6. Aspirar o sobrenadante ter cuidado para não perturbar o tecido muscular.
3. Incubar o tecido na mídia Digest.
   1. Ressuscite o tecido muscular em 3 ml de meios de digestão (2 mg/ml de colagenase D em baixa glicose DMEM).
      Nota: as soluções de colagenase D podem ser preparadas a 20 mg/mL em DMEM de baixa glicose e armazenadas a-80 ° c, depois diluídas 1:10 em baixa glicose DMEM no momento do uso.
   2. Incubar o tubo que contém o tecido muscular num banho de água a 37 ° c durante 30 min.
   3. Triturar a suspensão do tecido muscular a cada 10 min usando uma pipeta serológica de 10 mL ou uma pipeta de furo largo.
   4. Adicionar 83 μL de meios de digestão adicionais e 24 μL de solução de Dispase (acetato de cálcio 0,76 mM, acetato de sódio a 1,39 mM, 13,91 mg/mL de Dispase II em DMEM de baixa glucose). Retorne a suspensão ao banho de água de 37 ° c.
   5. Triturar a suspensão do tecido muscular a cada 5 − 10 min com uma ponta de Pipet de furo largo.
   6. Continue a trituração até que um chorume uniforme seja conseguido, e para não mais do que 1,5 h para impedir sobre a digestão.
      Nota: A picada suficiente do tecido e a atividade enzimática da colagenase e Dispase podem impactar a digestão da amostra. Um chorume uniforme deve poder passar através de uma ponta normal da pipeta com oclusão mínima após 1,5 h. Se um chorume uniforme não for conseguido após 1,5 h, verifique se o tecido que picou é suficiente, e o tecido é picado ao tamanho apropriado (etapa 2.1.2). Além disso, a atividade das enzimas deve ser testada como lote para variação de lote na atividade enzimática ocorre.
4. Células da pelota e congelar em meios de recuperação.
   1. Adicionar 6 mL de meios de crescimento (GM; 79% Ham ' s F12, 20% soro fetal bovino, 1% penicilina/estreptomicina, 5 ng/mL fator de crescimento básico de fibroblastos [bFGF], pH 7,4, passou através de um filtro de 0,22 μm) para a pasta muscular.
   2. Pipetar a suspensão através de um filtro de células de 70 μm para um tubo cônico de 50 mL. Enxague o filtro com um adicional de 4 mL de GM.
      Nota: A amostra pode ser transferida de volta para um tubo cônico de 15 mL para facilitar a visualização do pellet. Um volume maior da lavagem pode ser usado se os rendimentos de pilha subseqüentes forem baixos.
   3. Centrifugador a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente (RT).
   4. Aspirar o sobrenadante ter certeza de não interromper o pellet. Deslize o tubo para resuspender o pellet nos suportes restantes. Se as células não vão ser cultivadas imediatamente proceder ao passo 2.4.5 para obter instruções sobre o armazenamento de longo prazo, caso contrário, prossiga para a etapa 3.1.6.
      Nota: Se a cultura imediata é desejada, GM em placas da cultura da pilha deve pre-ser incubada (etapas 3.1.1 e 3.1.2) antes que o processamento da biópsia comece.
   5. Adicione 1,5 mL de mídia de congelamento de cultura de células de recuperação (tabela de materiais) ao pellet recuperado.
   6. Transfira a pasta para um crio-frasco. Coloc o CryoVial em um refrigerador isopropanol-controlado da taxa durante a noite em-80 ° c. Armazene o CryoVial em-80 ° c até pronto para a cultura.
      Nota: Os cryovials que contêm a pasta podem ser mantidos no nitrogênio líquido para o armazenamento a longo prazo (maior de 1 mês). O uso de um resfriador de taxa controlado por isopropanol permite que as células sejam reprovadas de forma reversível a uma taxa de 1 ° c/min, resultando em taxas de recuperação celular ideais, como evidenciado pela viabilidade após congelamento e aumento da probabilidade de apego aos vasos de cultura celular⁹. Alternativamente, pode ser utilizado um copo contendo isopropanol RT, colocado num congelador a-80 ° c.

