Nós apresentamos técnicas para isolar-se, cultivando, caracterizando, e diferenciando pilhas preliminares humanas do progenitor do músculo (hMPCs) obtidas do tecido esqueletal da biópsia do músculo. os hmpcs obtidos e caracterizados através destes métodos podem ser usados para abordar subseqüentemente as perguntas da pesquisa relativas à miogenesis humana e à regeneração do músculo esqueletal.
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Artigo de método
Isolamento, cultura, caracterização e diferenciação de células progenitoras do músculo humano do procedimento de biópsia do músculo esquelético
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O uso do tecido humano primário e das células é ideal para a investigação de processos biológicos e fisiológicos, como o processo regenerativo do músculo esquelético. Há desafios reconhecidos para trabalhar com células-tronco adultas primárias humanas, particularmente células progenitoras musculares humanas (hMPCs) derivadas de biópsias de músculo esquelético, incluindo a baixa produção de células de tecido coletado e um grande grau de heterogeneidade de doadores de parâmetros de crescimento e morte entre culturas. Ao incorporar a heterogeneidade no projeto experimental exige um tamanho de amostra maior para detectar efeitos significativos, igualmente permite que nós identifiquem os mecanismos que fundamentam a variabilidade na capacidade da expansão de hmpc, e permitem assim que nós compreendam melhor heterogeneidade na regeneração muscular esquelética. Novos mecanismos que distinguem a capacidade de expansão das culturas têm o potencial de levar ao desenvolvimento de terapias para melhorar a regeneração muscular esquelética.
Introdução
O músculo esquelético é o maior sistema de órgãos do corpo humano, representando 30 − 40% da massa corporal inteira1. Além do que seu papel bem reconhecido na locomoção, o músculo esqueletal mantem a temperatura e a postura de corpo, e joga um papel central na homeostase nutriente do corpo inteiro. Pesquisas envolvendo participantes humanos, animais e modelos de cultura celular são valiosas para abordar questões relacionadas à biologia e regeneração do músculo esquelético. A isolação e a cultura de pilhas preliminares humanas do progenitor do músculo (hMPCs) fornecem um modelo robusto que permita que as técnicas e as manipulações da cultura de ....
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Protocolo
Este protocolo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional da Universidade de Cornell. Todos os participantes foram rastreados por condições de saúde subjacentes e deram consentimento informado.
1. obtendo o tecido muscular humano através da biópsia do músculo esquelético
- Identifique o músculo vasto vasto lateral via palpação, marcos anatômicos e contração ativa do músculo.
- Palpar o vasto vasto lateral por ter o participante apertar o músculo quadríceps e encontrar a barriga do músculo, cerca de 1/3 do caminho da patela para o quadril, e apenas ventrolateral para o fêmur.
- Use uma fita de medição do pape....
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Resultados
Os resultados da citometria de fluxo representativo do isolamento do hMPC do tecido muscular humano podem ser visualizados na Figura 1. hMPCs pode ser identificado pela primeira gating eventos baseados em dispersão lateral e dispersão para a frente para eliminar células mortas ou detritos, seguido por selecionar apenas as células que são negativas para 7-AAD e, portanto, são viáveis. A seleção de células positivas para ambos os marcadores de superfície celula.......