3. cultivando células progenitoras do músculo humano

1. Descongelar a pasta muscular.
   1. Antes de descongelar e semear hMPCs, pré-equilibram placas de cultura celular em GM. Adicionar 250 μL de GM a 4 poços de um colágeno-revestido (colágeno I), 24-bem placa de cultura celular. Encha os poços restantes com 500 μL de suportes de base estéreis (ou seja, F12) para evitar a evaporação durante a cultura a longo prazo.
      Nota: Para biópsias entre 50 g e 100 g, quatro poços de uma placa 24-well são apropriados. Se o tecido da biópsia for inferior a 50 g, dois poços podem ser mais apropriados. Restos residuais e baixo número de células impedem o uso de uma técnica de contagem de células nesta etapa; Conseqüentemente, a densidade de semeadura exata não é determinada e varia ligeiramente da biópsia à biópsia.
   2. Incubar vasos de cultura celular com GM a 37 ° c em 5% CO₂ para 1 h antes da semeadura.
   3. Remova os cryovials do congelador-80 ° c e coloc em um banho de água de 37 ° c; o líquido no tubo deve ser completamente submerso em água.
   4. Quando o descongelamento estiver quase completo (~ 5 min), transfira o criofrasco para uma capa de fluxo laminar estéril. Transfira o chorume do músculo para fora do tubo CryoVial e adicione a um tubo cônico de 15 mL contendo 6 mL de GM pré-aquecido a uma taxa de 1 mL/min.
   5. Centrifugue a pasta muscular a 300 x g durante 5 min em RT.
      Nota: Uma centrífuga de balde oscilante pode facilitar a visualização de pequenas pelotas nesta etapa, mas não é essencial.
   6. Aspirar o sobrenadante ter certeza de não interromper o pellet. Deslize o tubo para resuspender o pellet nos suportes restantes e ressuscite em 1 mL de GM.
   7. Transferir 250 μL do pellet ressuspendido (agora considerado uma suspensão de hMPC) para cada um dos 4 poços da placa de cultura de células pré-incubadas 24-bem.
2. Cultura e passagem hMPCs.
   1. Manter as culturas de hMPC em GM a 37 ° c em 5% CO₂.
      Nota: Os estoques de GM sem o bFGF (ou seja, F12, antibióticos, FBS) são preparados em lotes e mantidos a 4 ° c por até 2 semanas. o bFGF é adicionado à GM no dia do uso. Os meios que contêm bFGF podem ser armazenados para 48 h em 4 ° c.
   2. Vinte e quatro horas após o isolamento, aspirar o GM, lave suavemente o vaso de cultura 2x com pre-aquecido GM, e adicionar fresco GM.
      Nota: 24 h deve fornecer hMPCs tempo adequado para anexar; Não devem ser removidos hMPCs após a lavagem. Esta etapa também removerá restos remanescentes que foram gerados durante a colheita da célula, tornando o vaso mais receptáculo à varredura precisa de confluência usando um citometro de imagem (seção 5 abaixo). Após esta mudança de mídia inicial, GM é alterado a cada 48 h.
   3. Passagem hMPCs quando 70% confluência é alcançada ou quando eles permaneceram no mesmo prato de cultura por 10 dias, o que ocorrer primeiro.
      Nota: 70% confluência é de aproximadamente 55.000 células/cm².
   4. Para a passagem, adicione 250 μL de tripsina pré-aquecida a cada poço de uma placa de cultura de 24 poços e incubar durante ~ 5 min.
   5. Bata a embarcação da cultura da pilha em uma superfície firme para desanexar hMPCs. Um microscópio de luz pode ser usado para verificar se os hMPCs se destacaram.
   6. Transfira as suspensões de Trypsin/hMPC para 5 mL de GM em um tubo cônico de 15 mL.
   7. Centrifugue a suspensão hMPC a 300 x g durante 5 min em RT.
   8. Retire as suspensões hMPC da centrífuga e coloque no gelo na capa de fluxo laminar estéril.
      Nota: Mantendo hMPCs no gelo durante a passagem resulta em menos agregação de células.
   9. Aspirar sobrenadante de hMPCs e gentilmente ressuscito pellet em 1 mL de GM.
   10. Contagem de células usando um hemocitômetro ou um contador de células automatizado.
       Nota: Uma diluição 1:5 da suspensão da pilha ao amortecedor de contagem da pilha é geralmente apropriada.
   11. HMPCs da semente em pratos colagénio-revestidos da cultura que contêm GM pre-aquecido em uma densidade de 3.500 pilhas por o cm². Uma combinação de placas de 10 cm e de 24 placas do poço é ideal. As 24 placas do poço podem ser escaneadas diariamente em um citômetro da imagem latente para monitorar o crescimento.
   12. Siga o mesmo procedimento (começando na etapa 3.2.4.) para passagens subsequentes.
       Nota: A saúde e a pureza das células podem ser monitoradas através de passagens usando um marcador de senescência celular (por exemplo, β-galactosidase) e imunocoloração para Pax7.
3. Cryopreserve os hMPCs.
   1. Crio preservar células em excesso para uso posterior para tornar o volume de cultura mais gerenciável.
   2. Para a criopreservação, siga o procedimento de tripsinização descrito nas etapas 3.2.4.-3.2.9.
   3. Enquanto a suspensão celular está sendo centrifugada, prepare uma mistura de 20% (por exemplo, 200 μL) dimetil sulfóxido (DMSO) e 80% (por exemplo, 800 μL) GM. pipeta acima e para baixo 20x para assegurar a mistura adequada. Deixe a mistura para descansar no gelo.
   4. Com base na contagem de células, diluir a suspensão hMPC para 2 x 10⁶/ml em GM.
   5. Combine a suspensão hMPC e o 20% estéril DMSO/80% GM mistura 50/50. A mídia de criopreservação final é uma combinação de DMSO (10%) e GM (90%) contendo 1 x 10⁶ hmpcs/ml.
   6. Coloc 1 mL da suspensão de hMPC preparada na etapa 3.3.5 em tantos como cryovials como a contagem inicial da pilha permite. Em seguida, coloque hMPCs aliquotadas em um refrigerador de taxa controlada por isopropanol em um freezer de-80 ° c durante a noite.
      Nota: Nesta etapa, tipicamente entre 5 e 15 milhões células são obtidas, 30 − 60% dos quais são identificados como hMPCs por FACS.

4. isolando células progenitoras de músculo humano Pax7⁺ via citometria de fluxo

1. Para preparar hMPCs das culturas vivos (etapa 3.2.11), Trypsinize bastante embarcações da cultura para 1 x 10⁶− 2 x 10⁶ pilhas totais. Prepare suspensões da pilha como descritas nas etapas 3.2.4 − 3.2.9.
2. Prepare hMPCs de culturas criopreservadas (Step 2.4.6 ou 3.3.6).
   1. Selecione 1 − 2 tubos contendo ~ 1 x 10⁶ passagem quatro hMPCs para cada doador.
      Nota: Usando a passagem quatro hMPCs permite o rendimento de pilha adequado ao ainda manter o potencial proliferative até a passagem seis (Figura 2).
   2. Rapidamente descongelar as células, removendo-os do freezer-80 ° c e colocando-os em um banho de água de 37 ° c com o líquido no tubo completamente submerso.
   3. Quando o descongelar está quase completo (~ 5 min), transfira hMPCs para uma capa de fluxo laminar estéril e transfira o conteúdo da suspensão celular em 6 mL de GM pré-aquecido em um tubo cônico de 15 mL a uma taxa de 1 mL/min.
   4. Prepare suspensões da pilha como descritas nas etapas 3.2.7 − 3.2.9.
   5. Ressuscitem cada pellet em 3 mL de tampão FACS (500 mL de PBS, 12,5 mL de soro de cabra normal, 2 mL 0,5 M EDTA, pH 7,4, passados através de um filtro de 0,22 μm).