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Discussão
Os hMPCs primários são um importante modelo de pesquisa usado para compreender a biologia do músculo esquelético e o processo regenerativo. Adicionalmente, os hMPCs têm o potencial ser usado para a terapia. Entretanto, há uns desafios reconhecidos em usar hMPCs preliminares para a pesquisa e a terapia, incluindo a compreensão limitada das pilhas derivadas dos seres humanos10. Há também um grande grau de variação na capacidade de expansão entre as culturas doadoras, o que limita o potencial de uso .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores agradecem à Universidade de Cornell, centro de recursos de biotecnologia Imaging Facility por sua ajuda com a triagem de células ativadas por fluorescência. Agradecemos também Molly Gheller por sua ajuda com o recrutamento participante e Erica Bender para a realização das biópsias de músculo esquelético. Por fim, agradecemos aos participantes pelo seu tempo e participação no estudo. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de envelhecimento dos institutos nacionais de saúde o prêmio número R01AG058630 (para B.D.C. e A.E.T.), por uma Fundação Glenn para pesquisa médica e Federação Americana para o envelhecimento Research Grant para a faculdade Júnio....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,25% Tripsina, 2,21 mM EDTA | Corning | 25-053-Cl | Tripsina utilizada para remover hMPCs aderentes de vasos de cultura de células |
| Placa de cultura de células de 10 cm | VWR | 664160 | Placas utilizadas para cultura hMPCs |
| Tubo Falcon | 352196 | 15 | mL utilizados em todos os protocolos de isolamento e cultura hMPC |
| Placa de cultura de células de 24 poços | Grenier Bio-One | 662 160 | Placas usadas para cultura hMPCs |
| Solução de Coloração de Viabilidade 7-AAD | eBioscience | 00-6993-50 | Coloração de viabilidade para identificação de células vivas durante a classificação FACS |
| Alexa Fluor 488 anti-humano CD29, Clone: TS2/16 | BioLegend | 303016 | Anticorpo conjugado para FACS |
| Placa de cultura de células preta de 96 poços | Grenier Bio-One | 655079 | placa de cultura de células de 96 poços ideal para imagens fluorescentes usando o citômetro de imagem de biociência Celigo |
| S Celigo S | Nexcelcom | usado para rastrear culturas hMPC | |
| Filtro de células | VWR | 352350 | Filtro de células para eliminar grandes pedaços de detritos durante o processamento da biópsia muscular |
| Colágeno Tipo I (Rato Cauda) | Corning | 354236 | Colágeno para revestimento de placas de cultura de células |
| Colagenase D | Roche | 11 088 882 001 | Usado para degradação de colágeno e outros tecidos conjuntivos no tecido de biópsia do músculo esquelético |
| Dimetilsulfóxido | VWR | WN182 | Usado para criopreservação de hMPCs |
| Dispase II | Sigma Life Sciences | D4693 | Uma protease usada para digestão enzimática do tecido |
| de biópsia do músculo esqueléticoDulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder | Gibco | 31600-034 | DMEM de baixa glicose para processamento de biópsia muscular |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 21600-010 | PBS para processamento de biópsia muscular |
| EDTA Dissodium Salt Dihydrate | J.T. Baker | 4040-01 | Necessário para buffer FACS |
| Soro Fetal | Bovino VWR | 89510-186 | Soro fetal bovino utilizado para meios de crescimento hMPC |
| Mídia base F12 | Gibco | 21700-026 | para hMPCs |
| Soro equino inativado por calor | Gibco | 26-050-070 | Soro de cavalo usado para fazer mídia de diferenciação hMPC |
| Hemocitômetro | iNCyto | DHC-N0105 | Usado para contar células |
| Hibernar A | Gibco | A1247501 | Mídia para preservar a biópsia do músculo esquelético tecido |
| Hoechst 33342, tricloridrato, trihidrato | Life Technologies | H21492 | Coloração de DNA para identificar todas as células usando o Celigo S |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P-4 | Usado para congelamento de taxa controlada de hMPCs |
| Tampão Moxi | Orflo | MXA006 | Tampão para contador de células automatizado |
| Moxi | Orflo | MXC002 | Cassesttes para contador de células automatizado |
| Moxi z Mini Contador de Células Automatizado | Orflo | Contador de células automatizado | |
| Mr. Frosty Recipiente de congelamento | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | Recipiente de congelamento de células de taxa controlada disponível comercialmente |
| Soro de cabra normal (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Soro de cabra usado no tampão |
| FACSPE-Cy7 Camundongo Anti-CD56 humano, Clone: B159 | BD Pharmingen | 557747 | Anticorpo conjugado para FACS |
| Penicilina/Estreptomicina 100x Solução | Corning | 30-002-CI | Antibióticos adicionados ao meio de cultura |
| Iodeto de propídio | Thermo Fisher Scientific | P3566 | Coloração de DNA para identificação de células mortas usando o |
| fator de crescimento de fibroblastos humanos recombinantes | Promega | G5071 | Suplemento em hMPC para evitar diferenciação espontânea |
| Meio de Congelamento de Cultura de Células de Recuperação | Gibco | 12648-010 | Mídia usada para crioperseve pastas de biópsia muscular |
| Bicarbonato de Sódio | Fisher Scientific | S233-3 | F12 da Ham's |
| VWR | 60818-565 | Tubos usados para FACS | |
| UltraComp eBeads eBioscience | 01-2222-42 | Contas de compensação para calibração de fluxo Configurações de FACS |
Referências
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- D'Souza, D. M., et al.
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Reimpressões e permissões