   6. Centrifugue a suspensão da pilha em 300 x g por 5 minutos em RT.
   7. Aspirar sobrenadante de hMPCs e resuspender suavemente a pelota em 250 μL de tampão FACS; lugar no gelo.
   8. Coloque 100 μL de células num tubo de microcentrifugação de 1,7 mL e deixe no gelo para ser utilizado como controlos vivos/mortos (passo 4.5.1).
      Nota: o UL 100 das pilhas a ser usada para controles vivos/inoperantes pode vir de tomar um volume pequeno (~ 20 UL) de pilhas ressuspenso de cada doador a ser classificado ou das pilhas bancados.
      Nota: é importante não tomar mais de 20 UL de células ressuscipended de um único doador. Traga o volume até 100 UL com tampão de FACS se < 100 UL das pilhas está disponível.
3. Mancha hMPCs para marcadores de superfície celular.
   1. Prepare o seguinte cocktail do anticorpo (os montantes mostrados são para cada cultura, escala-acima apropriadamente): 5 μL CD56 (molécula de adesão da pilha neural [NCAM]; PE-Cy7-conjugados) e 5 μL CD29 (β1-integrina; AlexFluor488-conjugados). A diluição final do anticorpo é 1:50.
   2. Adicione 10 μL do coquetel de anticorpos a cada suspensão de hMPC e incubar no gelo por 30 min no escuro.
   3. Adicionar 10 mL de tampão FACS para cada mistura de suspensão/cocktail de anticorpos.
   4. Centrifugue cada tubo em 300 x g por 5 min em RT.
   5. Ressuspender o pellet em 300 μL de tampão FACS e transferir para um tubo de poliestireno de 5 mL de fundo redondo.
   6. Mantenha a suspensão no gelo e protegida da luz.
4. Prepare as contas de compensação.
   Nota: os controles positivos para cada anticorpo e um controle negativo (grânulos não manchados) devem ser preparados usando grânulos da compensação. Os controles de talão de compensação devem ser executados no citometro de fluxo antes das amostras serem classificadas. Estes controles permitem a determinação de quanto o fluorocromo de cada anticorpo pode ser detectado no outro canal de modo que a compensação possa ser aplicada.
   1. Contas de compensação vortex.
   2. Em três tubos de microcentrífuga de 1,7 mL, adicione uma gota (50 μL) de contas de compensação.
   3. Adicionar 1 μL de cada anticorpo ao tubo apropriado, ou nenhum ao controlo negativo.
   4. Incubar no escuro por 15 min.
   5. Adicione 1,5 mL de tampão FACS a cada tubo e Vortex.
   6. Centrifugue cada tubo em 300 x g em um centrifugador do de bancada por 5 minutos em RT.
   7. Aspirar sobrenadante e ressuspender o pellet em 200 μL de tampão FACS.
      Nota: A pelota pode ser muito difícil de Visualizar; deve tomar-se cuidado ao aspirar o sobrenadante.
   8. Coloque a suspensão em um tubo de poliestireno de 5 mL de fundo redondo e, em seguida, mantenha o tubo no gelo e protegido da luz.
5. Prepare controles vivos e mortos.
   1. Divida o 100 μL de hMPCs da etapa 4.2.8 em dois tubos do microcentrifugador de 1,7 mL (um para o controle vivo e um para o controle inoperante).
   2. Coloque o tubo de controle morto em um bloco de aquecimento pré-aquecido para 70 ° c por > 10 min. Durante este tempo, manter o controle ao vivo sobre o gelo.
   3. Centrifugue cada tubo em 300 x g em um centrifugador do de bancada por 5 minutos em RT.
   4. Aspirar sobrenadante e ressuspender o pellet em 150 μL de tampão FACS.
   5. Combine os controles vivos/inoperantes em um único tubo inferior redondo do poliestireno de 5 mL.
6. Realizar coloração de viabilidade.
   1. Adicionar 1 μL de 7-aminoactinomicina D (7-AAD) a todos os tubos contendo células a serem classificadas e ao controle vivo/morto.
   2. Adicionar GM a 24-poço revestido com colágeno (250 μL/poço) e 10 cm (8 mL/poço) placas e permitir equilibrar em uma incubadora de cultura celular em 37 ° c em 5% CO₂.
7. Classifique hMPCs via citometria de fluxo.
   1. Classifique hmpcs em um citômetro do fluxo com bocal de 100 μm em uma pressão de 20 libras por polegada quadrada. Determine hMPCS ao vivo com base em dispersão lateral e direta, bem como negatividade 7-AAD (parâmetros de classificação e uma classificação representativa podem ser vistos na Figura 3).
   2. As células positivas para PE-Cy7 (780/60 nm) e AlexFluor488 (530/30 nm) representam CD56⁺/Cd29⁺ células e, portanto, são Pax7 células positivas (hmpcs). Classifique células positivas duplas em tubos de coleta contendo uma almofada de 300 μL de tampão FACS.
      Nota: A pureza das culturas classificadas pode ser determinada por imunocoloração para Pax7 seguida de análise de citometria de fluxo a jusante (Figura 4).
   3. Descarte todas as outras células.
   4. Transfira as células classificadas para um tubo cônico de 15 mL.
   5. Gire a suspensão hMPC em 300 x g por 5 min em RT.
   6. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuscito em 1 mL de GM.
   7. Contagem de células usando um hemocitômetro ou um contador de células automatizado.
      Nota: Enquanto o número de células pode ser inferido como o número de eventos que são classificados positivamente, essa contagem foi encontrada para superestimar o número de células por 10 − 40% em comparação com os métodos tradicionais de contagem de células.
   8. Semeie os hMPCs conforme descrito na etapa 3.2.11.
      Nota: A verificação da pureza da população de hMPC pode ser determinada por imunomarcação para Pax7 e análise via citometria de fluxo.

5. caracterizando culturas do progenitor do músculo humano (hMPC) que usam um cytometer da imagem latente

1. Use o citômetro da imagem latente (tabela dos materiais) para executar varreduras da confluência.
   1. Selecione criar nova digitalização e, em seguida, insira/selecione a categoria da chapa, perfil da placa e identificação da placa. O citômetro da imagem latente pode acomodar 96, 24, e 6 placas do poço.
   2. Em aplicativo, selecione confluência > confluência 1.
   3. Selecione um poço para ver usando o navegador à direita da tela.
   4. Encontre um plano de foco onde as células aparecem em branco em comparação com o fundo e selecione registrar manual ou permitir que o citometro de imagem para selecionar o plano de foco, selecionando Register auto.
      Nota: Para as 96 placas de poços sugeridas na tabela de materiais, uma posição aproximada é de 4,3 unidades.
   5. Use o mouse para destacar todos os poços que precisam ser verificados. Toda a área do poço será automaticamente digitalizada. Selecione Iniciar digitalização.
   6. Selecione as configurações de análise ideais para placa e tipo de célula.
      Nota: Para hMPCs, as seguintes configurações são ideais: intensidade = 6, intensidade saturada = 0, diâmetro = 8, espessura mínima = 3, tamanho de cluster mín = 500 e precisão = alta.
   7. Selecione iniciar análise.
      Nota: Inspecione visualmente imagens para assegurar que o usuário e o citômetro da imagem latente concordem a respeito do perímetro das pilhas. Se existir uma grande discrepância, Rescan a placa usando um plano diferente de foco ou configurações de análise diferentes. A digitalização de confluência pode ser usada para comparar o crescimento entre culturas, tempo de administração de um tratamento ou para monitorar células e decidir quando iniciar a diferenciação. Se a diferenciação for desejada, os detalhes são fornecidos na seção 6.
2. Use o citômetro da imagem latente para contar pilhas.
   1. Prepare uma solução de coloração contendo 12 mL de Ham ' s F12, 6 μL de Hoechst 33342 e 24 μL de iodeto de propiídio.
   2. Aspirar a mídia e substituir com a solução de coloração, incubar a 37 ° c por 15 min.
   3. Aspirar a solução de coloração e substituir por Ham ' s F12.
      Nota: É importante usar uma mídia com baixos níveis de fenol vermelho para obter imagens claras. Alternativamente, PBS pode ser usado.
   4. Carregue a placa no citômetro da imagem latente e a aplicação, selecione a viabilidade da pilha > vivo + inoperante + total. A canaleta viva será uma imagem brilhante do campo, o canal inoperante será o iodeto do propidium, e o canal total será o Hoechst 33342.
   5. Defina o canal ao vivo para o campo brilhante e clique em registrar auto em configuração de foco.
   6. No canal total , defina o canal para azul. Use o foco de localizar para colocar os núcleos em foco ou use as setas para cima e para baixo para definir manualmente o foco. Clique em definir deslocamento para selecionar o foco.
   7. No canal morto , defina o canal para vermelho. Use Localizar foco para colocar as células mortas em foco ou use as setas para cima e para baixo para definir manualmente o foco. Clique em definir deslocamento para selecionar o foco.
   8. Selecione Iniciar digitalização para iniciar a digitalização.
   9. Selecione os parâmetros de análise que são apropriados para a placa e o tipo de célula. Selecione iniciar análise para iniciar a análise. Após a conclusão da análise, verifique visualmente se a análise está adequadamente contando as células (por exemplo, para o canal total de verificação de que cada núcleo está sendo reconhecido como um núcleo e que o citometro de imagem não está contando quaisquer manchas no fundo como núcleos). Se a varredura e a análise forem satisfatórias, retorne a placa à incubadora, de outra maneira Rescan ou modifique parâmetros da análise.

6. diferenciando células progenitoras do músculo humano (hMPCs) para Miotubos

1. Determine a confluência hMPC usando o protocolo na seção 5,1. Para diferenciar hmpcs em myotubes, é ideal para que as pilhas sejam 80 − 85% confluentes como determinado pela função da confluência no citômetro da imagem latente (veja a seção 5). Se os hMPCs de mais de um doador original são usados, a exploração da confluência permite que as pilhas dos doadores diferentes comecem a diferenciação na altura onde alcangam a confluência.
   Nota: Na confluência de 80%, há aproximadamente 66.000 células/cm².
2. Células de lavagem 2x com meios de diferenciação (97% Ham ' s F12, 2% soro eqüino, 1% penicilina/estreptomicina, pH 7,4, passou através de um filtro de 0,22 μm).
3. Mantenha as células em meios de diferenciação durante o tempo que a experiência dita ao mudar a mídia diariamente.
4. Avalie diretamente a formação do formação pela imunocoloração para a cadeia pesada do miosina embrionário, que é tipicamente detectável após 7 − 10 dias da diferenciação.
   Nota: O tempo necessário para formar miotubos pode diferir ligeiramente dependendo do doador e do número de células quando a diferenciação foi iniciada; Portanto, recomenda-se que as culturas de cada doador sejam monitoradas individualmente.

Resultados

Os resultados da citometria de fluxo representativo do isolamento do hMPC do tecido muscular humano podem ser visualizados na Figura 1. hMPCs pode ser identificado pela primeira gating eventos baseados em dispersão lateral e dispersão para a frente para eliminar células mortas ou detritos, seguido por selecionar apenas as células que são negativas para 7-AAD e, portanto, são viáveis. A seleção de células positivas para ambos os marcadores de superfície celula...

Discussão

Os hMPCs primários são um importante modelo de pesquisa usado para compreender a biologia do músculo esquelético e o processo regenerativo. Adicionalmente, os hMPCs têm o potencial ser usado para a terapia. Entretanto, há uns desafios reconhecidos em usar hMPCs preliminares para a pesquisa e a terapia, incluindo a compreensão limitada das pilhas derivadas dos seres humanos¹⁰. Há também um grande grau de variação na capacidade de expansão entre as culturas doadoras, o que limita o potencial de uso ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,25% Tripsina, 2,21 mM EDTA	Corning	25-053-Cl	Tripsina utilizada para remover hMPCs aderentes de vasos de cultura de células
Placa de cultura de células de 10 cm	VWR	664160	Placas utilizadas para cultura hMPCs
Tubo Falcon	352196	15	mL utilizados em todos os protocolos de isolamento e cultura hMPC
Placa de cultura de células de 24 poços	Grenier Bio-One	662 160	Placas usadas para cultura hMPCs
Solução de Coloração de Viabilidade 7-AAD	eBioscience	00-6993-50	Coloração de viabilidade para identificação de células vivas durante a classificação FACS
Alexa Fluor 488 anti-humano CD29, Clone: TS2/16	BioLegend	303016	Anticorpo conjugado para FACS
Placa de cultura de células preta de 96 poços	Grenier Bio-One	655079	placa de cultura de células de 96 poços ideal para imagens fluorescentes usando o citômetro de imagem de biociência Celigo
S Celigo S	Nexcelcom		usado para rastrear culturas hMPC
Filtro de células	VWR	352350	Filtro de células para eliminar grandes pedaços de detritos durante o processamento da biópsia muscular
Colágeno Tipo I (Rato Cauda)	Corning	354236	Colágeno para revestimento de placas de cultura de células
Colagenase D	Roche	11 088 882 001	Usado para degradação de colágeno e outros tecidos conjuntivos no tecido de biópsia do músculo esquelético
Dimetilsulfóxido	VWR	WN182	Usado para criopreservação de hMPCs
Dispase II	Sigma Life Sciences	D4693	Uma protease usada para digestão enzimática do tecido
de biópsia do músculo esqueléticoDulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder	Gibco	31600-034	DMEM de baixa glicose para processamento de biópsia muscular
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	21600-010	PBS para processamento de biópsia muscular
EDTA Dissodium Salt Dihydrate	J.T. Baker	4040-01	Necessário para buffer FACS
Soro Fetal	Bovino VWR	89510-186	Soro fetal bovino utilizado para meios de crescimento hMPC
Mídia base F12	Gibco	21700-026	para hMPCs
Soro equino inativado por calor	Gibco	26-050-070	Soro de cavalo usado para fazer mídia de diferenciação hMPC
Hemocitômetro	iNCyto	DHC-N0105	Usado para contar células
Hibernar A	Gibco	A1247501	Mídia para preservar a biópsia do músculo esquelético tecido
Hoechst 33342, tricloridrato, trihidrato	Life Technologies	H21492	Coloração de DNA para identificar todas as células usando o Celigo S
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P-4	Usado para congelamento de taxa controlada de hMPCs
Tampão Moxi	Orflo	MXA006	Tampão para contador de células automatizado
Moxi	Orflo	MXC002	Cassesttes para contador de células automatizado
Moxi z Mini Contador de Células Automatizado	Orflo		Contador de células automatizado
Mr. Frosty Recipiente de congelamento	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	Recipiente de congelamento de células de taxa controlada disponível comercialmente
Soro de cabra normal (10%)	Thermo Fisher Scientific	50062Z	Soro de cabra usado no tampão
FACSPE-Cy7 Camundongo Anti-CD56 humano, Clone: B159	BD Pharmingen	557747	Anticorpo conjugado para FACS
Penicilina/Estreptomicina 100x Solução	Corning	30-002-CI	Antibióticos adicionados ao meio de cultura
Iodeto de propídio	Thermo Fisher Scientific	P3566	Coloração de DNA para identificação de células mortas usando o
fator de crescimento de fibroblastos humanos recombinantes	Promega	G5071	Suplemento em hMPC para evitar diferenciação espontânea
Meio de Congelamento de Cultura de Células de Recuperação	Gibco	12648-010	Mídia usada para crioperseve pastas de biópsia muscular
Bicarbonato de Sódio	Fisher Scientific	S233-3	F12 da Ham's
	VWR	60818-565	Tubos usados para FACS
UltraComp eBeads eBioscience		01-2222-42	Contas de compensação para calibração de fluxo Configurações de FACS